李維妮，張宇翔，魏建平，袁亞宏，韓曉江，岳田利*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊陵 712100）

益生菌發(fā)酵蘋果汁工藝優(yōu)化及有機酸的變化

李維妮，張宇翔，魏建平，袁亞宏，韓曉江，岳田利*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊陵 712100）

以紅富士蘋果為原料，進行乳酸菌發(fā)酵蘋果汁工藝條件優(yōu)化并分析發(fā)酵期間蘋果汁有機酸的變化。選擇Lactobacillus paracasei 20241、Bifidobacterium animalis 6165、Streptococcus thermophilus 6063和Lactobacillus acidophilus 6005混合發(fā)酵蘋果汁，以活菌數(shù)和感官評分為主要指標(biāo)，在單因素試驗基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，研究不同的菌種比例、接種量、發(fā)酵時間等對蘋果汁活菌數(shù)和感官評分的影響。結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵蘋果汁的優(yōu)化工藝條件為菌種比例1∶1∶1∶1、接種量2%、發(fā)酵時間24 h、發(fā)酵溫度37 ℃，在此條件下得到的活菌數(shù)為1.985×108CFU/m L，感官評分為80.23 分。采用最佳工藝條件發(fā)酵蘋果汁，利用高效液相色譜法對發(fā)酵過程中蘋果汁有機酸的變化情況進行分析，結(jié)果表明：經(jīng)過發(fā)酵后，蘋果酸和琥珀酸含量下降明顯（P＜0.05），而乳酸、奎寧酸、檸檬酸、酒石酸、丙酮酸和莽草酸含量均顯著提高（P＜0.05）。

乳酸菌；蘋果汁；發(fā)酵；工藝優(yōu)化；有機酸

乳酸菌是一類可發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的細菌的統(tǒng)稱，在人體內(nèi)可幫助機體消化，是益生菌的重要組成部分。研究表明，食品中加入益生菌有益于健康，可提高免疫力，維持腸道微生態(tài)平衡和降低患癌風(fēng)險[1]。果蔬中所含糖類、無機鹽、維生素等均易被人體吸收，是重要的營養(yǎng)物質(zhì)[2]。

蘋果汁富含多種營養(yǎng)成分，其中，蘋果酸是最主要的有機酸，還有奎寧酸、莽草酸、檸檬酸和琥珀酸等[3]，是良好的生理堿性食品[4]。

目前，有許多國內(nèi)外學(xué)者對乳酸菌發(fā)酵果蔬汁進行研究。在工藝優(yōu)化方面，崔莉等[5]利用腸膜明串珠菌和植物乳桿菌按2∶1的比例混合后發(fā)酵黃秋葵汁后活菌數(shù)可達108CFU/m L，優(yōu)化工藝條件為接種量5%、發(fā)酵溫度35 ℃和發(fā)酵時間72 h。張曉等[6]利用植物乳桿菌、短乳桿菌和魯氏酵母混合發(fā)酵芹菜汁，通過優(yōu)化試驗得到最佳工藝條件為菌種比例2∶2∶1、接種量7%和發(fā)酵溫度30 ℃，此條件下乳酸菌活菌數(shù)可達1.78×108CFU/m L。王凱旋等[7]利用乳酸菌LAB-5發(fā)酵桑葚汁，以乳酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，確定的最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間6.85 h、發(fā)酵溫度35 ℃和接種量3.13%，有效提升了乳酸產(chǎn)量。劉磊等[8]采用梯度濃度馴化法將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌以1∶1的比例接入龍眼汁中，經(jīng)響應(yīng)面法得到最佳工藝條件為發(fā)酵時間12 h、發(fā)酵溫度45 ℃、接種量3%和脫脂奶粉添加量5%，有效提升了龍眼汁的酸度，并且使得其揮發(fā)性風(fēng)味植物發(fā)生顯著變化。在有機酸方面，Herrero等[9]研究2 種不同溫度下酵母菌和蘋果酸乳酸菌混合發(fā)酵蘋果汁，受到溫度的影響，蘋果酸在發(fā)酵過程中被完全代謝，且在蘋果酸下降結(jié)束后乳酸也開始下降，而乙酸則大量生成。Leila等[10]將酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵蘋果酒，當(dāng)酵母衰亡后，乳酸菌活菌數(shù)達到最大，在酒精發(fā)酵階段蘋果酸被完全消耗，而乳酸發(fā)酵過程中一直有乳酸生成。

