黃瑩捷，伍夢(mèng)瑤，姚燕妮，黃友誼*

（園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院茶學(xué)系，湖北 武漢 430000）

不同反應(yīng)條件對(duì)勐庫(kù)大葉種多酚氧化酶合成茶黃素的影響

黃瑩捷，伍夢(mèng)瑤，姚燕妮，黃友誼*

（園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院茶學(xué)系，湖北 武漢 430000）

研究不同因素對(duì)勐庫(kù)大葉種多酚氧化酶催化合成茶黃素的影響，結(jié)果表明在pH 4.0、37 ℃、茶多酚質(zhì)量濃度為4.5 mg/m L的條件下，勐庫(kù)大葉種多酚氧化酶催化1.0 h，最有利于茶黃素的合成，其總產(chǎn)量可達(dá)（461.12±15.01）μg/m L，轉(zhuǎn)化率為（15.31±0.40）%。勐庫(kù)大葉種多酚氧化酶對(duì)酯型兒茶素催化活性更強(qiáng)，催化合成酯型茶黃素為主，在催化過(guò)程中還伴隨著表沒(méi)食子兒茶素和沒(méi)食子酸的生成，有利于茶黃素的合成積累，這可能與滇紅優(yōu)異品質(zhì)形成有關(guān)。

勐庫(kù)大葉種；多酚氧化酶；茶黃素；兒茶素

茶黃素類化合物（theaflavins，TFs）雖僅占紅茶總固形物的1%～5%，卻是紅茶重要的品質(zhì)成分[1]。TFs還具抗氧化[2]、抗癌[3]、抑制血糖升高[4]、延緩糖尿病[5]等多種保健功能，被譽(yù)為茶葉中的“軟黃金”。因提取紅茶中的TFs成本高，以多酚氧化酶（po lypheno l oxidase，PPO）體外氧化制備TFs是實(shí)現(xiàn)其規(guī)?；a(chǎn)的有效途徑。吳紅梅[6]比較了茶葉、梨等不同來(lái)源PPO制取TFs的效果，龔志華[7]研究了不同茶樹品種PPO對(duì)體外酶促合成TFs的效果，谷記平[8]、鮮殊[9]、周潔[10]等對(duì)蘋云、安徽七號(hào)、福鼎大白的PPO粗酶體外酶促合成TFs的條件進(jìn)行了優(yōu)化，此外還有利用香蕉[11]、山藥[12]、毛栓菌[13]以及菌菇[14]等植物或微生物的PPO粗酶制備TFs。已有研究結(jié)果表明，以茶源PPO合成TFs的效果最佳[6]，而TFs產(chǎn)量及其各單體比例因茶樹品種不同而異[7]。云南大葉種生產(chǎn)的滇紅在國(guó)內(nèi)品質(zhì)最好，TFs含量高，然而卻缺乏云南大葉種PPO的相關(guān)研究。為此選用云南大葉種的代表性品種勐庫(kù)大葉種為材料，以成本遠(yuǎn)低于兒茶素單體的茶多酚提取物為底物，分析不同條件對(duì)其PPO合成TFs的影響，為闡明滇紅品質(zhì)形成機(jī)理和規(guī)?；苽銽Fs奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

春夏季于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶園基地采摘勐庫(kù)大葉種一芽二葉，于-80 ℃超低溫冰箱保存。

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、磷酸氫二鈉、檸檬酸、鄰苯二酚、乙二胺四乙酸二鈉、冰醋酸等（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國(guó)Fisher公司；反應(yīng)底物茶多酚 上海源葉生物科技有限公司，其組成如表1所示。

表1 茶多酚中兒茶素組分及酚酸的含量Tab le 1 Contents of catechins components and phenolic acids in tea polyphenols%

1.2 儀器與設(shè)備

FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀 基因科技（上海）股份有限公司；M ach 1.6R高速冷凍離心機(jī) 武漢赤誠(chéng)生物技術(shù)有限公司；TS-200B恒溫?fù)u床 上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；1260高效液相色譜儀、TC-C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，0.45 μm） 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 PPO的提取與活性測(cè)定

