張延杰，王靜雪*，牟海津

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌Virgibacillus sp. P-4的篩選鑒定及其特性分析

張延杰，王靜雪*，牟海津

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

利用酪蛋白瓊脂平板從傳統(tǒng)蝦醬中分離嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌隸屬于枝芽孢桿菌屬Virgibacillus sp. P-4，并用此菌為后續(xù)研究菌株。結(jié)果表明，該菌最適生長(zhǎng)溫度為30～37 ℃，最適生長(zhǎng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～15%；所產(chǎn)胞外蛋白酶在20～50 ℃條件下酶活力較高且保持穩(wěn)定，最適反應(yīng)溫度為40 ℃，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)酶活力達(dá)到最高，并且所產(chǎn)胞外蛋白酶種類(lèi)可能不只一種，但不包含巰基蛋白酶；通過(guò)分析酶解液中游離氨基酸釋放速率，預(yù)測(cè)其酶切位點(diǎn)為Phe-、Tyr-、Lys-、His-、Pro-及Leu-。

蛋白酶產(chǎn)生菌；嗜鹽菌；蝦醬；性質(zhì)

傳統(tǒng)蝦醬是以蝦為原料，在高鹽條件下，經(jīng)自然發(fā)酵而成的一種風(fēng)味獨(dú)特的黏稠狀紫紅色調(diào)味料，富含不飽和脂肪酸以及游離氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，深受我國(guó)以及東南亞各國(guó)人民的喜愛(ài)[1]。然而目前我國(guó)蝦醬產(chǎn)業(yè)存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、鹽度過(guò)高（30%～35%）等問(wèn)題，制約了其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展[2]。許多學(xué)者嘗試通過(guò)減少鹽用量和降低pH值[3]、提高發(fā)酵溫度[4]、外加蛋白酶[5]等加速蛋白質(zhì)降解的方式來(lái)縮短發(fā)酵周期。但是這些方法也存在缺陷，如低鹽會(huì)促進(jìn)致病菌的滋生，高溫則會(huì)使必要的蛋白酶變性并且還會(huì)增加投資成本，外加酶發(fā)酵的產(chǎn)品風(fēng)味不及自然發(fā)酵[6]。

近年來(lái)，以微生物為啟動(dòng)子，通過(guò)純培養(yǎng)的方式來(lái)發(fā)酵水產(chǎn)品，受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注，這種方式對(duì)提高加工速率、穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量、改善產(chǎn)品感官品質(zhì)以及縮短發(fā)酵周期等方面都有積極作用[7]，Speranza等[8]利用3 株片球菌（Pediococcus）在實(shí)驗(yàn)室條件下發(fā)酵魚(yú)露，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種發(fā)酵方式不僅可以縮短發(fā)酵時(shí)間，并且還能夠改善產(chǎn)品質(zhì)量。自然發(fā)酵方式不受人為控制，產(chǎn)品質(zhì)量總是參差不齊，選擇合適的嗜鹽菌作為啟動(dòng)子，優(yōu)化和控制發(fā)酵過(guò)程，就成為研究熱點(diǎn)。段杉等[9]研究發(fā)現(xiàn)，蝦醬在發(fā)酵過(guò)程中內(nèi)源性蛋白酶活力不斷降低，細(xì)菌蛋白酶活力逐漸增加，細(xì)菌蛋白酶對(duì)發(fā)酵風(fēng)味的形成有極大貢獻(xiàn)。呂欣然等[10]研究表明，蝦醬中產(chǎn)蛋白酶的嗜鹽性葡萄球菌和枝芽孢桿菌是導(dǎo)致蝦醬中蛋白質(zhì)降解的主體微生物類(lèi)群。鑒于嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌在蝦醬發(fā)酵過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，因此一些學(xué)者將目光集中于此，例如，Tanasupaw at等[11]從泰國(guó)蝦醬中分離到一株鹽脫氮枝芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans TKNR13-3），它的嗜鹽嗜熱特性將在食品發(fā)酵方面有巨大的應(yīng)用潛力；連鑫等[12]從傳統(tǒng)蝦醬中分離出一株具有水解蛋白質(zhì)能力的黑曲霉（Aspergillus niger），而霉菌在發(fā)酵食品中往往會(huì)產(chǎn)生良好的風(fēng)味。綜上所述，有針對(duì)性地分離嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌，對(duì)它的生長(zhǎng)特性、酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，這對(duì)于將來(lái)用其進(jìn)行蝦醬的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)有重要意義。