由于我國對果蔬的加工利用率低，造成了極大浪費，而果蔬發(fā)酵飲料則為果蔬資源的加工利用提供了一條有效的解決途徑[11]。乳酸菌進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，不僅賦予果蔬汁更好的發(fā)酵風(fēng)味，而且使果蔬汁具有能調(diào)節(jié)人體腸道微環(huán)境的功效，并提高礦質(zhì)元素的吸收利用，增強免疫力等[12-13]。相關(guān)研究表明，通過乳酸菌發(fā)酵果蔬汁可產(chǎn)生一些功能性物質(zhì)，如與抗氧化作用密切相關(guān)的多酚類化合物[14-15]、含量極低且不可缺少的維生素[16]等。目前，各種果蔬汁和果酒不斷涌現(xiàn)，果蔬發(fā)酵汁已由單一原料、單一發(fā)酵劑發(fā)展至現(xiàn)在的多種原料、多種復(fù)合發(fā)酵劑[17]，多菌協(xié)同發(fā)酵能夠賦予果蔬汁更優(yōu)的風(fēng)味和口感。但所選菌種數(shù)較少，范圍較窄，多為單菌發(fā)酵或雙菌發(fā)酵，且在國內(nèi)外，在乳酸菌發(fā)酵過程中對有機酸進行具體分析方面的報道很少。

本實驗以紅富士蘋果為主要原料，利用副干酪乳桿菌、動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌協(xié)同發(fā)酵蘋果汁，研究不同菌種比例、接種量和發(fā)酵時間對蘋果汁活菌數(shù)和感官評分的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，并對蘋果汁中的有機酸進行動態(tài)監(jiān)測。旨在研制出一種富含能夠調(diào)節(jié)人體腸道功能的乳酸菌蘋果汁，不僅拓寬了對乳酸菌的選擇，還優(yōu)化了發(fā)酵工藝條件并分析出有機酸的具體變化，為乳酸菌在發(fā)酵果蔬汁方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士蘋果（Malus pumila M ill.）購于陜西楊凌，9月中下旬采摘，大小均一，無機械損傷，無病害或腐爛。

副干酪乳桿菌20241（Lactobacillus paracasei）、動物雙歧桿菌6165（Bifidobacterium animalis）、嗜熱鏈球菌6063（Streptococcus thermophilus）、嗜酸乳桿菌6005（Lactobacillus acidophilus），保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品發(fā)酵工程與食品安全實驗室。

MRS肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；有機酸標(biāo)準(zhǔn)品蘋果酸、乳酸、檸檬酸，莽草酸、奎寧酸、丙酮酸、琥珀酸、酒石酸（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；磷酸銨、磷酸（均為色譜純）美國Sigma-Aldrich公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2000JP-1型離心果汁機 南通金橙機械有限公司；YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HC-3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；YT-CJ-2ND型超凈工作臺北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；HWS-80型智能恒溫恒濕箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；超純水機 上海優(yōu)普實業(yè)有限公司；LC-15C高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果汁的制備

挑選→清洗→去核→切塊→榨汁→護色→酶解→抽濾→調(diào)酸→-20 ℃冷凍待用

1.3.2 蘋果汁的發(fā)酵

將保存于甘油管的4 株乳酸菌分別置于MRS液體培養(yǎng)基中進行活化，于37 ℃無菌環(huán)境下靜置培養(yǎng)24 h。再分別接種于100 m L蘋果汁種子液中，于37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，活菌數(shù)約達1×107CFU/m L，將副干酪乳桿菌20241、動物雙歧桿菌6165、嗜熱鏈球菌6063和嗜酸乳桿菌6005 4株菌分別按照不同的配比方式，以不同的接種量接種于500 m L蘋果汁中，于37 ℃靜置發(fā)酵不同時間，發(fā)酵結(jié)束后置于-20 ℃冰箱下保存待用。

1.3.3 蘋果汁活菌數(shù)測定和感官評定

活菌數(shù)按傾注平板法計數(shù)[18]。為了評價不同的發(fā)酵方式對蘋果汁感官品質(zhì)的影響，由20 名專業(yè)的老師和學(xué)生組成感官評定小組，從色澤、體態(tài)、香氣和口感4 個方面對各個蘋果汁樣品進行評分。評分細則如表1所示。

表1 感官評分細則Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented app le juice

1.3.4 乳酸菌發(fā)酵蘋果汁工藝條件的單因素試驗設(shè)計

1.3.4.1 發(fā)酵溫度的確定

經(jīng)處理的蘋果汁，初始糖度為14.03 °Brix，pH值為5.85，將副干酪乳桿菌、動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌按照1∶1∶1∶1的菌種比例接入蘋果汁中，接種量為3%，分別在31、33、35、37、39、41 ℃發(fā)酵26 h，比較各蘋果汁的活菌數(shù)和感官評分。