取勐庫(kù)大葉種一芽二葉20 g，按料液比1∶3（g/m L）加入預(yù)冷的檸檬酸-磷酸緩沖液（0.1 m o l/L，pH 7.2）、5 g/100 m L PVP、適量海砂，冰浴研磨，4 ℃浸提12 h后，4 ℃、9 000 r/m in離心35 m in，過(guò)濾，濾液即為勐庫(kù)大葉種PPO粗酶（簡(jiǎn)稱為勐庫(kù)大葉種PPO）。

PPO活性的測(cè)定方法采用改進(jìn)黃意歡[15]的方法：取10 μL酶液，加入50 μL檸檬酸-磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 5.6）、75 μL底物混合液（V（0.1 mo l/L，pH 5.6檸檬酸-磷酸緩沖液）∶V（0.1 g/100 m L脯氨酸）∶V（1 g/100 m L鄰苯二酚）=10∶2∶3，現(xiàn)配現(xiàn)用），于37 ℃水浴反應(yīng)30 m in，立即加入50 μL尿素（6 m o l/L），于多功能酶標(biāo)儀410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。空白對(duì)照的待測(cè)樣品以失活酶液代替。在本實(shí)驗(yàn)測(cè)定條件下，以鄰苯二酚反應(yīng)液的吸光度每分鐘增加0.001定義為1個(gè)酶活力單位（U）。以檸檬酸-磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.2）稀釋勐庫(kù)大葉種PPO至酶活力單位為1 500 U/m L（實(shí)測(cè)為（1 497.78±24.57）U/m L），用于催化合成TFs實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 pH值對(duì)TFs合成的影響

配制pH值為3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4系列檸檬酸-磷酸緩沖液（0.1 m o l/L）。取30 μL酶液于5 m L加蓋離心管中，加入270 μL反應(yīng)液（V（0.1 mol/L檸檬酸-磷酸緩沖液）∶V（60 mg/m L茶多酚）=26∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用），使反應(yīng)終體系底物質(zhì)量濃度為2 mg/m L。將Sharma等[16]TFs合成方法進(jìn)行改進(jìn)，具體方法如下：37 ℃、130 r/m in搖床振蕩反應(yīng)1 h，立即沸水浴5 m in終止反應(yīng)，以2 400 r/m in離心5 m in，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾于2 m L進(jìn)樣瓶，于-80 ℃保存待測(cè)?？瞻讓?duì)照的待測(cè)樣品以失活酶液代替。

1.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)TFs合成的影響

以1.3.2節(jié)獲得的最適pH值配制反應(yīng)液，設(shè)置反應(yīng)溫度為20、30、35、37、40、50 ℃，搖床預(yù)熱30 m in后開始酶促反應(yīng)，其他處理同1.3.2節(jié)，比較反應(yīng)溫度對(duì)勐庫(kù)大葉種PPO合成TFs的影響。

1.3.4 底物質(zhì)量濃度對(duì)TFs合成的影響

以1.3.2節(jié)獲得的最適pH值分別配制不同底物質(zhì)量濃度的反應(yīng)液，使反應(yīng)體系的茶多酚終質(zhì)量濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/m L。在1.3.3節(jié)確定的最適反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，其他處理同1.3.2節(jié)。

1.3.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)TFs合成的影響

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在最適pH值、最適溫度以及最適底物質(zhì)量濃度條件下，酶促反應(yīng)時(shí)間分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，其他處理同1.3.2節(jié)。0 h實(shí)驗(yàn)樣品以沸水浴10 m in滅活酶樣代替，其他處理相同。

1.3.6 TFs含量的測(cè)定

參照GB/T 30483—2013《茶葉中茶黃素的測(cè)定 高效液相色譜法》[17]，以高效液相色譜（h igh performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定TFs含量。流動(dòng)相A為90 m L乙腈，20 m L冰乙酸，2 m L（10 m g/m L）乙二胺四乙酸二鈉，超純水定容至1 L。流動(dòng)相B為800 m L乙腈，20 m L冰乙酸，2 m L（10 mg/m L）乙二胺四乙酸二鈉，超純水定容至1 L。使用TC-C18色譜柱進(jìn)行TFs的HPLC分析，流動(dòng)相A、B梯度洗脫，洗脫梯度見表2，流速0.7 m L/m in，柱溫35 ℃，278 nm波長(zhǎng)檢測(cè)，進(jìn)樣量5 μL。

