李 婷，陳景樺，馬得草，王星晨，陶永勝,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

優(yōu)選非釀酒酵母與釀酒酵母在模擬葡萄汁發(fā)酵中生長動(dòng)力學(xué)及酯酶活性分析

李 婷1，陳景樺1，馬得草1，王星晨1，陶永勝1,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

目的：探究非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵過程中酵母的生長狀況及酯酶活性的變化規(guī)律。方法：通過測定川南白酒窖池中分離的非釀酒酵母在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的酯酶活性，從中優(yōu)選1 株高產(chǎn)酯酶的酵母，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析鑒定種屬。隨后利用模擬葡萄汁進(jìn)行優(yōu)選酵母和釀酒酵母的混合發(fā)酵，設(shè)立同時(shí)接種、提前48 h接種和提前96 h接種優(yōu)選酵母3 個(gè)實(shí)驗(yàn)處理，以兩株酵母的純發(fā)酵為對(duì)照，研究發(fā)酵過程中的酵母生長動(dòng)力學(xué)及不同碳鏈長度底物（C2～C8）對(duì)應(yīng)的酯酶活性變化。結(jié)果：優(yōu)選的非釀酒酵母為發(fā)酵畢赤酵母。酵母生長動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，單一釀酒酵母的發(fā)酵速率最快，但混合發(fā)酵中的酵母數(shù)量更多，尤其是提前96 h接種。模擬發(fā)酵處理中，同時(shí)接種處理的酯酶活性累積量最大（574 mU/m L），酯酶活性在C2～C8有底物特異性，其中C8酯酶活性累積量最高（178～227 mU/m L），C2酯酶活性累積量最低（46～66 mU/m L）。結(jié)合發(fā)酵動(dòng)力學(xué)與發(fā)酵中酯酶活性變化，發(fā)現(xiàn)酯酶活性與酵母的生長狀況有關(guān)，當(dāng)酵母生長達(dá)到穩(wěn)定期，酯酶活性達(dá)到最大值。結(jié)論：優(yōu)選酵母與釀酒酵母的同時(shí)接種發(fā)酵具有較高的C4～C8酯酶活性累積量，有增香釀造的應(yīng)用潛力。

非釀酒酵母；發(fā)酵畢赤酵母；酯酶；模擬葡萄汁；生長動(dòng)力學(xué)

釀酒酵母由于發(fā)酵純凈、發(fā)酵徹底、酒精轉(zhuǎn)化率高而成為葡萄酒酒精發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌株。但研究發(fā)現(xiàn)，單一釀酒酵母的酒精發(fā)酵常常會(huì)給葡萄酒帶來香氣單一、風(fēng)味同質(zhì)化的問題，不利于葡萄酒地域風(fēng)格和酒莊特色的形成[1]。而其他非釀酒酵母在酒精發(fā)酵中雖然存活時(shí)間短，酒精耐受力差[2]，但它們中的一些能促進(jìn)更多風(fēng)味成分的生成，尤其是酯類、醇類等物質(zhì)[3]。有研究將季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）和異常畢赤酵母（Pichia anomala）與釀酒酵母進(jìn)行混合酒精發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)與單一釀酒酵母發(fā)酵相比，乙酸酯類物質(zhì)的含量明顯提高[4]；德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）和釀酒酵母混合發(fā)酵，丙酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸異戊酯等酯類物質(zhì)的含量也均有不同程度的增加，增強(qiáng)了葡萄酒香氣的復(fù)雜度[5]。研究發(fā)現(xiàn)，酯類化合物是構(gòu)成葡萄酒風(fēng)味的重要香氣物質(zhì)，占發(fā)酵揮發(fā)性物質(zhì)的30%左右，尤其是含量較低的乙醇酯可以帶來令人愉悅的水果類香氣[6]，酯類物質(zhì)對(duì)葡萄酒香氣的復(fù)雜度具有重要貢獻(xiàn)[6-7]。