1.3.4.2 菌種比例的確定

經(jīng)處理的蘋果汁，初始糖度為14.03 °Brix，pH值為5.85，分別將副干酪乳桿菌、動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌按照1∶2∶1∶2、2∶2∶1∶1、1∶1∶1∶1、1∶1∶2∶2、2∶1∶2∶1、1∶2∶2∶1的菌種比例接入蘋果汁中，接種量為3%，37 ℃發(fā)酵26 h，比較各蘋果汁的活菌數(shù)和感官評分。

1.3.4.3 接種量的確定

經(jīng)處理的蘋果汁，初始糖度為14.03 °Brix，pH值為5.85，將副干酪乳桿菌、動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌按照1∶1∶1∶1的菌種比例接入蘋果汁中，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，37 ℃發(fā)酵26 h，比較各蘋果汁的活菌數(shù)和感官評分。

1.3.4.4 發(fā)酵時間的確定

經(jīng)處理的蘋果汁，初始糖度為14.03 °Brix，pH值為5.85，將副干酪乳桿菌、動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌按照1∶1∶1∶1的菌種比例接入蘋果汁中，接種量為3%，在37 ℃分別發(fā)酵21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 h，比較各蘋果汁的活菌數(shù)和感官評分。

1.3.5 乳酸菌發(fā)酵蘋果汁的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗（center combination design，CCD）設(shè)計方法，選擇菌種比例、接種量和發(fā)酵時間這3個影響較大的因素，設(shè)計三因素五水平響應(yīng)面試驗，以活菌數(shù)和感官評分為響應(yīng)值進行優(yōu)化。兩個響應(yīng)值所占權(quán)重各為50%。試驗設(shè)計見表2。

表2 CCD試驗因素與水平Table 2 Factors and their levels used for central com posite design

1.3.6 有機酸測定

參照Y E M engq i等[19]的方法并在此基礎(chǔ)上改進。取1 m L發(fā)酵蘋果汁，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進行色譜分析。色譜條件：W aters xTerra M S C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相0.01 m o l/L(NH4)3PO4，用H3PO4調(diào)pH值至2.70；洗脫程序為等度洗脫；樣品過0.45 μm有機系濾膜；流速0.7 m L/m in；檢測波長210 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

所有實驗重復(fù)3 次，采用Origin 9.0軟件作圖，用SPSS 22.0軟件進行方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果汁發(fā)酵條件的單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵溫度對蘋果汁活菌數(shù)及感官評分的影響

圖1 發(fā)酵溫度對活菌數(shù)和感官評分的影響Fig. 1 Effect of different tem perature on viable count and sensory evaluation

如圖1所示，當(dāng)發(fā)酵溫度較低時，乳酸菌生長和繁殖速度較慢，活菌數(shù)隨著溫度的升高而顯著增加（P＜0.05）。當(dāng)溫度高于37 ℃時，蘋果汁的活菌數(shù)變化不明顯（P＞0.05）。在35～39 ℃時，感官評分差異不顯著（P＞0.05），而溫度過高對蘋果汁的風(fēng)味和口感也會有所影響。當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時，蘋果汁的活菌數(shù)為23.6×107CFU/m L，感官評分為82 分。綜合考慮選擇37 ℃為最佳溫度。

2.1.2 菌種比例對蘋果汁活菌數(shù)及感官評分的影響

如圖2所示，當(dāng)副干酪乳桿菌、動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌比例為1∶2∶2∶1時蘋果汁的活菌數(shù)最多，為29.9×107CFU/m L，顯著高于其他組（P＜0.05）。當(dāng)菌種比例為1∶1∶1∶1時感官評分最高，為80 分。為進一步檢驗不同菌種比例對蘋果汁活菌數(shù)和感官評分的影響是否顯著，對試驗結(jié)果進行單因素方差分析，結(jié)果P值均小于0.01，不同菌種比例下的活菌數(shù)和感官評分差異極顯著。因此在該單因素試驗中，綜合考慮后選擇副干酪乳桿菌、動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌比例為1∶2∶2∶1為最佳比例，并確定1∶2∶2∶1、2∶1∶2∶1、1∶1∶1∶1、2∶2∶1∶1和1∶2∶1∶2的菌種比例作為下一步工藝優(yōu)化的5 個水平。

圖2 菌種比例對活菌數(shù)和感官評分的影響Fig. 2 Effect of ratio among probiotic strains on viable count and sensory evaluation

2.1.3 接種量對蘋果汁活菌數(shù)及感官評分的影響

圖3 接種量對活菌數(shù)和感官評分的影響Fig. 3 Effect of inoculum size on viab le count and sensory evaluation

