鐘 新 ， 李軍生 *， 閻柳娟 ， 黃國霞

（1．廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州 545006；2．廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州 545006；3．廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州 545006）

氧化變構(gòu)制備大豆分離蛋白質(zhì)基表面活性劑

鐘 新1，2，3， 李軍生1，2，3*， 閻柳娟1，2，3， 黃國霞1，2，3

（1．廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州 545006；2．廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州 545006；3．廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州 545006）

本文通過控制性打開二硫鍵的方式，制備以大豆分離蛋白質(zhì)基表面活性劑。試驗(yàn)結(jié)果表明：隨著過氧乙酸量的增加，二硫鍵的打開率逐漸增加，當(dāng)二硫鍵斷開率為46%時，此條件下的γCMC，CMC值分別為53.12 mN/m，0.15 g/L，具有表面活性；HLB值為9，表明樣品的親油性較強(qiáng)；起泡性和起泡穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性都有一定的提高；圓二色譜以及熒光圖譜表明，不同程度的打開二硫鍵，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)由β型轉(zhuǎn)變?yōu)棣?β型，內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致疏水性能提高。

大豆分離蛋白；二硫鍵；表面活性；結(jié)構(gòu)

許多水溶性的高分子聚合物都具有兩性結(jié)構(gòu)（親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)），具有與傳統(tǒng)表面活性劑類似的性質(zhì)（Lin等，2016）。蛋白質(zhì)具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，因此展示了其特有的功能，例如水溶性、乳化性和乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性、凝膠性以及流變能力等。為了提高工業(yè)化的應(yīng)用，許多研究學(xué)者改善其功能特性以及其表面活性（Lin等，2010）。其中化學(xué)改性是改進(jìn)蛋白質(zhì)表面活性的有效方法之一，可以提高其乳化能力、起泡能力、降低表面張力等。

盧滇楠（2006）通過Langevin分子動力學(xué)模擬蛋白與表面活性劑在溶液中自組裝結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換微觀結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)表面活性劑的分子設(shè)計(jì)以及應(yīng)用有著重要的指導(dǎo)作用。吳丹（2006）通過總結(jié)光譜儀器在蛋白質(zhì)表面活性劑混合體系中的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，光譜技術(shù)可以研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，并且對蛋白質(zhì)以及表面活性劑的作用機(jī)理作了介紹。謝新華（2008）等研究表明，十二烷基磺酸鈉可降低稻米淀粉蛋白質(zhì)的含量。

大豆蛋白理論上應(yīng)該具有良好的表面活性性能，但其內(nèi)部存在大量的鏈間和鏈內(nèi)作用力，其中包括二硫鍵和氫鍵等，限制了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的伸展，另外，由于其自身的結(jié)構(gòu)，內(nèi)部的疏水基團(tuán)無法轉(zhuǎn)移至分子的表面，這也是制約蛋白質(zhì)表面活性的重要因素（Hudson等，2015）。因此，本文通過過氧乙酸氧化大豆分離蛋白斷開內(nèi)部的二硫鍵，改變分子內(nèi)的極性和非極性基團(tuán)的分布，進(jìn)一步提高大豆分離蛋白質(zhì)的表面活性，制備以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的表面活性劑。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)試劑 脫脂大豆粕，購自安陽得天力食品有限公司；金龍魚大豆調(diào)和油市售；過氧乙酸，西隴化工有限公司；還原性谷胱甘肽，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器 pH計(jì)（PHS-250W），上海般特儀器制造有限公司；高速冷凍離心機(jī)，J-26XPI Bechman Coulter；中型冷凍干燥機(jī)YFD2000，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；熒光分光光度計(jì)（RF-5301pc），日本島津；100XL型高剪切混合乳化頭，上海威宇機(jī)電制造有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（Cary-60，Agilent Technologies）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆分離蛋白質(zhì)的制備 粉粹機(jī)研磨，過80目篩。將所得的大豆粉按照重量體積比1∶10溶于去離子水，2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，在室溫下攪拌2 h，然后4000 r/min離心30 min，去掉沉淀，保留上清液并調(diào)節(jié)pH至4.8，再4000 r/min離心30 min，倒掉上清液，冷凍干燥，待用。