本研究主要是通過(guò)分離篩選傳統(tǒng)蝦醬中的嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌，并對(duì)其特性進(jìn)行分析，以期為蝦醬的分步發(fā)酵提供優(yōu)良的微生物菌株，最終達(dá)到縮短發(fā)酵周期、降低鹽度、穩(wěn)定生產(chǎn)的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦醬采購(gòu)于山東青島。

酪蛋白、瓊脂 北京索萊寶科技有限公司；酵母膏北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；氯化鈉、三氯乙酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基及蛋白酶制劑 北京路橋技術(shù)有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所用試劑均購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司。

酪蛋白液體培養(yǎng)基：酪蛋白10 g/L，酵母膏1 g/L，NaCl 100 g/L，pH 7.2±0.2。

酪蛋白固體培養(yǎng)基：酪蛋白10 g/L，酵母膏1 g/L，NaCl 100 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.2±0.2。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-1恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；M LS-3750全自動(dòng)滅菌鍋 日本三洋電子公司；WPG-350隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HZQ-F恒溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 菌株的篩選及鑒定

1.3.1 菌株的初篩

稱(chēng)取1 g蝦醬置于酪蛋白液體培養(yǎng)基中進(jìn)行多次富集培養(yǎng)，吸取100 μL富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋后涂布于酪蛋白固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)6 d，選取菌落周?chē)型该魅Φ木赀M(jìn)行純化，然后點(diǎn)種于酪蛋白固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)6 d后，在平板上加0.4 mol/L三氯乙酸觀察透明圈的大小。

1.3.2 菌株的復(fù)篩

挑取一環(huán)菌株接種于50 m L酪蛋白液體培養(yǎng)基中（250 m L錐形瓶），37 ℃、150 r/m in振蕩培養(yǎng)7 d。吸取1、3、5、7 d的適量培養(yǎng)液進(jìn)行蛋白酶活力測(cè)定。參考GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[13]采用Folin-酚法，利用酶標(biāo)儀分別測(cè)定菌株的酸性、中性、堿性蛋白酶活力。對(duì)于酸性、中性、堿性蛋白酶的活力測(cè)定需分別使用pH 3.0乳酸-乳酸鈉緩沖液、pH 7.5磷酸鹽緩沖液和pH 10.0硼酸-硼酸鈉緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。一般認(rèn)為，在40 ℃適當(dāng)pH值條件下，1 m in水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為1 個(gè)蛋白酶活力單位。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定[14]

挑取一環(huán)單菌落置于500 μL無(wú)菌水中，置于95 ℃水浴加熱5 m in后作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reac tion，PCR）模板。PCR體系為50 μL，其中：PCR M aster M ix（2×）25 μL，16S Primer Up 1 μL，16S Primer Down 1 μL，模板2 μL，加RNase-Free Water補(bǔ)至50 μL。PCR條件：94 ℃預(yù)變性10 m in；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 m in，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 m in。最后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)得的序列登錄EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.3.4 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16]進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定。

1.3.5 生長(zhǎng)特性

挑取一環(huán)待測(cè)菌株接種于50 m L營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃、150 r/m in振蕩培養(yǎng)24 h，而后按2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，將其分別設(shè)置為不同的培養(yǎng)時(shí)間（自0 h開(kāi)始，每隔4 h測(cè)定一次）、培養(yǎng)溫度（10、20、30、35、37、45 ℃）、pH值（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5）、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%、5%、10%、15%、20%、25%）的培養(yǎng)基，在適宜溫度振蕩培養(yǎng)48 h后測(cè)定OD600nm，每個(gè)梯度設(shè)置3 個(gè)平行。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.3.6.1 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

取適量經(jīng)緩沖液適當(dāng)稀釋的粗酶液，將其分別置于20、30、40、50、60、70 ℃條件下測(cè)定中性蛋白酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力。