如圖3所示，當(dāng)接種量在1%～3%時，活菌數(shù)隨接種量的增加呈明顯上升的趨勢（P＜0.05）。當(dāng)接種量為3%時，蘋果汁的活菌數(shù)為最高，達21.0×107CFU/m L，顯著高于其他組（P＜0.05）。當(dāng)接種量大于3%時，活菌數(shù)呈逐漸下降趨勢。從整體來看，感官評分隨著接種量的增大呈現(xiàn)出逐漸減少的趨勢。采用方差分析法對蘋果汁的活菌數(shù)和感官評分進行顯著性分析，結(jié)果接種量對活菌數(shù)和感官評分均極顯著（P＜0.01）?？紤]節(jié)約成本、簡便操作等因素，選擇接種量為3%，并且選擇1%、2%、3%、4%和5%的接種量作為下一步工藝優(yōu)化的5 個水平。

2.1.4 發(fā)酵時間對蘋果汁活菌數(shù)及感官評分的影響

如圖4所示，發(fā)酵至21～26 h時，蘋果汁活菌數(shù)升高較快，并且在發(fā)酵26 h時達到最大值30.0×107CFU/m L，之后則呈下降趨勢，相對應(yīng)的感官評分也降低，可見發(fā)酵時間過長會對蘋果汁的風(fēng)味和口感有所影響。為進一步檢驗發(fā)酵時間對蘋果汁活菌數(shù)和感官評分的影響是否顯著，對試驗結(jié)果進行單因素方差分析，結(jié)果表明發(fā)酵時間對兩者有極顯著影響（P＜0.01）。綜合考慮，選擇26 h為最佳發(fā)酵時間，并選擇22、24、26、28 h和30 h的發(fā)酵時間作為下一步工藝優(yōu)化的5 個水平。

圖4 發(fā)酵時間對活菌數(shù)和感官評分的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on viable count and sensory evaluation

2.2 CCD響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 優(yōu)化結(jié)果和方差分析

利用Design-Expert軟件對表3中的試驗數(shù)據(jù)進行整理分析，得到活菌數(shù)（Y1）和感官評分（Y2）對自變量菌種比例（A）、接種量（B）、發(fā)酵時間（C）的回歸方程分別為：Y1=15.41-3.45A-0.62B-1.06C+2.79AB+1.87AC+2.76BC-0.77A2-3.29B2-2.46C2。Y2=73.96+0.64A-0.47B-0.52C+3.00AB+0.93AC-1.30BC+1.59A2+0.034B2-0.21C2。

表3 CCD試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Central com posite design w ith experimental results

由表4和表5可知，2 個模型中P值均小于0.01，說明本試驗所選用的二次多項模型差異極顯著。失擬項不顯著（P＞0.05）。模型決定系數(shù)R2（活菌數(shù)）值為0.992 2，R2（感官評分）值為0.991 0，說明活菌數(shù)和感官評分的實測值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度，所以該模型擬合效果較好，可以用此模型分析和預(yù)測乳酸菌發(fā)酵蘋果汁的主發(fā)酵工藝。在響應(yīng)值為活菌數(shù)的模型中，A（菌種比例）、B（接種量）、C（發(fā)酵時間）及AB、AC、BC的交互作用及二次項A2、B2、C2對蘋果汁活菌數(shù)的影響極顯著。在響應(yīng)值為感官評分的模型中，A（菌種比例）、B（接種量）、C（發(fā)酵時間）及AB、AC、BC的交互作用及A2對蘋果汁感官評分的影響極顯著，B2和C2對其影響則不顯著。

2.2.2 因素間交互作用分析

由圖5可知，根據(jù)等高線的形狀可以明顯地反映出試驗因素之間交互作用顯著性的強弱，例如菌種比例、接種量、發(fā)酵時間及其交互作用對響應(yīng)值的影響。當(dāng)?shù)雀呔€的形狀為橢圓形或馬鞍形時，說明其交互作用顯著；當(dāng)?shù)雀呔€的形狀為圓形時，說明其交互作用不顯著[20]。在交互作用對蘋果汁的活菌數(shù)和感官評分影響中，菌種比例、接種量和發(fā)酵時間兩兩因素交互項均產(chǎn)生了顯著影響。