表2 茶黃素HPLC洗脫梯度Tab le 2 HPLC elution gradients for theafl avins

1.3.7 兒茶素含量的測(cè)定

采用HPLC法檢測(cè)兒茶素，色譜柱為TC-C18色譜柱，流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液（溶劑為超純水），流動(dòng)相B為0.1%甲酸（溶劑為甲醇）。流動(dòng)相A、B梯度洗脫，具體洗脫梯度見表3，流速1.0 m L/m in，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，進(jìn)樣量5 μL。

表3 兒茶素HPLC洗脫梯度Table 3 HPLC elution gradients for catechins

1.3.8 合成TFs最優(yōu)條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)以上單因素試驗(yàn)中所得的最優(yōu)條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證所得結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，并計(jì)算TFs的轉(zhuǎn)化率，公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用Excel 2003和統(tǒng)計(jì)軟件SAS軟件包進(jìn)行方差分析和顯著性比較。所有數(shù)據(jù)均以s（2 次重復(fù)）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)勐庫(kù)大葉種PPO合成TFs的影響

由圖1可知，以茶多酚為底物，在不同p H值條件下，勐庫(kù)大葉種PPO催化合成的TFs以及4 種TFs單體具有相同的變化趨勢(shì)，且其中以酯型茶黃素為主，茶黃素-3,3’-雙沒(méi)食子酸酯（theaflavin-3,3’-gallate，TFDG）的產(chǎn)量最高，茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯（theaflavin-3-gallate，TF-3-G）次之，茶黃素-3’-沒(méi)食子酸酯（theaflavin-3’-gallate，TF-3’-G）與茶黃素（theaflavin，TF）的合成量較為接近。pH值低于或高于4.0，勐庫(kù)大葉種PPO催化合成的TFs產(chǎn)量均較低；尤其是在pH 5.6～6.4之間，催化后的TFs含量極低甚至檢測(cè)不出，表明勐庫(kù)大葉種PPO的TFs合成能力在pH更為偏酸的條件下較強(qiáng)。由此可見，勐庫(kù)大葉種PPO合成TFs的最適pH值為4.0，這與福鼎大白鮮葉勻漿懸浮發(fā)酵體系在pH 4.0條件下的TFs產(chǎn)量最高的結(jié)果一致[18]，但低于蘋云（pH 4.8）[8]、福鼎大白（pH 5.0）[10]以及政和大白（pH 5.2）[19]等茶樹品種的PPO粗酶，這可能與茶樹品種、提取方法、緩沖液體系等因素有關(guān)[20]。

圖1 pH值對(duì)勐庫(kù)大葉種PPO合成茶黃素含量的影響Fig. 1 Effect of pH on the synthesis of theafl avins

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)勐庫(kù)大葉種PPO合成TFs的影響

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)勐庫(kù)大葉種PPO合成茶黃素含量的影響Fig. 2 The theaflavins content synthesized by C. sinensis var. assamica cv. M engku crude PPO under different tem peratures

由圖2可知，在20～37 ℃范圍內(nèi)，雖然勐庫(kù)大葉種PPO合成的TFs及其各組分含量緩慢增加，但TFs以及TF、TF-3-G、TF-3’-G各自產(chǎn)量間沒(méi)有顯著差異，而TFDG在37 ℃產(chǎn)量最多，且與20、30、35 ℃條件下的合成量差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)37 ℃時(shí)，TFs及其各單體含量開始逐步降低。由此可見，勐庫(kù)大葉種PPO在30～40 ℃之間均具有較強(qiáng)的TFs合成能力，與蘋云（30 ℃）[8]、政和大白（35 ℃）[19]的茶樹PPO粗酶液催化合成TFs的最適溫度接近。但綜合考慮TFs和TFDG產(chǎn)量，勐庫(kù)大葉種PPO合成TFs的酶促反應(yīng)溫度以37 ℃為宜。此外，在不同溫度條件下，TFs的組成均以酯型茶黃素為主體，非酯型茶黃素含量較低，且其中以TFDG的產(chǎn)量最高，其次為TF-3-G。