取經(jīng)緩沖液適當(dāng)稀釋的粗酶液，分別置于20、30、40、50、60、70 ℃條件下保溫30 m in，待恢復(fù)到室溫后在最適反應(yīng)溫度測(cè)定中性蛋白酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.6.2 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活力的影響

將待測(cè)菌株置于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl（0%、5%、10%、15%、20%）酪蛋白液體培養(yǎng)基中，取適量粗酶液測(cè)定中性蛋白酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.6.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響

向粗酶液中分別加入A gNO3、A lC l3、CaC l2、COCl2、CuSO4、Fe2(SO4)3、MgSO4、MnSO4和ZnSO4至最終濃度為5 mmol/L，室溫靜置30 m in，在最適條件下測(cè)定中性蛋白酶活力，以不加金屬離子的粗酶液作對(duì)照酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.6.4 抑制劑對(duì)酶活力的影響

向粗酶液中分別加入不同的蛋白酶抑制劑：碘乙酰胺（iodoacetam ide，IAM，巰基蛋白酶抑制劑）、乙二胺四乙酸（ethylenediam inetetraacetic acid，EDTA，金屬蛋白酶抑制劑）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF，絲氨酸蛋白酶抑制劑）、胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）使抑制劑濃度達(dá)到1 mmol/L，在室溫靜置30 m in，在相同條件下測(cè)定中性蛋白酶活力，未經(jīng)處理的粗酶液作對(duì)照，酶活力為100%，計(jì)算加入抑制劑后的相對(duì)酶活力。

1.3.7 酶解特異性分析[17]

向經(jīng)過(guò)滅菌處理的100 m L南極磷蝦勻漿液中加入5 m L粗酶液，以不加粗酶液酶解的樣品為空白。在最適溫度條件下，于恒溫振蕩搖床中振蕩酶解1～21 h。酶解結(jié)束后，將酶解產(chǎn)物置于沸水中15 min滅酶，冷卻后8 000 r/min離心30 m in，收集上清液即為酶解液，采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定酶解液中游離氨基酸，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用軟件Origin 8.5對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選

據(jù)報(bào)道，水產(chǎn)品中存在多樣且復(fù)雜的微生物群體[18]，在發(fā)酵過(guò)程中嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌起著主導(dǎo)作用[19]，它的主要作用是在高鹽環(huán)境下仍具有蛋白酶活力，降解水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍1%～10%逐步遞增時(shí)，就會(huì)明顯影響微生物的生長(zhǎng)、發(fā)酵的速率、產(chǎn)品的感官質(zhì)量等。因此，從發(fā)酵水產(chǎn)品中分離出固有的嗜鹽性微生物，可能會(huì)擁有更理想的特性，可以重現(xiàn)原產(chǎn)品的風(fēng)味甚至提高原產(chǎn)品的質(zhì)量[8,20]。

圖1 嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌在酪蛋白平板上的透明圈Fig. 1 Transparent zones around colonies on casein agar p lates

從蝦醬樣品中初篩得到11 株嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌，將這11 株菌在酪蛋白平板上點(diǎn)種培養(yǎng)6 d后，添加0.4 mol/L三氯乙酸，結(jié)果如圖1所示。然后對(duì)圖1中這11 株菌進(jìn)行酸性、中性、堿性蛋白酶活力測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。綜合以上結(jié)果表明，這11 株菌以產(chǎn)中性蛋白酶為主，尤其以P-4所產(chǎn)中性蛋白酶活力最為突出。此外，P-2雖然在酪蛋白平板上透明圈較小，但是其蛋白酶活力卻比大多數(shù)測(cè)定菌株都高，這一結(jié)果表明透明圈的大小并不能十分準(zhǔn)確地反映蛋白酶的活力。此外，連鑫等[12]采用與本實(shí)驗(yàn)相同的篩選方法，在中性酪蛋白瓊脂平板上篩選到一株黑曲霉，采用Folin-酚法測(cè)定其蛋白酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這株黑曲霉的酸性蛋白酶活力最高。

圖2 11 株嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌酶活力Fig. 2 Protease activities of 11 selected isolates