1.3.2 大豆分離蛋白質(zhì)的氧化 取1.25 g大豆分離蛋白粉溶于50 mL pH 2.2的磷酸緩沖溶液中，分別加入 0、0.1、0.2、0.5、0.7、0.9 mL 過氧乙酸，震蕩搖勻后置于-4℃黑暗反應(yīng)，過夜，得到所需的樣品并編號0～5待測。

1.3.3 大豆分離蛋白質(zhì)含量的測定 采用雙縮脲法（Kella，1986）測定蛋白質(zhì)的溶解度。待測蛋白質(zhì)的溶解度與雙縮脲以2∶3的比例混合，室溫下靜置30 min，紫外分光光度計(jì)在540 nm處測定吸光度值，以橫坐標(biāo)為吸光度，縱坐標(biāo)為酪蛋白質(zhì)濃度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品的蛋白質(zhì)濃度。測得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.6987x+0.0603（R2=0.9935）。

1.3.4 氧化大豆分離蛋白質(zhì)二硫鍵含量的測定采用 Elaimme（1959）法稍作修改。

溶液的配置：0.1%DTNB試劑：稱取100 mg DTNB，溶于100 mL pH 8.0的磷酸緩沖液中；0.1%NTSB試劑：稱取100 mg DTNB，溶于10 mL 1 mol/L的Na2SO3，再用pH 8.0磷酸緩沖液定容至100 mL。

利用谷胱甘肽做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以谷胱甘肽濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=0.3697x-0.0162（R2=0.9976）。

將所得的還原型谷胱甘肽的濃度轉(zhuǎn)換成巰基的濃度（mol/L），由于還原型谷胱甘肽的摩爾質(zhì)量為307.32 g/moL，所以最終所得：

測定游離巰基：取0.4 mL待測樣品加入0.4 mL DTNB試劑，用0.2 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液再定容至10 mL，以空白組作對照。測定412 nm處的吸光度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算公式計(jì)算可得游離巰基濃度，若測總巰基含量，只需將上述方法中的DTNB換為NTSB即可。

1.3.5 HLB值測定 取10 mL待測樣品，稀釋到100 mL，取5 mL進(jìn)行乳化。使用松節(jié)油（HLB值為16）和大豆油（HLB值為6），制備一系列的乳化體系（見表1）。5 mL樣品加100 g乳化劑，再加85 mL水，搖勻，24 h后記錄刻度管的乳化層高度，乳化層最高的，則為樣品的HLB值。

1.3.6 CMC測定 采用表面張力法測定表面活性劑的CMC值。表面活性劑隨著濃度的升高，表面張力越來越小，當(dāng)達(dá)到CMC值后，表面張力數(shù)值幾乎不變或者變化很小。試驗(yàn)采用以表面張力為縱坐標(biāo)，以濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖。取樣品0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5、2.0 mL 定 容 到50 mL，采用DT-102型自動界面張力儀測定。

表1 制備乳化體系 g

1.3.7 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定 采用Molina等（2001）的方法，取5 mL待測大豆分離蛋白質(zhì)氧化樣品，加5 mL大豆油于燒杯中，以10000 r/min的速度在高剪切混合頭下攪打1 min，分別在0、30 min后于燒杯底部取 20 μL樣品，與 5 mL 0.1%的SDS混合，利用紫外分光光度計(jì)在500 nm處，測定其吸光度值：

式中：T=2.303；N為蛋白質(zhì)稀釋倍數(shù)；c為待測樣品蛋白質(zhì)濃度，g/mL；φ為乳化液中油相所占體積分?jǐn)?shù)（0.5）；A0為 0min 的吸光度值；A30為 30min的吸光度值。

1.3.8 起泡性及起泡穩(wěn)定性的測定 取10 mL待測溶液定容至50 mL，用以10000 r/min的速度在高剪切混合頭下攪打1 min，將均質(zhì)后的溶液倒入100mL量筒中，記下0min時刻的泡沫體積V0，30min后記下泡沫體積V30，采用以下公式計(jì)算：