2.3 底物質(zhì)量濃度對(duì)勐庫(kù)大葉種PPO合成TFs的影響

圖3 底物質(zhì)量濃度對(duì)勐庫(kù)大葉種PPO合成茶黃素含量的影響Fig. 3 Theaflavins content synthesized by C. sinensis var. assam ica cv.M engku crude PPO at different substrate concentrations

由圖3可知，隨著茶多酚底物質(zhì)量濃度的提高，勐庫(kù)大葉種PPO催化產(chǎn)生的TFs總量不斷增加，且在底物質(zhì)量濃度為4.5 mg/m L時(shí)達(dá)到最大值，之后略有降低。除TF-3’-G合成量隨底物質(zhì)量濃度的升高一直緩慢上升外，其他3 種TFs單體均表現(xiàn)出與TFs相同的變化趨勢(shì)。但各TFs單體所對(duì)應(yīng)的最適底物質(zhì)量濃度不同，TF、TF-3-G、TFDG和TF-3’-G分別在底物質(zhì)量濃度為4.5、3.5～4.5、4.5～5.0、5.0 mg/m L時(shí)含量最高。在4 種TFs單體中，TFDG含量最高，而TF的生成量最低，表明勐庫(kù)大葉種PPO可能具有較強(qiáng)的酯型茶黃素合成能力，且在TFDG合成方面表現(xiàn)的尤為明顯。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)勐庫(kù)大葉種PPO合成TFs的影響

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)勐庫(kù)大葉種PPO合成茶黃素含量的影響Fig. 4 Theaflavins content synthesized by C. sinensis var. assam ica cv.M engku crude PPO for different periods of reaction time

如圖4所示，TFs含量在反應(yīng)時(shí)間1.5 h達(dá)到最大值，但與1.0、2.0 h條件下的TFs產(chǎn)量間無(wú)顯著差異，可見勐庫(kù)大葉種PPO催化合成TFs的最佳反應(yīng)時(shí)間以1.0 h為宜。在反應(yīng)1.0 h內(nèi)是TFs合成的上升期，各單體均快速形成；在1.5～2.5 h，勐庫(kù)大葉種PPO催化合成TFs進(jìn)入到穩(wěn)定階段，反應(yīng)混合液中TFs各單體維持較高的含量；隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至4.0 h，TFs及其各單體含量開始下降，且以2.5～3.0 h下降幅度最大，而后下降速度又趨于平緩。

2.5 勐庫(kù)大葉種PPO催化合成TFs中兒茶素組成的變化及相關(guān)性

勐庫(kù)大葉種PPO催化反應(yīng)4.0 h過(guò)程中，主要兒茶素單體以及沒(méi)食子酸含量的動(dòng)態(tài)變化如圖5所示。由圖5A可知，勐庫(kù)大葉種PPO對(duì)EC的催化氧化相對(duì)緩慢，反應(yīng)1.0 h后仍有約75%的EC未被利用；而EGCG、ECG被大量氧化，各僅有近10%和20%的殘留?？梢娵聨?kù)大葉種PPO對(duì)不同兒茶素單體的選擇上具有偏好性，對(duì)酯型兒茶素的催化氧化能力明顯強(qiáng)于EC，從而使得TFDG成為其合成的TFs中最重要的單體。隨著反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，EGCG、ECG以及EC仍在緩慢下降。但至2.5 h時(shí)，反應(yīng)混合液中TFs及其各單體含量開始下降（圖4），表明此時(shí)TFs的降解速度快于合成，向不利于TFs積累的方向推進(jìn)。與EGCG、EC以及ECG不同，作為合成TFs底物之一的EGC，在反應(yīng)過(guò)程中其含量不但沒(méi)有因合成TF和TF-3’-G而減少，反而有所增加，且隨反應(yīng)時(shí)間呈現(xiàn)出先增加后減少再增加的復(fù)雜變化，且在反應(yīng)1 h后增幅最大，達(dá)到60%左右。另外，如圖5B所示，GA在勐庫(kù)大葉種PPO催化反應(yīng)最初的1.5 h內(nèi)也大量合成積累，這可能是由于勐庫(kù)大葉種PPO中含有酯型兒茶素水解酶，催化EGCG、ECG水解，從而導(dǎo)致EGC和GA含量的增加[21]；而在PPO催化EGCG氧化過(guò)程中，脫沒(méi)食子化和差向異構(gòu)化也可使其脫去沒(méi)食子基，這可能是造成EGC、GA含量增多的另一可能途徑[22]。