葡萄酒中酯類物質(zhì)的合成、積累過程與葡萄酒中微生物的酯酶活性密切相關(guān)[6]。在葡萄酒釀造過程低pH值條件下，酯酶可以將酸類和醇類化合物通過直接酯化作用轉(zhuǎn)化合成酯類物質(zhì)，也可以水解相應(yīng)的酯類物質(zhì)，改變葡萄酒中一些揮發(fā)性酯類物質(zhì)的含量（如辛酸乙酯、癸酸乙酯、乳酸乙酯、琥珀酸乙酯等），調(diào)節(jié)酯類的合成-水解平衡的狀態(tài)[8-9]。Bardi等[10]研究發(fā)現(xiàn)葡萄汁酒精發(fā)酵期間有較高的酯酶活性，Pénicaud等[11]也研究證實(shí)了釀酒酵母細(xì)胞中酯酶的存在。有研究發(fā)現(xiàn)，非釀酒酵母參與下的混合酒精發(fā)酵能提高酯酶活性，使葡萄酒的香氣更為濃郁持久，風(fēng)格多樣化[3]。Kurita[12]將異常畢赤酵母與釀酒酵母進(jìn)行混合酒精發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了更高活性的乙酸乙酯水解酯酶。近些年來，葡萄酒釀造學(xué)領(lǐng)域關(guān)于酯酶的研究大多數(shù)集中在與蘋果酸-乳酸發(fā)酵階段（M LF）有關(guān)的乳酸桿菌、酒酒球菌等方面[13-14]，雖然啟動(dòng)葡萄酒酒精發(fā)酵中的酵母酯酶活性的研究較多[15-16]，但是關(guān)于非釀酒酵母及其混合發(fā)酵過程中酯酶活性變化的研究尚鮮見報(bào)道。

我國是白酒生產(chǎn)大國，酯類物質(zhì)是白酒主要的呈香物質(zhì)，白酒窖池中擁有非常豐富的非釀酒酵母資源。針對(duì)白酒中非釀酒酵母應(yīng)用于葡萄酒，以及發(fā)酵過程中酯酶活性變化的研究鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將優(yōu)選于川南白酒窖池中高產(chǎn)酯酶的發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母在模擬葡萄汁溶液中進(jìn)行混合酒精發(fā)酵，研究混合發(fā)酵過程中酵母的生長狀況以及C2～C8底物特異性的酯酶活性變化，研究結(jié)果對(duì)于非釀酒酵母在葡萄酒增香釀造中的應(yīng)用具有理論和實(shí)踐的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：川南白酒窖池中分離的35 株非釀酒酵母；法國Laff ort葡萄酒輔料公司的Actiflore F5商業(yè)釀酒酵母。

培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基[17]：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%；W L營養(yǎng)培養(yǎng)基[18]：酵母浸粉0.4%，蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%，儲(chǔ)液A（磷酸二氫鉀5.5 g，氯化鉀4.25 g，氯化鈣1.25 g，硫酸鎂1.25 g，定容至400 m L，121 ℃滅菌20 m in后4 ℃保存）40 m L/1 000 m L，儲(chǔ)液B（氯化鐵0.25 g，硫酸錳0.25 g，定容至100 m L，121 ℃滅菌20 m in后4 ℃保存）1 m L/1 000 m L，儲(chǔ)液C（0.44 g溴甲酚綠溶于10 m L無菌水和10 m L 95%酒精中）1 m L/1 000 m L；液體發(fā)酵培養(yǎng)基[19]：吐溫80 1%，酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，NH4NO30.3%，KH2PO40.4%，MgSO4·7H2O 0.05%。

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉等（均為分析純） 天津化學(xué)試劑有限公司；對(duì)硝基苯基乙酸酯（p-nitropheny l acetate，p-NPA）、對(duì)硝基苯基丁酸酯（p-nitrophenyl butyrate，p-NPB，純度99%）、對(duì)硝基苯基己酸酯（p-nitrophenyl hexanoate，p-NPH，純度98%）、對(duì)硝基苯基辛酸酯（p-nitropheny l oc tanoate，p-NPO，純度97%）北京百靈威科技有限公司；Prem ix Ex TaqTM、6×DNA Load ing Bu ffer、2 000 bp DNA M arker，引物NL 1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’） 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-500高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BX 51光學(xué)顯微鏡 日本O lym pus公司；MP-250B霉菌培養(yǎng)箱、NRY-2102C恒溫培養(yǎng)搖床 上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀儀器有限公司；HH-S6電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；Cary 60紫外-可見分光光度計(jì) 美國瓦里安技術(shù)中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母培養(yǎng)