表4 活菌數(shù)的方差分析Tab le 4 Analysis of variance of viable count

表5 感官評分的方差分析Table 5 Analysis of variance of sensory evaluation

2.2.3 模型驗證實驗結(jié)果

通過該回歸方程求得優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)為副干酪乳桿菌∶動物雙歧桿菌∶嗜熱鏈球菌∶嗜酸乳桿菌菌種比例1∶1∶1∶1、接種量2%、發(fā)酵時間24 h，此條件下發(fā)酵得到的蘋果汁活菌數(shù)預(yù)測值為21.44×107CFU/m L，感官評分為78.35分。在此條件下進行驗證實驗，結(jié)果顯示，該條件下發(fā)酵得到的蘋果汁的活菌數(shù)為19.85×107CFU/m L，與預(yù)測值相比誤差為7.4%，感官評分為80.23 分，與預(yù)測值相比誤差為2.4%，可見通過響應(yīng)面優(yōu)化方法得到的蘋果汁最佳工藝條件比較可靠。

2.3 最佳發(fā)酵條件下蘋果汁有機酸的動態(tài)變化

蘋果汁富含多種有機酸，還可在發(fā)酵中產(chǎn)生，這些有機酸的種類和含量對蘋果汁發(fā)酵后的感官品質(zhì)有著重要的影響[21]。果汁中的有機酸不僅對果汁的感官特性、穩(wěn)定性、可接受性和營養(yǎng)品質(zhì)上有重要影響[22-23]，還能避免或抑制許多引起果汁腐敗的潛在有害微生物的生長[24]。采用上述所得最佳工藝條件對蘋果汁進行發(fā)酵，并用高效液相色譜法監(jiān)測發(fā)酵過程中蘋果汁各有機酸的變化趨勢。在蘋果汁發(fā)酵過程中，共監(jiān)測了8 種常見有機酸的變化情況。

圖5 不同因素交互作用對蘋果汁活菌數(shù)和感官評分影響的響應(yīng)面圖Fig. 5 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on viable count and sensory evaluation of app le juice

表6 發(fā)酵過程中各有機酸含量的變化Table 6 Changes in organic acids contents during fermentation

蘋果酸是蘋果汁中最重要且含量最高的一種有機酸，乳酸菌在發(fā)酵過程中，不但利用蘋果酸合成乳酸等多種物質(zhì)，而且利用其他物質(zhì)合成蘋果酸。如表6所示，蘋果汁中蘋果酸的初始質(zhì)量濃度為2 918.90 mg/L，發(fā)酵6 h后含量達到最大值，之后迅速下降，這可能是由于乳酸菌在進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵時分解了蘋果酸。發(fā)酵期間，乳酸菌進行三羧酸循環(huán)，作為生物體三羧酸循環(huán)的中間體，蘋果酸參與多個不同的生化反應(yīng)，所以其含量處在動態(tài)變化中。隨著反應(yīng)的進行，蘋果酸被分解為其他物質(zhì)而導(dǎo)致含量下降，發(fā)酵結(jié)束時的最終質(zhì)量濃度為1 574.36 mg/L，較發(fā)酵前含量顯著降低（P＜0.05），這與Herrero等[9]利用乳酸菌和酵母混合發(fā)酵所得蘋果汁中蘋果酸含量顯著下降的結(jié)果相吻合。乳酸也是蘋果汁中重要的有機酸，乳酸初始質(zhì)量濃度為61.26 mg/L，在發(fā)酵初期，乳酸含量變化不大，隨著乳酸菌的數(shù)量增多，在乳酸菌進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中，蘋果酸向乳酸轉(zhuǎn)變，且蘋果汁中的葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑降解成丙酮酸，后者在乳酸脫氫酶的作用下，直接被還原為乳酸，從而導(dǎo)致乳酸含量不斷升高。發(fā)酵結(jié)束時，乳酸含量達到最高值1 679.3 mg/L，較發(fā)酵前顯著升高（P＜0.05），這與Ellendersen等[25]利用干酪乳桿菌發(fā)酵蘋果汁過程中乳酸的變化趨勢相似。

奎寧酸是蘋果汁中含量較高的高等植物特有的脂環(huán)族有機酸，在蘋果汁中的含量僅次于蘋果酸。如表6所示，發(fā)酵開始時，奎寧酸的質(zhì)量濃度為203.90 mg/L，發(fā)酵前12 h變化大，之后奎寧酸含量迅速上升，至發(fā)酵結(jié)束質(zhì)量濃度達最大值445.47 mg/L，較發(fā)酵前含量顯著升高（P＜0.05）。檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，含量處于動態(tài)變化中，在蘋果汁中的初始含量為24.62 mg/L，含量上升至12 h時達最大值，之后又逐漸下降，可能是由于蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中乳酸菌將檸檬酸分解成丙酮酸和乙酸，也有轉(zhuǎn)化為乳酸的現(xiàn)象，其代謝中間產(chǎn)物還能產(chǎn)生乙偶姻和雙乙酰等風(fēng)味化合物[26]，這些物質(zhì)對蘋果汁的風(fēng)味有較大影響。發(fā)酵結(jié)束時質(zhì)量濃度為28.73 mg/L，較發(fā)酵前顯著升高（P＜0.05），而鄭欣等[27]利用多種乳酸菌混合發(fā)酵荔枝汁后檸檬酸沒有顯著變化（P＞0.05）。