1.3.9 疏水性的測定 參照Kato等（2003）的方法。用ANS法測定氧化前后大豆分離蛋白表面疏水性的變化。取不同量的樣品加入20 μL 8 mmol/L的ANS試劑。用熒光光度計(jì)掃描待測樣品的熒光光譜。以樣品濃度對熒光強(qiáng)度作圖，曲線初始階段的斜率（H0）即為樣品的表面疏水指數(shù)。

1.3.10 熒光光譜的測定 以290 nm為激發(fā)波長，將樣品以4000 r/min離心10 min，取0.1 mL定容至10 mL，測定大豆分離蛋白質(zhì)各個樣品的內(nèi)源熒光，雙縮脲法測定樣品的蛋白質(zhì)含量。設(shè)定激發(fā)狹縫寬度：5 nm；發(fā)射狹縫寬度：3 nm；掃描范圍：300～420 nm；強(qiáng)度范圍：0～1000；掃速：中速。

1.3.11 圓二色譜分析 取樣品0.1 mL稀釋10倍，配置成濃度為10 μg/mL的蛋白質(zhì)溶液。室溫條件下，測定不同樣品的遠(yuǎn)紫外CD光譜圖。掃描速率：100 nm/min，掃描波段：190 ～ 250 nm，間隔時間：0.25 s，狹縫寬度：1.0 nm，最小間隔度：0.2 nm。以蒸餾水作為空白，掃描3次取平均值最終得到掃描CD光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 二硫鍵打開程度 過氧乙酸等氧化劑可以將蛋白質(zhì)中二硫鍵氧化成磺酸基團(tuán)，從而不可逆轉(zhuǎn)的斷開蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，從表2可以看出，隨著過氧乙酸濃度的增加二硫鍵的含量越來越少，即二硫鍵的打開程度越來越高。表明二硫鍵的斷開程度與氧化劑的濃度有很大的關(guān)系。二硫鍵的打開程度從46%增加到98.7%，隨著過氧乙酸濃度的增加大豆分離蛋白質(zhì)中的二硫鍵斷開程度迅速增加。過氧乙酸氧化處理可以使得大豆分離蛋白質(zhì)分子中游離巰基以及二硫鍵發(fā)生不可逆氧化。同時過量的氧化會造成蛋白質(zhì)分子中其他分子間作用力改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)無規(guī)律破壞。

表2 過氧乙酸對二硫鍵打開程度的影響

2.2 氧化大豆分離蛋白質(zhì)基表面活性劑的HLB值 HLB值是表面活性劑親水基與親油基大小和力量平衡效率的重要指標(biāo)，同時也是不同性質(zhì)及不同用途的重要參數(shù)。當(dāng)HLB值為3～6時可用作水-油乳化劑；為7～9時可作為潤濕劑；為8～15時可作為油-水乳化劑；為13～15時可作為洗滌劑；為15～18時可作為增溶劑 （鞏建平，2003）。當(dāng)HLB值越大時，親水性越高，親油性越低，反之相反。由圖1可知，未經(jīng)過改性的0號樣品的HLB值為14，通過不同程度的斷開二硫鍵，HLB 值依次為 9、11、11、14、13， 提高了大豆分離蛋白質(zhì)的親油性。

圖1 0～5號樣品的HLB值

2.3 氧化大豆分離蛋白質(zhì)基表面活性劑的表面張力及臨界膠束濃度 分子在溶液中達(dá)到某一臨界濃度時，就會形成膠體。溶液形成臨界膠束的濃度為臨界膠束濃度（CMC），當(dāng)表面活性劑在溶液中達(dá)到CMC時，溶液的表面吸附值達(dá)到飽和，溶液內(nèi)部形成膠束，此時溶液的表面張力最低，因此CMC值可以作為表面活性劑的一種度量和表面活性劑溶液性質(zhì)發(fā)生顯著變化的一個轉(zhuǎn)折點(diǎn)，因此CMC值對表面活性劑有著重要的研究價值（張佳程，2007）。由表3可知，氧化之后的大豆分離蛋白質(zhì)形成臨界膠束的濃度明顯降低，說明氧化可以降低大豆分離蛋白質(zhì)的表面張力，提升分離蛋白質(zhì)溶液在空氣界面形成膠束的能力，從而提高大豆分離蛋白質(zhì)的表面活性。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是，蛋白質(zhì)屬于柔性分子，氧化斷開二硫鍵之后，蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)被打開，變得松散，分子的親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)重新排列，從而使氧化大豆分離蛋白質(zhì)具有明顯的表面活性特征。合適的氧化有利于提高大豆分離蛋白質(zhì)的表面活性，過度的氧化會使得蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，亞基在水溶液中相互作用再次折疊，從而使得表面活性下降。