2.2 基于16S rDNA序列分析的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將測(cè)序結(jié)果與Ez Taxon數(shù)據(jù)庫(kù)（h ttp://w w w.ezbiocloud.net/）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P-4與模式菌株V. halodenitrificans DSM 10037T具有最大相似度，可達(dá)99.39%。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，如圖3所示，P-4與V. ha lodenitrificans DSM 10037T最接近，隸屬于同一分支，因此，初步確定P-4屬于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）。為進(jìn)一步比較分析P-4與枝芽孢桿菌屬已知種相互之間的差異，需要對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化特征的鑒定。

圖3 嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌P-4的建樹(shù)結(jié)果Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree for strain P-4 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 表型鑒定

圖4 嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌P-4的透射電鏡照片（×25 000）Fig. 4 Transm ission electron m icrographs of strain P-4 (× 25 000)

將菌株P(guān)-4分別接種在NA平板上觀察菌落形態(tài)，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及染色特征。P-4在NA平板上長(zhǎng)出的菌落為圓形，乳白色，表面光滑不透明，革蘭氏染色可變，菌體呈桿狀，周生鞭毛。圖4即為P-4在NA平板上培養(yǎng)3 d后的透射電鏡照片。

經(jīng)過(guò)16S rDNA鑒定之后，認(rèn)定P-4隸屬于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）。以不產(chǎn)生色素、能降解酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，目前為止符合上述標(biāo)準(zhǔn)，可供選取的枝芽孢桿菌屬已知種有8 個(gè)，表1列出了P-4與這8個(gè)枝芽孢桿菌屬已知種在生理生化特征上的異同。可以看出，P-4擁有大量枝芽孢桿菌屬的特征，如生長(zhǎng)范圍、氧化酶活性、V-P實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、精氨酸雙水解酶及鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性等都基本一致；但是也有部分不同于枝芽孢桿菌屬已知種的特征，如革蘭氏染色、硝酸鹽還原性、H2S產(chǎn)氣、賴(lài)氨酸脫羧酶活性等。

表1 P-4區(qū)別于枝芽孢桿菌屬其他種細(xì)菌的不同特征Tab le 1 Differential characteristics between strain P-4 and related species of the genus Virgibacillus

通過(guò)以上對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，初步認(rèn)定菌株P(guān)-4可能為芽孢桿菌科枝芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，命名為Virgibacillus sp. P-4。

2.4 Virgibacillus sp. P-4的生長(zhǎng)特性

由圖5可知，該菌在經(jīng)過(guò)液體培養(yǎng)之后，20 h之后即可進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期；最適生長(zhǎng)溫度為30～37 ℃；當(dāng)pH值小于6.5時(shí)，菌體幾乎不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢，當(dāng)pH 6.5～7.5時(shí)，隨著pH值的升高，菌體呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；當(dāng)pH值大于7.5時(shí)，菌體生長(zhǎng)速率減緩，但仍舊繼續(xù)生長(zhǎng)；最適生長(zhǎng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～15%，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)20%，菌體幾乎不再生長(zhǎng)。從生長(zhǎng)特性來(lái)看，該菌對(duì)NaCl有一定的耐受性和依賴(lài)性，這也為今后將其應(yīng)用于高鹽發(fā)酵提供了可能性。

2.5 Virgibacillus sp. P-4的酶學(xué)性質(zhì)

由圖6可知，Virgibacillus sp. P-4的粗酶液受溫度、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、金屬離子及添加劑的影響。圖6A表明，Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶的最適反應(yīng)溫度是40 ℃，并且在20～50 ℃處理30 m in后，仍保持較高且比較穩(wěn)定的酶活力，這表明Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶具有一定的耐熱能力，而耐熱能力對(duì)食品發(fā)酵是至關(guān)重要的。因?yàn)槭称钒l(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定的熱量，具有耐熱能力的蛋白酶即使溫度升高仍能保持較高且穩(wěn)定的酶活力[30]。圖6B表明，Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶的活性隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而逐漸升高，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15%時(shí)，蛋白酶活力達(dá)到最高，隨后蛋白酶活力隨NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高而急劇下降。這一結(jié)果表明該蛋白酶需要一定濃度的NaCl來(lái)達(dá)到最高酶活力并且可以在高鹽環(huán)境下保持性質(zhì)穩(wěn)定。圖6C表明，不同的金屬離子對(duì)Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶粗酶液的活性均有不同程度的抑制作用，其中Zn2+、Fe2+、Co2+對(duì)酶活力具有明顯的抑制作用。圖6D表明，EDTA、PMSF、Pepstatin對(duì)Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶也有不同程度的抑制作用，其原因是，該菌所產(chǎn)胞外蛋白酶的種類(lèi)可能不只一種。而IAM是一種巰基反應(yīng)物，在添加了一定濃度的IAM后，蛋白酶的活性幾乎不受影響，表明該粗酶液中不包含巰基蛋白酶。