莽草酸代謝存在于大量高等植物和微生物中，以莽草酸作為中間體，在生物體內(nèi)合成分解，生成其他物質(zhì)[28]。莽草酸在蘋果汁中含量較低，如表6所示，發(fā)酵開始時其含量為6.80 mg/L，發(fā)酵過程的變化趨勢較平穩(wěn)，這與Herrero等[9]研究的蘋果酸乳酸菌協(xié)同酵母發(fā)酵蘋果汁中奎寧酸的變化趨勢相似。發(fā)酵結(jié)束時含量為7.01 mg/L，較發(fā)酵前含量顯著升高（P＜0.05）。

琥珀酸在蘋果酸-乳酸途徑中，可通過部分丙酮酸氧化為乙酸和H+，H+再將延胡索酸還原得到琥珀酸。另一方面，也可通過酒石酸分解而生成，但生成量較少[26]。Dudley等[29]研究表明，乳酸菌能夠利用三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的檸檬酸合成琥珀酸，同時還會產(chǎn)生乳酸等有機酸，直接影響果汁的酸味。如表6所示，琥珀酸在蘋果汁中的初始含量為99.49 mg/L，發(fā)酵14 h后一直處在較低水平，結(jié)束時質(zhì)量濃度為1.04 mg/L，較發(fā)酵前含量顯著降低（P＜0.05）。酒石酸在蘋果汁中的初始質(zhì)量濃度為89.58 mg/L。發(fā)酵6 h時達最高值，之后呈下降趨勢，酒石酸能夠被乳酸菌降解生成乳酸和乙酸，使揮發(fā)酸含量增加[30]。發(fā)酵結(jié)束時，酒石酸含量為101.45 mg/L，較發(fā)酵前顯著升高（P＜0.05）。丙酮酸是糖酵解、蘋果酸-乳酸發(fā)酵、三羧酸循環(huán)等生物體基本代謝途徑的中間產(chǎn)物。如表6所示，初始質(zhì)量濃度為7.32 mg/L，發(fā)酵6 h后達到最大值，之后呈下降趨勢，這可能是由于在厭氧條件下，所有的乳酸菌都能代謝丙酮酸而產(chǎn)生乙酸、乳酸和雙乙酰等產(chǎn)物[26]。發(fā)酵結(jié)束時質(zhì)量濃度為23.74 mg/L，較發(fā)酵前含量顯著升高（P＜0.05）。

蘋果汁發(fā)酵過程中，蘋果酸、酒石酸和丙酮酸均在發(fā)酵6 h時達到最大值，檸檬酸則是在發(fā)酵12 h時達到最大值；此外，乳酸和奎寧酸均一直處于上升趨勢，在發(fā)酵結(jié)束時達到最大值；而莽草酸的質(zhì)量濃度波動不大，沒有明顯的最大值，琥珀酸則處于下降趨勢，發(fā)酵結(jié)束質(zhì)量濃度較低。除了蘋果酸和琥珀酸經(jīng)過發(fā)酵后含量顯著下降（P＜0.05）外，其他有機酸的含量均顯著升高（P＜0.05）。

3 結(jié) 論

利用副干酪乳桿菌20241、動物雙歧桿菌6165、嗜熱鏈球菌6063和嗜酸乳桿菌6005 4 株菌發(fā)酵紅富士蘋果汁，通過單因素試驗，選擇37 ℃為發(fā)酵溫度。在蘋果汁發(fā)酵過程中，菌種比例、接種量、發(fā)酵時間對蘋果汁活菌數(shù)和感官評分均有顯著影響。通過響應(yīng)面優(yōu)化所得蘋果汁發(fā)酵的最佳工藝條件為副干酪乳桿菌20241、動物雙歧桿菌6165、嗜熱鏈球菌6063和嗜酸乳桿菌6005菌種比例1∶1∶1∶1、接種量2%、發(fā)酵時間24 h，在此條件下得到的活菌數(shù)為19.85×107CFU/m L，感官評分為80.23分。采用高效液相色譜法檢測最佳發(fā)酵條件下蘋果汁有機酸的變化情況，其中蘋果酸和琥珀酸經(jīng)發(fā)酵后含量下降明顯（P＜0.05），而乳酸、奎寧酸、檸檬酸、酒石酸、丙酮酸和莽草酸含量均顯著提高（P＜0.05）。

[1] YOON K Y, WOODAMS E E, HANG Y D. Production of probiotic cabbage juice by lactic acid bacteria[J]. Bioresource Technology,2006, 97: 1427-1430. DOI:10.1016/j.biortech.2005.06.018.