圖5 勐庫(kù)大葉種PPO催化過(guò)程中主要兒茶素單體（A）和沒(méi)食子酸含量（B）的變化Fig. 5 Major catechins components (A) and gallic acid contents (B) against time during C. sinensis var. assamica cv. Mengku crude PPO oxidation

表4 兒茶素單體與茶黃素產(chǎn)量的相關(guān)性Tab le 4 Correlation analysis between various catechin monomers and theafl avins yield

由表4可知，GA的消耗量與TFs及其4 種主要單體產(chǎn)量呈極顯著負(fù)相關(guān)，表明在形成TFs的同時(shí)，GA含量有所增多。而GC、EGCG、ECG以及CG的消耗量與TFs及其各單體產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)。除TF-3’-G外，EC的消耗量與TFs和其他3 種主要TFs單體產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)。GCG的消耗量與TF-3’-G產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)，而與TF、TF-3-G、TFDG以及TFs產(chǎn)量的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平。由此可見，GC、EGCG、GCG、ECG以及CG是勐庫(kù)大葉種PPO合成TFs的主要底物。

2.6 勐庫(kù)大葉種PPO催化合成茶黃素最優(yōu)條件的驗(yàn)證

通過(guò)單因素試驗(yàn)逐步優(yōu)化勐庫(kù)大葉種PPO催化合成TFs的條件，最終確定其最優(yōu)催化條件為pH 4.0、37 ℃、茶多酚質(zhì)量濃度為4.5 mg/m L的條件下，催化反應(yīng)1.0 h。最優(yōu)條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，TFs產(chǎn)量分別為468.12、443.89、471.34 μg/m L，變異系數(shù)為3.25%，平均值為（461.12±15.01）μg/m L，轉(zhuǎn)化率為（15.31±0.40）%，可見在所獲得的最優(yōu)條件下勐庫(kù)大葉種PPO催化TFs的效率高、重復(fù)性好。

3 討 論

3.1 TFs合成條件

發(fā)酵過(guò)程中的溫度、pH值、相對(duì)濕度以及時(shí)間控制在紅茶品質(zhì)形成中發(fā)揮至關(guān)重要作用，其中TFs的積累、消耗與反應(yīng)溫度密切相關(guān)，高溫在加速TFs形成的同時(shí)使其降解量也隨之增多[23-24]。因此，在紅茶生產(chǎn)中，發(fā)酵溫度宜控制在24～28 ℃范圍內(nèi)，葉溫30 ℃較好[25]。盡管如此，在紅茶發(fā)酵過(guò)程中由于放熱反應(yīng)導(dǎo)致的葉溫升高現(xiàn)象在所難免，葉溫會(huì)由發(fā)酵初期的25 ℃升高至結(jié)束時(shí)的35 ℃左右[26]。然而，勐庫(kù)大葉種PPO在25～37 ℃之間的TFs產(chǎn)量間無(wú)顯著差異，且具有逐漸增強(qiáng)的TFs合成能力，這可能是形成滇紅優(yōu)異品質(zhì)的一個(gè)重要原因。在滇紅的發(fā)酵過(guò)程中，如適當(dāng)降低發(fā)酵溫度和適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，有利于維持較高的TFs、茶紅素轉(zhuǎn)化率；另一方面如采用先高溫后低溫的變溫發(fā)酵方式，有利于減少后期的TFs降解。然而，應(yīng)該注意控制紅茶總體的發(fā)酵時(shí)間，如發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致TFs降解，直接降低紅茶品質(zhì)。