圖5 Virgibacillus sp. P-4培養(yǎng)過(guò)程中時(shí)間（A）、溫度（B）、pH值（C）、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（D）對(duì)菌株生長(zhǎng)量的影響Fig. 5 Effects of culture time (A), temperature (B), pH (C), and NaCl concentration (D) on biomass of Virgibacillus sp. P-4

圖6 溫度（A）、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、金屬離子（C）、抑制劑（D）對(duì)Virgibacillus sp. P-4蛋白酶活力的影響Fig. 6 Effects of temperature (A), NaCl concentration (B), metal ions (C),and inhibitors (D) on protease activity of Virgibacillus sp. P-4

關(guān)于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）的嗜鹽性、胞外蛋白酶性質(zhì)及發(fā)酵特性近年來(lái)也曾有報(bào)道，Sinsuwan等[31]從發(fā)酵1個(gè)月的魚(yú)露中篩選到1株中度嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌Virgibacillus sp. SK37，其粗酶液在0%～25%NaCl下具有穩(wěn)定酶活力；Udomsil等[32]在魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中相繼接種Virgibacillus sp. SK37和Tetragenococcus halophilus MS33，結(jié)果表明這種發(fā)酵方式對(duì)改善產(chǎn)品的揮發(fā)性成分，提高谷氨酸含量和整體可接受度上具有較大潛力。由圖3的建樹(shù)結(jié)果可知P-4與Virgibacillus sp. SK 37處于同一分支，它們的16S rDNA序列相似度很高，都屬于嗜鹽菌。但是通過(guò)對(duì)比它們粗酶液的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)Virgibacillus sp.SK 37的酶活力最佳條件為p H 8.0和65 ℃[31]，而Virgibacillus sp. P-4的最佳酶活力則是在pH 7.0和40 ℃處獲得。由此表明，Virgibacillus sp. SK37所產(chǎn)蛋白酶對(duì)溫度的要求比較高，而Virgibacillus sp. P-4則可以在適宜溫度同時(shí)達(dá)到生長(zhǎng)最佳和酶活力最高，因此Virgibacillus sp.P-4在實(shí)際生產(chǎn)中更具應(yīng)用潛力。

2.6 Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶的酶解特異性

蛋白酶降解蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)的肽鍵破裂，導(dǎo)致氨基酸的釋放，用游離氨基酸的釋放速率來(lái)預(yù)測(cè)Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶優(yōu)先作用于哪些氨基酸組成的肽鍵。Lei Fenfen等[33]將應(yīng)用最廣泛、效果較好、酶切位點(diǎn)確定的兩種商業(yè)酶（Papain和A lcalase 2.4L）用來(lái)酶解鳳尾魚(yú)蛋白和大豆蛋白時(shí)，通過(guò)游離氨基酸的釋放速率來(lái)預(yù)測(cè)酶切位點(diǎn)，所得結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的這兩種商業(yè)酶的特異性酶切位點(diǎn)結(jié)論幾乎完全一致。因此，游離氨基酸的釋放速率在一定程度上能夠反映蛋白酶的酶解特異性。