將35 株非釀酒酵母接入YPD培養(yǎng)基28 ℃活化48 h，按5%接種量轉(zhuǎn)接YPD培養(yǎng)基，在28 ℃、180 r/m in條件下培養(yǎng)24 h，再按10%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/m in搖床培養(yǎng)72 h。將YPD培養(yǎng)48 h的菌株進(jìn)行W L平板劃線，在28 ℃培養(yǎng)3 d后觀察菌落形態(tài)，取液體發(fā)酵液利用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 高產(chǎn)酯酶酵母的篩選

對(duì)川南白酒窖池分離的非釀酒酵母進(jìn)行酯酶活性的測定，篩選出酯酶活性最高的菌株，參照Pérez-M artín等[7]方法，并略有改動(dòng)。具體方法為：取液體發(fā)酵液5 m L，加入等體積的玻璃珠破碎20 m in，8 000 r/m in、4 ℃離心15 m in留上清液得粗酶液。取860 μL pH 5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液，100 μL粗酶液與40 μL的25 mmol/L p-NPB混合均勻，在37 ℃條件下反應(yīng)60 m in，然后加入100 μL的0.5 mol/L的NaOH溶液終止反應(yīng)。對(duì)照組用緩沖液代替粗酶液。每個(gè)樣品3 組平行，在400 nm波長處測定吸光度。一個(gè)單位（U）酯酶活性定義為：37 ℃條件下，每分鐘釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。

1.3.3 優(yōu)選酵母的鑒定

酵母DNA的提取采用石英砂破壁法[20]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polym erase chain reaction，PCR）擴(kuò)增體系（25 μL）：Prem ix Ex TaqTM12.5 μL，引物NL1和NL4各1 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 m in；94 ℃變性1 m in，53 ℃退火1 m in，72 ℃延伸1 m in，循環(huán)36 次；72 ℃保持10 m in。擴(kuò)增產(chǎn)物在電壓120 V，電流100 m A，1%瓊脂糖凝膠上電泳40 m in，置于全自動(dòng)凝膠成像儀內(nèi)進(jìn)行分析拍照。序列分析：用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，合格后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果從GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索，確定優(yōu)選菌株的種屬。

1.3.4 模擬葡萄汁酒精發(fā)酵

1.3.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

模擬葡萄汁培養(yǎng)基[21]：100 g/L葡萄糖，100 g/L果糖，0.2 g/L檸檬酸，3 g/L蘋果酸，2.5 g/L酒石酸氫鉀，1.1 g/L K2HPO4，1.5 g/L M gSO4·7H2O，0.4 g/L CaCl2·2H2O，0.04 g/L H3BO3，0.84 g/L脯氨酸等。

將優(yōu)選酵母與釀酒酵母活化擴(kuò)增培養(yǎng)，酵母數(shù)量達(dá)到1.0×109CFU/m L。設(shè)3 個(gè)混合發(fā)酵處理：兩種酵母同時(shí)接種（S0）、提前48 h接種優(yōu)選酵母（S48）后接種釀酒酵母、提前96 h接種優(yōu)選酵母（S96）后接種釀酒酵母。單一酵母在葡萄汁中的接種量為1.0×106CFU/m L，接種比例為優(yōu)選酵母與釀酒酵母1∶1，以釀酒酵母（S. cerevisiae）和發(fā)酵畢赤酵母（P. fermentans）純發(fā)酵為對(duì)照，22 ℃培養(yǎng)發(fā)酵。

1.3.4.2 酵母計(jì)數(shù)

發(fā)酵中的活菌數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法[22]，酵母總數(shù)采用血球計(jì)數(shù)法[17]。