表3 0～5號樣品的CMC值

2.4 氧化大豆分離蛋白質(zhì)基表面活性劑的起泡性及起泡穩(wěn)定性 未加入過氧乙酸時大豆分離蛋白質(zhì)起泡性為51.2%，氣泡穩(wěn)定性為60%。由圖2可知，隨著二硫鍵打開程度的增加，起泡性隨之增加，主要是因?yàn)殡S著氧化程度的增強(qiáng)蛋白質(zhì)中二硫鍵與游離巰基發(fā)生轉(zhuǎn)移，蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊、重組裝等導(dǎo)致分子中疏水基團(tuán)之間的相互作用增強(qiáng)（Hu等，2009），二硫鍵被大部分?jǐn)嚅_后蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)在溶液狀態(tài)時親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)比例接近平衡，蛋白質(zhì)分子在溶液表面的定向排列更加有序，所以大豆分離蛋白質(zhì)的起泡性能提高。氧化強(qiáng)度過強(qiáng)時蛋白質(zhì)分子分解為各種亞基組分，從而增大了蛋白質(zhì)在溶液中分子數(shù)目，較小的亞基也較易在水中定向排列，從而泡沫穩(wěn)定性增加，但由于亞基在水溶液狀態(tài)會受到疏水相互作用，從而使得部分疏水基團(tuán)包埋，所以過度氧化，穩(wěn)定性呈現(xiàn)下降的趨勢。

圖2 氧化大豆分離蛋白質(zhì)基表面活性劑的起泡性及起泡穩(wěn)定性

2.5 氧化大豆分離蛋白質(zhì)基表面活性劑的乳化性及乳化穩(wěn)定性 由圖3可知，打開二硫鍵之后，大豆分離蛋白質(zhì)的乳化性以及乳化穩(wěn)定性都有很大程度上的提高。并且暴露出更多的非極性基團(tuán)，表現(xiàn)出了親油性，使得大豆分離蛋白表面活性劑易溶于油相體系中，使油乳化，隨著氧化強(qiáng)度的增強(qiáng)二硫鍵被不可逆轉(zhuǎn)的斷開，游離的巰基被氧化成磺酸基團(tuán)，蛋白質(zhì)分子中各亞基之間的作用力減弱，蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)被破壞，乳化性以及乳化穩(wěn)定性提高。

圖3 氧化大豆分離蛋白質(zhì)基表面活性劑的乳化性及乳化穩(wěn)定性

2.6 氧化大豆分離蛋白質(zhì)基表面活性劑的疏水性 蛋白質(zhì)表面的疏水性能直接反映分子表面非極性基團(tuán)的含量，是評價蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化的重要指標(biāo)。同時疏水性的大小與蛋白質(zhì)表面活性有著重要的關(guān)系。由圖4可知，天然的大豆分離蛋白質(zhì)的表面疏水性為1.49，1號樣品的表面疏水性能為2.46，之后隨著過氧乙酸濃度的增加，疏水性出現(xiàn)先增高后降低的趨勢，這是由于二硫鍵被氧化后使得內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露在分子表面，這也是大豆分離蛋白質(zhì)性能提高的重要原因之一。隨著二硫鍵打開的進(jìn)一步提高，大豆分離蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，因此表面疏水性下降。