[2] 安興娟, 張瑤, 姬阿美, 等. 植物乳桿菌發(fā)酵枸杞胡蘿卜汁工藝的優(yōu)化[J]. 天津科技大學(xué)學(xué)報, 2016, 31(3): 20-24. DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20150029.

[3] FILEKI T, PELAYO E, PALABAY R B. Carboxylic acid composition of varietal juices produced from fresh and stored apples[J]. Journal of Agricultural and Food Chem istry, 1995, 43(3): 598-607. DOI:10.1021/jf00051a009.

[4] 原德樹. 液態(tài)深層發(fā)酵蘋果醋及蘋果醋飲料的研制[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2010, 26(5): 523-526. DOI:10.3969/j.issn.1673-9078.2010.05.026.[5] 崔莉, 李大婧, 劉春泉, 等. 黃秋葵汁乳酸菌混菌發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品科學(xué), 2015, 36(23): 205-208. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201523038.

[6] 張曉, 夏延斌. 乳酸菌和酵母菌復(fù)合發(fā)酵芹菜汁制備泡菜母液條件的優(yōu)化[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2013, 39(2): 204-208.

[7] 王凱旋, 張健, 王俊, 等. 應(yīng)用雙響應(yīng)曲面法優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵桑葚汁的生產(chǎn)工藝條件[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2013, 39(4): 763-770.

[8] 劉磊, 汪浩, 張名位, 等. 龍眼乳酸菌發(fā)酵工藝條件優(yōu)化及其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(20): 4147-4158.DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.20.014.

[9] HERRERO M, GARCIA L A, DIAZ M. Organic acids in cider w ith simultaneous inoculation of yeast and malolactic bacteria: effect of fermentation temperature[J]. Journal of the Institute of Brew ing, 1999,105(4): 229-232. DOI:10.1002/j.2050-0416.1990.tb00023.x.

[10] DIERINGS L R, BRAGA C M, SILVA K M D , et al. Population dynam ics of m ixed cultures of yeast and lactic acid bacteria in cider conditions[J]. Brazilian Archives of Biology and Technology, 2013,56(5): 837-847. DOI:10.1590/s1516-89132013000500016.

[11] 趙蓓, 李鋒. 發(fā)酵型復(fù)合果蔬乳飲料的制備工藝研究[J]. 食品安全導(dǎo)刊, 2015(6): 131-134.

[12] 牛墨, 孟祥晨. 復(fù)合發(fā)酵蘋果山藥果蔬汁優(yōu)良乳酸菌菌株的篩選[J].食品工業(yè)科技, 2012, 33(14): 242-246.

[13] ELMADFA L, KLEIN P, MEYER A. Immune-stimulating effects of lactic acid bacteria in vivo and in vitro[J]. Proceedings of the Nutrition Society, 2010, 69(3): 416-420. DOI:10.1017/s0029665110001710.

[14] FILANNINO P, AZZI L, CAVOSKI I, et al. Exploitation of the healthpromoting and sensory properties of organic pomegranate (Punica granatum L.) juice through lactic acid fermentation[J]. International Journal of Food M icrobiology, 2013, 163(2/3): 184-192. DOI:10.1016/j.ijfoodm icro.2013.03.002.

[15] HUR S J, LEE S Y, KIM Y C, et al. Effect of fermentation on the antioxidant activity in plant-based foods[J]. Food Chem istry, 2014,160(10): 346-356. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.03.112.

[16] CAPOZZI V, MENGA V, DIGESU A M, et al. Biotechno logy p roduction o f vitam in B2-enriched bread and pasta[J]. Journal of Agricultural and Food Chem istry, 2011, 59(14): 8013-8020.DOI:10.1021/jf201519h.

[17] 尹曼, 王一俠, 魏穎, 等. 復(fù)合果蔬乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物分析及功能性評價[J]. 食品工業(yè), 2016, 37(11): 215-219.

[18] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗: GB 4789.35—2016[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2016: 1-8.

[19] YE M Q, YUE T L, YUAN Y H. Evolution of polyphenols and organic acids during the fermentation of apple cider[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2014, 94(14): 2951-2957.DOI:10.1002/jsfa.6639.