1.3.4.3 模擬葡萄汁酒精發(fā)酵過程中酯酶活性的測定

模擬葡萄汁酒精發(fā)酵過程中利用不同鏈長的對(duì)硝基苯酯（C2～C8）為底物，測定酯酶活性變化過程，方法同1.3.2節(jié)。底物：p-NPA（C2）、p-NPB（C4）、p-NPH（C6）、p-NPO（C8）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)酯酶菌株的篩選

測定川南白酒窖池中分離的35株非釀酒酵母的酯酶活性，并以釀酒酵母F5為對(duì)照，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，僅有1 株酵母Z9Y-3比F5的酯酶活性高5%，達(dá)到62.12 mU/m L。因此，篩選出高產(chǎn)酯酶的菌株Z9Y-3。

表1 不同酵母的酯酶活性Table 1 Esterase activities of different yeast strains

2.2 優(yōu)選酵母菌株的鑒定

Z9Y-3菌（圖1a）呈米白色，表面粗糙、有褶皺，邊緣粗糙；細(xì)胞（圖1b）呈橢圓狀。根據(jù)測序結(jié)果，利用BLAST軟件與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的菌株進(jìn)行核苷酸同源性對(duì)比，發(fā)現(xiàn)Z9Y-3的基因與發(fā)酵畢赤酵母（P. fermentans）的KU820951.1基因的同源性達(dá)到99%，因此可確定優(yōu)選酵母為發(fā)酵畢赤酵母。

圖1 優(yōu)選酵母菌株Z9Y-3的菌落形態(tài)（a）、細(xì)胞形態(tài)（b）及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖（c）Fig. 1 Colony, cell morphology and gel electrophoresis of PCR am p lified p roduct of isolate Z9Y-3

2.3 模擬葡萄汁酒精發(fā)酵過程中酵母生長動(dòng)力學(xué)

同時(shí)接種處理（圖2A），釀酒酵母快速生長，在第5天達(dá)到穩(wěn)定期，而發(fā)酵畢赤酵母在10 d后僅有少量存在。順序接種處理中（圖2B、C），釀酒酵母接種后分別在第5、6天開始占主導(dǎo)地位，到達(dá)穩(wěn)定期，而發(fā)酵畢赤酵母受到抑制開始下降，但一直存活?；旌习l(fā)酵中無論是釀酒酵母還是發(fā)酵畢赤酵母數(shù)量與釀酒酵母（圖2D）和發(fā)酵畢赤酵母（圖2E）純發(fā)酵相比，都明顯減少，說明兩種酵母之間存在明顯的競爭關(guān)系。圖2F為模擬葡萄汁酒精發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)曲線，使用前9 d的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。啟動(dòng)發(fā)酵時(shí)，單一釀酒酵母發(fā)酵速率快，但在穩(wěn)定期混合發(fā)酵的酵母數(shù)量均超過單一酵母純發(fā)酵，其中提前96 h接種處理酵母數(shù)量最高，約7.9×107CFU/m L。由表2可知，各酵母生長模型的R2達(dá)到0.93～0.99，擬合度較高，能夠較好地反映模擬葡萄汁發(fā)酵過程中酵母的生長規(guī)律。其中釀酒酵母發(fā)酵和發(fā)酵畢赤酵母的各項(xiàng)發(fā)酵參數(shù)（Xm、B、k）相差較大，說明兩種酵母在發(fā)酵過程中的生長模型完全不同。對(duì)于混合發(fā)酵而言，同時(shí)接種（S0）與釀酒酵母發(fā)酵的酵母生長模型較為接近，而順序接種（S48和S96）發(fā)酵模式下的酵母生長模型與釀酒酵母發(fā)酵存在明顯區(qū)別。

圖2 模擬葡萄汁酒精發(fā)酵過程中酵母生長曲線及生長動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 2 Yeasts grow th curves and yeast grow th kinetics

表2 模擬葡萄汁酒精發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 K inetic parameters for alcoholic fermentation of model grape juice

2.4 模擬發(fā)酵過程的酯酶活性

圖3 模擬葡萄汁酒精發(fā)酵中酯酶活性變化與累積過程Fig. 3 Evolution of esterase activities and accumulation process in the alcoholic fermentation of model grape juice