然而酶促反應(yīng)通常很復(fù)雜，不一定滿(mǎn)足線性關(guān)系，但在酶促反應(yīng)的初期可以認(rèn)為是符合線性關(guān)系的。在本實(shí)驗(yàn)中，南極磷蝦酶解的前11 h內(nèi)，游離氨基酸含量與時(shí)間有較好的線性關(guān)系，在這個(gè)時(shí)間段內(nèi)，游離氨基酸的釋放速率如表2所示，Virgibacillus sp. P-4的粗酶液在酶解南極磷蝦時(shí)，釋放速率最快的是Phe、Tyr、Lys、His、Pro與Leu，由此可推測(cè)Virgibacillus sp. P-4所產(chǎn)胞外蛋白酶在酶解過(guò)程中優(yōu)先酶解含Phe-、Tyr-、Lys-、His-、Pro-及Leu-的肽鍵。

表2 Virgibacillus sp. P-4的蛋白酶酶解南極磷蝦各種氨基酸的釋放速率Table 2 The rate of release of FAAs from Antarctic krill meat hyd rolyzed by the protease from Virgibacillus sp. P-4

3 結(jié) 論

蝦醬作為一種特殊的鹽生環(huán)境，分布著多種嗜鹽菌，這些嗜鹽菌在蝦醬的發(fā)酵成熟過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。采用酪蛋白瓊脂平板法從蝦醬中分離得到一株在高鹽環(huán)境下仍能保持穩(wěn)定酶活力的蛋白酶產(chǎn)生菌Virgibacillus sp. P-4，并通過(guò)分子鑒定、表型鑒定、生長(zhǎng)特性研究、酶學(xué)性質(zhì)研究、酶切位點(diǎn)預(yù)測(cè)等手段對(duì)其進(jìn)行了全面解析，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，Virgibacillus sp.P-4確實(shí)是一株嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌，其生長(zhǎng)特性和胞外蛋白酶活力都對(duì)NaCl有較強(qiáng)依賴(lài)性，這為將其應(yīng)用于鹽生環(huán)境發(fā)酵提供了可能性。其次，Virgibacillus sp. P-4的生長(zhǎng)最適溫度和酶解最適反應(yīng)溫度比較接近，在發(fā)酵過(guò)程中只需設(shè)置適宜溫度，即可讓Virgibacillus sp. P-4同時(shí)滿(mǎn)足生長(zhǎng)最佳和胞外蛋白酶活力最高。以上這些結(jié)果都為進(jìn)一步利用該菌株進(jìn)行低鹽發(fā)酵提供了理論支持。

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Isolation, Identification and Properties of Protease-Producing Halophilic Bacterium Virgibacillus sp. P-4 from Traditional Shrimp Sauce

ZHANG Yanjie, WANG Jingxue*, MOU Haijin
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Protease-producing bacteria were isolated from traditional shrimp sauce by using casein agar medium containing 10% NaCl. Based on its morphological, biochem ical and molecular properties, Virgibacillus sp. P-4 was determ ined as target strain for further study. The strain grew best at 30–37 ℃ w ith a salinity of 5%–15%. The protease produced by Virgibacillus sp. P-4 showed the optimum activity at 40 ℃, and was stable in the range of 20–50 ℃. The enzymatic activity reached its peak when NaCl concentration was 15%. Besides, Virgibacillus sp. P-4 m ight produce more than one extracellular protease except sulfhydryl protease. According to the rate of release of free am ino acids, the protease m ight preferably hydrolyze peptides containing Phe-, Tyr-, Lys-, His-, Pro- and Leu-.

protease-producing bacteria; halophilic bacteria; shrimp sauce; properties

10.7506/spkx1002-6630-201722016

TS254.1

A

1002-6630（2017）22-0102-07

張延杰, 王靜雪, 牟海津. 嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌Virgibacillus sp. P-4的篩選鑒定及其特性分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22):102-108. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722016. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Yanjie, WANG Jingxue, MOU Haijin. Isolation, identification and properties of protease-producing halophilic bacterium Virgibacillus sp. P-4 from traditional shrimp sauce[J]. Food Science, 2017, 38(22): 102-108. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722016. http://www.spkx.net.cn

2017-01-04

山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專(zhuān)項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（2015ZDZX05003）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（海水魚(yú)）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-47）；水產(chǎn)品（甲殼類(lèi)）高效保鮮模式的建立與示范項(xiàng)目（931566010）

張延杰（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：zhangyjouc@163.com

*通信作者：王靜雪（1976—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：snow@ouc.edu.cn