3.2 TFs合成底物

不同茶樹品種PPO在底物的選擇性和親和力方面差異明顯[27]。有研究表明，同樣適制紅茶的秀紅[7]在與本研究底物組成比例、反應(yīng)條件相近時(shí)，其PPO有利于催化EC和EGC合成TF。然而，與非酯型兒茶素相比，勐庫(kù)大葉種PPO可能對(duì)EGCG和ECG具有更強(qiáng)的親和力，而使得其產(chǎn)物中TFDG的含量遠(yuǎn)高于其他TFs單體。因此，在TFs制備上，利用勐庫(kù)大葉種PPO開發(fā)高純度的TFDG單體產(chǎn)品具有良好的前景。另外，茶樹鮮葉中酯型兒茶素含量高于非酯型兒茶素[28]，云南大葉種中酯型兒茶素含量和兒茶素總量均高于一般的茶樹品種，而勐庫(kù)大葉種PPO對(duì)酯型兒茶素的高親和性正好與之相適應(yīng)，這可能是滇紅品質(zhì)優(yōu)異的又一個(gè)重要原因。但TFs的合成不僅與PPO同工酶組成有關(guān)，還受兒茶素含量以及組成的影響[7,29]。由于本實(shí)驗(yàn)選用的底物為一種茶多酚提取物，還需對(duì)勐庫(kù)大葉種鮮葉中酯型兒茶素與非酯型兒茶素的比例，滇紅發(fā)酵過(guò)程中TFs單體產(chǎn)量及比例變化，以及其與適制紅茶的中小葉種之間的差異進(jìn)行深入研究。

3.3 TFs合成途徑

目前，TFs的合成前體以及合成途徑均已較為明確，兒茶素先經(jīng)酶或非酶氧化形成醌類物質(zhì)，而后兒茶素鄰醌與沒(méi)食子兒茶素鄰醌配對(duì)，進(jìn)行駢環(huán)反應(yīng)從而形成TFs[30-31]。作為合成TFs重要底物的EGC，其氧化電位是各兒茶素單體中最低的，因而極其容易被PPO氧化消耗而合成TFs[32-33]。但不同于以往研究的是，在勐庫(kù)大葉種PPO催化過(guò)程中，EGC含量并不隨著TFs的合成而減少，反而增加。EGC不僅是合成TFs的底物，而且有研究表明EGC可有效地阻止TFs的氧化降解[34]，從而在TFs積累方面發(fā)揮著重要作用。勐庫(kù)大葉種可能通過(guò)這種維持高EGC含量的獨(dú)特方式，促進(jìn)滇紅發(fā)酵過(guò)程中TFs的合成與積累，為其優(yōu)良品質(zhì)的形成奠定基礎(chǔ)。然而EGC形成過(guò)程，以及在TFs合成中的作用，還需要進(jìn)一步研究。

[1] 宛曉春. 茶葉生物化學(xué)[M]. 3版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2011: 30-31.

[2] 陳虎, 胡英, 周睿, 等. 茶黃素的抗氧化機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 茶葉科學(xué), 2005, 25(4): 237-241. DOI:10.13305/j.cnki.jts.2005.04.001.

[3] 江和源, 袁新躍, 王川丕, 等. 茶黃素雙沒(méi)食子酸酯的抗癌活性及其作用機(jī)理研究[J]. 茶葉科學(xué), 2007, 27(1): 33-38.DOI:10.3969/j.issn.1000-369X.2007.01.005.

[4] TAKEMOTO M, TAKEMOTO H, SAKURADA A. Synthesis of theaflavins w ith Camellia sinensis cell culture and inhibition of increase in blood sugar values in high-fat diet m ice subjected to sucrose or glucose loading[J]. Tetrahedron Letters, 2014, 55(36):5038-5040. DOI:10.1016/j.tetlet.2014.07.092.

[5] 李彩蓉, 蔡飛, 趙辛元, 等. 茶黃素對(duì)糖尿病大鼠腎小球系膜細(xì)胞p38絲裂原活化蛋白激酶及細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響[J]. 茶葉科學(xué),2009, 29(6): 470-474. DOI:10.13305/j.cnki.jts.2009.06.010.

[6] 吳紅梅. 多酚氧化酶酶源篩選及酶法制取茶色素研究[D]. 合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004: 2-32.

[7] 龔志華, 朱盛堯, 陳朵, 等. 不同茶樹品種多酚氧化酶體外酶促合成茶黃素研究[C]//湖南省茶葉學(xué)會(huì)2011年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集. 長(zhǎng)沙:湖南省茶葉學(xué)會(huì), 2011: 110-115.