如圖3A所示，在同時(shí)接種的混合發(fā)酵中酯酶活性在啟動(dòng)發(fā)酵時(shí)高于其他處理，而單一釀酒酵母在發(fā)酵第4天酯酶活性達(dá)到最大（22.70 m U/m L），3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的酯酶活性分別在第4天（11.07 m U/m L）、第5天（11.13 m U/m L）、第6天（11.31 m U/m L）達(dá)到最大值，同時(shí)接種處理的酯酶活性累積量最高（66.19 mU/m L）。如圖3B所示，5 個(gè)處理酯酶活性變化趨勢一致，同時(shí)接種（54.23 m U/m L）和提前96 h接種（53.45 mU/m L）酯酶活性相接近，但同時(shí)接種處理的酯酶活性累積量（199.48 mU/m L）高于提前96 h接種處理（178.33 m U/m L），而釀酒酵母純發(fā)酵的酯酶活性（36.03 mU/m L）及累積量（101.04 mU/m L）最低。如圖3C所示，同時(shí)接種的酯酶活性（19.43 mU/m L）雖然高于其他處理，但釀酒酵母純發(fā)酵的酯酶活性累積量（94.40 mU/m L）高于同時(shí)接種處理（93.76 mU/m L）。如圖3D所示，5 個(gè)發(fā)酵處理在第8～11天酯酶活性達(dá)到最大值，發(fā)酵畢赤酵母的酯酶活性（59.88 mU/m L）和酯酶活性累積量（226.04 mU/m L）最高，混合發(fā)酵中同時(shí)接種的酯酶活性累積量最高（213.43 mU/m L）。

不同發(fā)酵處理酯酶活性變化趨勢大致相同（圖3E），在發(fā)酵第5～6天酯酶活性最大，混合發(fā)酵中的最高酯酶活性大致相同，但在發(fā)酵后期同時(shí)接種的酯酶活性累積量達(dá)到最高（圖3F）。研究底物特異性發(fā)現(xiàn)，5 個(gè)處理酯酶活性累積量C8（178～227 mU/m L）＞C4（101～200 m U/m L）＞C6（64～95 m U/m L）＞C2（46～66 mU/m L）。結(jié)合酵母生長動(dòng)力學(xué)（圖2F）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)5 個(gè)處理中在發(fā)酵1～4 d酵母開始緩慢生長，數(shù)量開始增多，酯酶活性也開始增加（圖3A1、B1、C1），而當(dāng)酵母生長到一定數(shù)量，達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)（4～7 d），酯酶活性達(dá)到最大值，隨后酵母開始衰亡，酯酶活性也隨之下降。綜上所述，同時(shí)接種處理為最優(yōu)發(fā)酵方式，酯酶活性累積量最高，表明非釀酒酵母的加入提高了酯酶活性。