[20] MURALIDHAR R V, CHIRUMAM ILA R R, MARCHANT R, et al.A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using tw o different carbon sources[J].Biochem istry Engineering Journal, 2001, 9(1): 17-23. DOI:10. 1016/s1369-703x(01)00117-6.

[21] RAAMON-PORTUGAL F, SEILLER L, TAILLANDIER P, et al.K inetics of production and consumption of organic acids during alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisae[J]. Food Technology and Biotechnology, 1999, 37(4): 235-240.

[22] SHUI G, LEONG L P. Separation and determ ination of organic acids and phenolic compounds in fruit juices and drinks by highperformance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A,2002, 977: 89-96. DOI:10.1016/s0021-9673(02)01345-6.

[23] SOYER Y, KOCA N, KARADENIZ F. Organic acid profi le of Turkish white grapes and grape juices[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2003, 16: 629-636. DOI:10.1016/s0889-1575(03)00065-6.

[24] ZOTOU A, LOUKOU Z, KARAVA O. M ethod development for the determ ination of seven organic acids in w ines by reversed-phase high performance liquid chromatography[J]. Chromatographia, 2004, 60:39-44. DOI:10.1365/s10337-004-0330-9.

[25] ELLENDERSEN, DANIEL G, KARLA B G, et al. Development and sensory profile of a probiotic beverage from apple fermented w ith Lactobacillus casei[J]. Engineering in Life Science, 2012, 12(4): 475-485. DOI:10. 1002/elsc.201100136.

[26] 李華. 葡萄酒化學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2006: 90-108.

[27] 鄭欣, 余元善, 吳繼軍, 等. 荔枝汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后營養(yǎng)品質(zhì)的變化及貯藏穩(wěn)定性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2013, 29(12): 2909-2914.

[28] 龐雪龍, 張戎睿, 楊磊, 等. 莽草酸研究進展[J]. 黑龍江醫(yī)藥, 2011,24(5): 700-702. DOI:10.3969/j.issn.1006-2882.2011.05.010.

[29] DUDLEY E G, STEELE J L. Succinate p roduction and citrate catabolism by Cheddar cheese nonstarter lactobacilli[J]. Journal of Applied M icrobiology, 2005, 98(1): 14-23. DOI:10.1111/j.1365-2672.2004.02440.X.

[30] RADIN L, PRONZATO C, CASARETO L, et al. Tartaric acid in w ines may be useful for preventing renal calculi: rapid determ ination by HPLC[J]. Journal of Liquid Chromatography, 1994, 17(10): 2231-2246. DOI:10.1080/10826079408013543.

Optimization of Fermentation of Apple Juice by Probiotics and Organic Acids Evolution during Fermentation

LI Weini, ZHANG Yuxiang, WEI Jianping, YUAN Yahong, HAN Xiaojiang, YUE Tianli*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

The fermentation of Fuji apple juice by lactic acid bacteria was optimized and changes in organic acids during

fermentation were analyzed. Lactobacillus paracasei 20241, Bifidobacterium animalis 6165, Streptococcus thermophilus 6063 and Lactobacillus acidophilus 6005 were used as mixed cultures in the fermentation of apple juice. The optimization of culture composition, inoculum size and fermentation time was performed using one-factor-at-a-time method and response surface methodology. Viable cell count and sensory score were used as response variables. The results showed that the optimal fermentation conditions were as follows: ratio of four probiotic strains, 1:1:1:1; inoculum size, 2%; fermentation time, 24 h; and temperature, 37 ℃. Under these conditions, viable cell count was 1.985 × 108CFU/m L and sensory score was 80.23 points. Malic acid and succinic acid contents decreased significantly after fermentation (P ＜ 0.05), while lactic acid, quinic acid, citric acid, tartaric acid, pyruvic acid and shikim ic acid contents significantly increased (P ＜ 0.05) as demonstrated by HPLC analysis.

lactic acid bacteria; apple juice; fermentation; process optim ization; organic acids

10.7506/spkx1002-6630-201722013

TS255.4

A

1002-6630（2017）22-0080-08

李維妮, 張宇翔, 魏建平, 等. 益生菌發(fā)酵蘋果汁工藝優(yōu)化及有機酸的變化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22): 80-87.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722013. http://www.spkx.net.cn

LI Weini, ZHANG Yuxiang, WEI Jianping, et al. Optimization of fermentation of apple juice by probiotics and organic acids evolution during fermentation[J]. Food Science, 2017, 38(22): 80-87. (in Chinese w ith English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722013. http://www.spkx.net.cn

2017-03-10

“十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項（2017YFD0400702）

李維妮（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：236099531@qq.com

*通信作者：岳田利（1965—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)及食品安全控制。E-mail：yuetl@nwafu.edu.cn