[8] 谷記平, 劉仲華, 黃建安, 等. 酶性氧化合成茶黃素條件優(yōu)化的研究[J]. 茶葉科學(xué), 2006, 26(4): 285-290. DOI:10.3969/j.issn.1000-369X.2006.04.010.

[9] 鮮殊. 茶鮮葉勻漿懸浮發(fā)酵在高茶黃素含量茶色素制備中的應(yīng)用研究[D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012: 17-32.

[10] 周潔. 茶黃素酶促氧化合成條件的優(yōu)化[D]. 重慶: 西南大學(xué),2013: 16-25.

[11] JHOO J W, SANG S, WEI G J, et al. Enzymatic synthesis o f theaflavins and epitheaflavic acid from catechins and their antioxidant activity[J]. Journal of Food Lipids, 2004, 11: 89-103. DOI:10.1111/j.1745-4522.2004.tb00263.x.

[12] 蔣長(zhǎng)興, 焦云鵬, 熊清平, 等. 山藥氧化酶特性及茶黃素的合成[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(8): 277-280. DOI:10.3969/j.issn.1002-1302.2013.08.106.

[13] 李適. 微生物多酚氧化酶酶源篩選及其在茶黃素合成中的應(yīng)用[D].長(zhǎng)沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006: 37-38.

[14] 徐斌. 不同體系條件下聚酯型兒茶素的形成特性及其與茶黃素的競(jìng)爭(zhēng)性形成[D]. 杭州: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2015: 33-38.

[15] 黃意歡. 茶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1997: 142-143.

[16] SHARMA K, BARI S S, SINGH H P. Biotransformation of tea catechins into theaflavins w ith immobilized polyphenol oxidase[J]. Journal of M olecular Catalysis B: Enzymatic, 2009,56(4): 253-258. DOI:10.1016/j.molcatb.2008.05.016.

[17] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局, 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). 茶葉中茶黃素的測(cè)定 高效液相色譜法: GB/T 30483—2013[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2013: 1-4.

[18] 夏濤. 紅茶色素形成機(jī)理的研究[J]. 茶葉科學(xué), 1999, 19(2): 139-144.DOI:10.13305/j.cnki.jts.1999.02.011.

[19] 龔志華, 李徐, 朱盛堯, 等. 茶鮮葉酶促氧化合成茶黃素研究[J]. 食品與機(jī)械, 2012, 28(6): 59-62; 73. DOI:10.3969/j.issn.1003-5788.2012.06.014.

[20] YORUK R, MARSHALL M R. Physicochem ical properties and function of p lant polyphenol oxidase: a review[J]. Journal of Food Biochem istry, 2003, 27: 361-422. DOI:10.1111/j.1745-4514.2003.tb00289.x.

[21] 夏濤, 高麗萍, 韋朝領(lǐng), 等. 茶樹兒茶素生物合成研究進(jìn)展[C]//2009年中國(guó)茶葉科技創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)發(fā)展學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集. 杭州:中國(guó)茶葉學(xué)會(huì), 2009: 520-525.

[22] COGGON P, MOSS G A, GRAHAM H N, et al. The biochem istry of tea fermentation: oxidative degallation and epimerization of the tea fl avanol gallates[J]. Journal of Agricultural and Food Chem istry,1973, 21(4): 727-733. DOI:10.1021/jf60190a055.

[23] CLOUGHLEY J B. The effect of fermentation temperature on the quality parameters and price evaluation of Central A frican black teas[J]. Science of Food and Agriculture, 1980, 31: 911-919.DOI:0022-5142/80/0900-0911.

[24] SAMANTA T, CHEENI V, DAS S, et al. Assessing biochem ical changes du ring standard ization o f ferm en tation tim e and tem perature for m anu facturing quality b lack tea[J]. Journal o f Food Science and Techno logy, 2015, 52(4): 2387-2393.DOI:10.1007/s13197-013-1230-5.

[25] 俞露婷, 袁海波, 王偉偉, 等. 紅茶發(fā)酵過(guò)程生理生化變化及調(diào)控技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2015, 31(22): 263-269.

[26] BARUAH A M, MAHANTA P K. Fermentation characteristics of some Assam ica clones and process optim ization of black tea manufacturing[J]. Journal of Agricultural and Food Chem istry,2003, 51(22): 6578-6588. DOI:10.1021/jf030019w.