圖4 氧化大豆分離蛋白質(zhì)基表面活性劑的疏水性

2.7 熒光光譜圖 通過分析290 nm處色氨酸的發(fā)色情況，通過分析色氨酸被激發(fā)后產(chǎn)生的圖譜信息，可以了解過氧乙酸對大豆分離蛋白質(zhì)的氧化情況。由圖5可知，天然的大豆分離蛋白質(zhì)在336 nm處熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，而經(jīng)過氧化后的大豆分離蛋白質(zhì)最大吸收峰發(fā)生了紅移，位于341 nm附近，說明蛋白質(zhì)分子所處的極性環(huán)境發(fā)生了改變。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子發(fā)生去折疊時，極性分子所處的環(huán)境發(fā)生變化（Wei等，2009），導(dǎo)致最高吸收峰發(fā)生了變化。1號樣品的峰高最強(qiáng)，發(fā)生位移的程度也最大，說明所具有的的疏水性程度最高，隨著過氧乙酸量的增加，最大吸收峰逐漸變小，可能是由于蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，使得發(fā)色基團(tuán)從蛋白質(zhì)分子的外部遷移到蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部，氧化程度的加深，破壞了蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)。

圖5 熒光光譜圖

2.8 圓二色譜圖 蛋白質(zhì)分子中二級結(jié)構(gòu)基團(tuán)（α-螺旋、β轉(zhuǎn)角、β-折疊及無規(guī)卷曲）相對含量的改變可以反映出蛋白質(zhì)分子三級結(jié)構(gòu)的變化。采用遠(yuǎn)紫外圓二色譜測定各組樣品三級構(gòu)象的變化趨勢。由圖6可知，0號樣品在185～195 nm出現(xiàn)正峰，在197～200 nm出現(xiàn)負(fù)峰，對比Manavalan等（1983）所作的特征CD光譜圖發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的大豆分離蛋白質(zhì)屬于β型蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)中以β-折疊為主，疏水基團(tuán)被包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部。經(jīng)過氧化的大豆分離蛋白質(zhì)，正峰出現(xiàn)藍(lán)移，正峰出現(xiàn)在190 nm附近，負(fù)峰出現(xiàn)藍(lán)移出現(xiàn)在195 nm附近，且正峰、負(fù)峰均出現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢，對比Manavalan等（1983）所作的特征 CD光譜圖可知，經(jīng)過處理之后蛋白質(zhì)分子由β型蛋白質(zhì)向α+β型蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化，α螺旋增加，另外在α+β型蛋白質(zhì)中折疊鏈60%以上均成反平行排列，這也說明經(jīng)過氧化處理大豆分離蛋白的三級結(jié)構(gòu)逐漸伸展，整體分子結(jié)構(gòu)松散，柔性增加。通過以上分析可以得出，氧化大豆分離蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)更加疏松，內(nèi)部疏水性基團(tuán)暴露在分子表面，從而有效提高大豆分離蛋白質(zhì)的表面活性性能。

圖6 圓二色譜圖

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，天然的大豆分離蛋白質(zhì)并沒有很好的表面活性劑性能，但是通過控制性的打開二硫鍵，內(nèi)部的疏水基團(tuán)被暴露在分子表面，提升了乳化性能以及起泡性能，有效降低了其表面張力，形成了一個良好的蛋白質(zhì)基表面活性劑。

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In this paper，a soybean-isolated protein-based surfactant was prepared by controlling the opening of disulfide bonds.The results showed that with the increase of the amount of peracetic acid，the opening rate of disulfide bond gradually increased.When the disulfide bond breaking rate was 46%，the γCMCwas 53.12 mN/m and the CMC value was 0.15 g/L，there were surface activity.The HLB value was 9，indicating that the sample of strong lipophilic；foaming and foaming stability，emulsifying and emulsifying stability have improved.Circular dichroism and fluorescence patterns showed that varying degrees of open disulfide bond，the structure of the protein changes from type β to α + β，the internal hydrophobic groups were exposed，resulting in hydrophobicity improved.

soybean protein isolate；disulfide bond；surface activity；structure

S816.9

A

1004-3314（2017）20-0023-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172006

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21466006）；廣西高等學(xué)校高水平創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及卓越學(xué)者計(jì)劃[桂教人（2014）7號]

*通訊作者