3 討 論

受氣候等生態(tài)條件的影響，我國大部分葡萄酒產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄的成熟度在許多年份不夠理想，導(dǎo)致所釀葡萄酒的品種香氣不明顯。通過釀酒微生物和發(fā)酵條件等“后天”因素，可一定程度上彌補(bǔ)我國葡萄酒存在的“先天”香氣不足。采用優(yōu)選非釀酒酵母菌株與釀酒酵母的混合發(fā)酵來提高葡萄酒香氣復(fù)雜度是目前研究開發(fā)的前沿技術(shù)[5]。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)前期從川南白酒窖池中優(yōu)選的一株高產(chǎn)酯酶的發(fā)酵畢赤酵母，研究其與釀酒酵母混合酒精發(fā)酵過程中酵母的生長動(dòng)力學(xué)，探索應(yīng)用該酵母菌株進(jìn)行混合發(fā)酵的最優(yōu)接種方式。Ciani等[23]研究發(fā)現(xiàn)，混合發(fā)酵中釀酒酵母的數(shù)量低于單一釀酒酵母（非釀酒酵母與釀酒酵母接種比例1∶1），但酵母總數(shù)高于單一釀酒酵母純發(fā)酵，其中3 個(gè)同時(shí)接種處理的非釀酒酵母（H.uvarum、T. delbrueckii、Kluyveromyces thermotolerans）在10～14 d開始慢慢衰亡，而順序接種的非釀酒酵母存活時(shí)間更長（21～28 d）。Imma等[24]研究酒精發(fā)酵動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)，單一釀酒酵母的發(fā)酵速率最快，其次是混合發(fā)酵（葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母的接種比例9∶1），而葡萄汁有孢漢遜酵母（H. uvarum）未能完成發(fā)酵，速率最慢。不同的是，Com itini等[2]發(fā)現(xiàn)同時(shí)接種處理的接種比例為1∶1時(shí)，兩種非釀酒酵母（Candida zemplinina、Lachancea thermoto lerans）對(duì)釀酒酵母的生長并無影響，而葡萄汁有孢漢遜酵母的接種比例變大時(shí)（100∶1或10 000∶1），其酵母的存在會(huì)抑制釀酒酵母的生長代謝。Rojas等[4]發(fā)現(xiàn)，同時(shí)接種發(fā)酵中的釀酒酵母在第3天表現(xiàn)出優(yōu)勢，而發(fā)酵畢赤酵母在第5天衰亡。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)接種處理（發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母接種比例1∶1）的釀酒酵母數(shù)量低于單一釀酒酵母發(fā)酵，優(yōu)選的發(fā)酵畢赤酵母從第11天開始衰亡至無法檢出，而順序接種（接種比例1∶1）發(fā)酵中，釀酒酵母在第5～6天開始占主導(dǎo)地位，控制整個(gè)發(fā)酵過程，發(fā)酵畢赤酵母一直存活，其中提前96 h處理酵母數(shù)量最多。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與上述研究有所不同，可能是從川南白酒窖池中優(yōu)選得到的發(fā)酵畢赤酵母，其長期處于白酒釀造環(huán)境，具有不同的生長特性所導(dǎo)致。

混合發(fā)酵主要通過提高發(fā)酵香氣來改善葡萄酒的香氣質(zhì)量，雖然高級(jí)醇是發(fā)酵香氣中含量最高的成分，但酯類是其最重要的呈香物質(zhì)，主要有乙酸酯和乙醇酯兩大類。酒精發(fā)酵過程中除釀酒酵母之外，其他酵母的參與常常會(huì)導(dǎo)致乙酸及其酯類的增加，乙酸乙酯是其中含量最高的酯類。乙酸乙酯的質(zhì)量濃度過高（大于100 mg/L）會(huì)產(chǎn)生一種類似于指甲油的不良?xì)馕禰6]。此外，陳釀過程中過多的乙酸酯類發(fā)生水解，會(huì)產(chǎn)生大量的乙酸，帶來葡萄酒的氧化氣息[25]。葡萄酒中乙醇酯雖然含量較低，但由于其較低的氣味閾值它們具有潛在的香氣活性[6]。例如，中鏈脂肪酸乙酯在葡萄酒中的質(zhì)量濃度低于1.5 mg/L，但是它們的嗅覺閾值較低，微小的含量變化都會(huì)提高其氣味活性，給葡萄酒帶來果香[26-27]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用C2～C8的底物水解特異性研究優(yōu)選菌株的酯類活性，揭示其混合發(fā)酵過程中合成相應(yīng)碳鏈乙醇酯的能力。近些年來，與葡萄酒相關(guān)的酯酶研究主要集中在乳酸桿菌、酒酒球菌等方面，而非釀酒酵母的酯酶研究相對(duì)較少。Sumby等[13]研究乳酸桿菌和酒酒球菌的酯酶水解不同碳鏈長度的底物特異性發(fā)現(xiàn)，C2～C10酯酶均有活性，并且酯酶活性C2＞C4＞C6＞C8＞C10。而Estebantorres等[28]發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌酯酶活性C4＞C8＞C2。Bardi等[10]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中酯酶活性的變化與酵母的生長及辛酸的釋放有關(guān)，但未涉及混合發(fā)酵過程中酯酶活性的變化。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，接種優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母能提高混合發(fā)酵中酯酶活性累積量，尤其是同時(shí)接種處理，最高酯酶活性累積量達(dá)到574 mU/m L。不同碳鏈底物水解能力對(duì)應(yīng)的酯酶活性累積量，C8（178～22 7 m U/m L）＞C4（101～20 0 m U/m L）＞C6（64～95 mU/m L）＞C2（46～66 mU/m L）。結(jié)合混合發(fā)酵過程中酵母生長的動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果，酯酶活性的變化與酵母的生長有關(guān)，酒精發(fā)酵中酵母生長達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)（4～7 d），混合發(fā)酵處理中酯酶活性達(dá)到最大值。本研究中，優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母同時(shí)接種的混合發(fā)酵表現(xiàn)出了較高的C4～C8酯酶活性累積量，具有提高葡萄酒中中鏈脂肪酸乙酯含量的潛力。后續(xù)研究將著重進(jìn)行混合發(fā)酵中酯酶活性、酯類物質(zhì)，以及葡萄酒香氣特征的關(guān)聯(lián)分析。