[27] 谷記平. 茶黃素酶促氧化制備技術(shù)的研究[D]. 長(zhǎng)沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004: 30-33.

[28] TANAKA T, MATSUO Y, KOUNO I. Chem istry of secondary polypheno ls p roduced during p rocessing o f tea and selected foods[J]. International Journal of M olecular Sciences, 2010, 11:14-40. DOI:10.3390/ijm s11010014.

[29] OWUOR P O, OBANDA M. The use of green tea (Camellia sinensis)leaf flavan-3-ol composition in predicting plain black tea quality potential[J]. Food Chem istry, 2007, 100(3): 873-884. DOI:10.1016/j.foodchem.2005.10.030.

[30] 江和源, 程啟坤, 杜琪珍, 等. 紅茶中的茶黃素[J]. 中國(guó)茶葉,1998, 3: 18-20.

[31] CO LL IER P D, BRYCE T, M A LLOW S R, e t a l. The theaflavins of black tea[J]. Tetrahedron, 1973, 29(1): 125-142.DOI:10.1016/S0040-4020(01)99386-X.

[32] STODT U W, BLAUTH N, NIEMANN S, et al. Investigation of processes in black tea manufacture through model fermentation(oxidation) experiments[J]. Journal of Agricultural and Food Chem istry, 2014, 62(31): 7854-7861. DOI:10.1021/jf501591j.

[33] 龔志華, 劉昆言, 劉林峰, 等. 紅條茶加工過(guò)程中茶黃素組分的動(dòng)態(tài)變化[J]. 茶葉通訊, 2016, 43(2): 19-23. DOI:10.3969/j.issn.1009-525X.2016.02.005.

[34] BA JA J K L, ANAN T, TSUSH IDA T, et a l. E f fec ts o f(-)-epicatechin on oxidation o f theaflavins by po lypheno l oxidase from tea leaves[J]. Agricultural and Biological Chem istry,1987, 51(7): 1767-1772. DOI:10.1080/00021369.1987.10868292.

Effects of Different Conditions on Theaflavins Synthesis by Polyphenol Oxidase of Camellia sinensis var. assamica cv. Mengku

HUANG Yingjie, WU Mengyao, YAO Yanni, HUANG Youyi*
(Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, M inistry of Education, Department of Tea Science,College of Horticulture and Forestry Science, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430000, China)

The effects of different factors on the synthesis of theaflavins from tea polyphenols by crude polyphenol oxidase (PPO) from the leaves of Camellia sinensis var. assamica cv. Mengku were analyzed. The results show ed that pH 4.0, temperature of 37 ℃, a substrate concentration of 4.5 mg/m L and a reaction time of 1 h were found to be optimum for the synthesis of theaflavins. Under these conditions, the product yield reached (461.12 ± 15.01) μg/m L and the conversion of substrate was (15.31 ± 0.40)%. Additionally, ester theaflavins were the major products of the crude PPO and EGC and GA were also generated during PPO oxidation, which benefited the synthesis and accumulation of theaflavins. These results may be related to the high quality of Dianhong black tea.

Camellia sinensis var. assamica cv. Mengku; polyphenol oxidase; theaflavins; catechins

10.7506/spkx1002-6630-201722009

S571.1

A

1002-6630（2017）22-0054-06

黃瑩捷, 伍夢(mèng)瑤, 姚燕妮, 等. 不同反應(yīng)條件對(duì)勐庫(kù)大葉種多酚氧化酶合成茶黃素的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22):54-59. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722009. http://www.spkx.net.cn

HUANG Yingjie, WU Mengyao, YAO Yanni, et al. Effects of different conditions on theaflavins synthesis by polyphenol oxidase of Camellia sinensis var. assamica cv. Mengku[J]. Food Science, 2017, 38(22): 54-59. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722009. http://www.spkx.net.cn

2016-10-08

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31270731）

黃瑩捷（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)椴枞~生物技術(shù)與加工。E-mail：hyj605791@163.com

*通信作者：黃友誼（1973—），男，教授，博士，研究方向?yàn)椴铇渖锛夹g(shù)與加工。E-mail：youyi@mail.hzau.edu.cn