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Grow th Kinetics and Esterase Activities of Selected Non-Saccharomyces Yeast and Saccharomyces cerevisiae in the Fermentation of Model Grape Juice

LI Ting1, CHEN Jinghua1, MA Decao1, WANG Xingchen1, TAO Yongsheng1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

Objective: The aim of this study was to explore the grow th and esterase activities in the m ixed culture fermentation of non-Saccharomyces yeast and Saccharomyces cerevisiae. Methods: Esterase activities of non-Saccharomyces yeast from southern Sichuan liquor pits were measured in liquid fermentation medium. One yeast strain w ith the highest esterase activity was selected and identified through sequence analysis of the D1/D2 domain of 26S rDNA. Then, the alcoholic fermentation of m ixed cultures of the isolate and S. cerevisiae were performed in model grape juice medium to explore the yeast grow th kinetics and the evolution of esterase activities from substrates w ith diff erent carbon chain lengths(C2–C8). Three experimental groups were set up by inoculating the non-Saccharomyces yeast strain 48 and 96 h before or at the same time as S. cerevisiae, and their pure cultures were used as controls. Results: The isolate was identified as Pichia fermentans. The fermentation rate of pure S. cerevisiae was the fastest. The yeast population in m ixed culture fermentation was higher, especially w ith 96 h sequential inoculation. During fermentation, the highest esterase activities were accumulated w ith simultaneous inoculation (574 mU/mL). The C8substrate accumulated the highest esterase activity (178–227 mU/m L), while the C2accumulated esterase activity was the lowest (46–66 mU/m L). Comparison of the cell grow th kinetics and the evolution of esterase activities during fermentations revealed that esterase activities were correlated with the grow th of yeasts and arrived at the highest value in the stationary grow th phase. Conclusion: The simultaneous inoculation of the isolate and S. cerevisiae in model juice with higher C4-C8accumulated esterase activities has a good application potential for aroma enhancement.

non-Saccharomyces; Pichia fermentans; esterase; model grape juice; yeast grow th kinetics

10.7506/spkx1002-6630-201722010

2016-12-11

“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2016YFD0400504-01）；楊凌示范區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016NY-23）

李婷（1991—），女，碩士研究生，主要從事葡萄酒釀造學(xué)研究。E-mail：li1991681017@126.com

*通信作者：陶永勝（1977—），男，教授，博士，主要從事葡萄酒釀造與風(fēng)味化學(xué)研究。E-mail：taoyongsheng@nwsuaf.edu.cn

TS261.4

A

1002-6630（2017）22-0060-07

李婷, 陳景樺, 馬得草, 等. 優(yōu)選非釀酒酵母與釀酒酵母在模擬葡萄汁發(fā)酵中生長動(dòng)力學(xué)及酯酶活性分析[J]. 食品科學(xué),2017, 38(22): 60-66. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722010. http://www.spkx.net.cn

LI Ting, CHEN Jinghua, MA Decao, et al. Grow th kinetics and esterase activities of selected non-Saccharomyces yeast and Saccharomyces cerevisiae in the fermentation of model grape juice[J]. Food Science, 2017, 38(22): 60-66. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722010. http://www.spkx.net.cn