閻賀靜，時(shí) 月，劉 暢，趙琳琳

（1.河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北 昌黎 066600；2.國(guó)家糧食儲(chǔ)備局武漢科學(xué)研究設(shè)計(jì)院，湖北 武漢 430079）

玫瑰香干紅葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)酵母分離鑒定及其應(yīng)用潛力分析

閻賀靜1，時(shí) 月1，劉 暢1，趙琳琳2

（1.河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北 昌黎 066600；2.國(guó)家糧食儲(chǔ)備局武漢科學(xué)研究設(shè)計(jì)院，湖北 武漢 430079）

為釀造特色玫瑰香干紅葡萄酒，開(kāi)發(fā)本土發(fā)酵劑是目前重要發(fā)展方向。從昌黎產(chǎn)區(qū)玫瑰香干紅葡萄酒自然發(fā)酵醪中共分離得到337 株酵母，通過(guò)WL（Wallerstein laboratory）鑒別培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行分類鑒定、計(jì)數(shù)，將其鑒別為7 大類，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果選取優(yōu)勢(shì)酵母接種至BIGGY（bismuth sulphite glucose glycine yeast）固體培養(yǎng)基，從中進(jìn)一步篩選不產(chǎn)H2S酵母，進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果顯示HBKS-Y1、HBKS-Y3為釀酒酵母，HBKS-Y 2為葡萄汁有孢漢遜酵母?？疾? 株本土酵母釀造因子耐性，發(fā)現(xiàn)3 株酵母對(duì)乙醇、SO2、糖度均具有較高耐性，滿足葡萄酒釀造要求；以商用活性干酵母FX10葡萄汁發(fā)酵為對(duì)照，考察3 株酵母對(duì)玫瑰香葡萄汁單菌、混菌發(fā)酵理化指標(biāo)和香氣成分的影響，3 株本土酵母單菌和混菌發(fā)酵各指標(biāo)（例如：還原糖、酒精度、總酸、揮發(fā)酸、甘油和乙醛含量）均符合干紅葡萄酒釀造標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與HBKS-Y2單菌發(fā)酵相比，3 株酵母混菌發(fā)酵總酸和揮發(fā)酸含量降低，對(duì)葡萄酒有益，且混菌發(fā)酵對(duì)葡萄酒其他理化指標(biāo)沒(méi)有不利影響。本土酵母發(fā)酵尤其是混菌發(fā)酵，表征玫瑰香品種香氣的萜烯醇類物質(zhì)含量明顯高于活性干酵母發(fā)酵。以上結(jié)果表明，3 株本土酵母可以應(yīng)用于玫瑰香干紅葡萄酒的釀造，且3 株酵母混菌發(fā)酵對(duì)突出玫瑰香干紅葡萄酒品種香氣具有一定的應(yīng)用潛力。

玫瑰香干紅葡萄酒；本土酵母；分離；鑒定；釀造特性；混菌發(fā)酵

目前，與法國(guó)、意大利等葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷史悠久的國(guó)家相比，我國(guó)在葡萄酒酵母篩選鑒定及自主復(fù)合發(fā)酵劑研制等應(yīng)用基礎(chǔ)方面的研究相對(duì)薄弱，這使得我國(guó)目前生產(chǎn)葡萄酒所用的菌種主要依賴進(jìn)口，導(dǎo)致葡萄酒同質(zhì)化問(wèn)題嚴(yán)重，這一直成為制約我國(guó)特色葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。因此，大力發(fā)掘我國(guó)本土寶貴的酵母資源，是解決這一瓶頸的關(guān)鍵所在。昌黎是我國(guó)歷史悠久的葡萄與葡萄酒產(chǎn)區(qū)，玫瑰香是昌黎產(chǎn)區(qū)重要的鮮食和釀酒兩用葡萄品種。由玫瑰香釀造的玫瑰型葡萄酒口味清爽優(yōu)雅，具有迷人的玫瑰香氣，果味突出，具有明顯的品種特征，受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。但是，近些年來(lái)由于缺乏產(chǎn)區(qū)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），玫瑰香干紅葡萄酒的釀造多采用進(jìn)口活性干酵母進(jìn)行，導(dǎo)致玫瑰香干紅葡萄酒風(fēng)格單一，品種特色不突出。為了開(kāi)發(fā)地域特色明顯、品種特色突出的玫瑰香干紅葡萄酒，篩選具有優(yōu)良釀造特性的本土酵母是開(kāi)發(fā)特色玫瑰香干紅葡萄酒的重要途徑。

葡萄酒釀造是一個(gè)由多種微生物參與的復(fù)雜生物化學(xué)過(guò)程，其中酵母菌的種類和含量對(duì)葡萄酒的風(fēng)味特征有重要影響。我國(guó)葡萄種植面積廣，各葡萄產(chǎn)區(qū)生態(tài)條件差異大，可生產(chǎn)不同種類和風(fēng)味的釀酒葡萄。但我國(guó)有關(guān)葡萄酒酵母的研究和利用相對(duì)滯后，葡萄酒的釀造多依賴進(jìn)口活性干酵母?；钚愿山湍鸽m發(fā)酵速率高、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，但容易造成葡萄酒口味趨同，導(dǎo)致我國(guó)葡萄酒同質(zhì)化嚴(yán)重，地域和品種特色不突出[1]。傳統(tǒng)的葡萄和葡萄酒產(chǎn)區(qū)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的優(yōu)勝略汰，含有大量適合本地氣候、環(huán)境特點(diǎn)的本土酵母，結(jié)合葡萄品種特點(diǎn)，很易釀造出具有地域和品種特色的葡萄酒[2-3]。隨著對(duì)本土酵母研究的深入，越來(lái)越多的研究證明了本土酵母在釀造地域和品種特色葡萄酒中的應(yīng)用潛力[2,4]。因此，近些年來(lái)采用本土酵母作為發(fā)酵劑成為特色葡萄酒釀造新的發(fā)展方向和研究熱點(diǎn)[5-6]。人們過(guò)去認(rèn)為非釀酒酵母（non-Saccharomyces，NSC）會(huì)對(duì)葡萄酒的釀造帶來(lái)不利影響，隨著對(duì)NSC研究的深入，發(fā)現(xiàn)這種認(rèn)識(shí)并不全面。近年來(lái)的許多研究發(fā)現(xiàn)，NSC對(duì)葡萄酒的風(fēng)味和感官具有積極作用[7-9]。同時(shí)，NSC與S. cerevisiae混菌發(fā)酵還可以調(diào)節(jié)葡萄酒的風(fēng)味[4-5,10]。例如：Metschnikowia pulcherrima和S. cerevisiae共同進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)具有明顯的協(xié)同作用，促進(jìn)了脂肪酸、酯和萜烯等多種芳香物質(zhì)的形成[11]；將Torulaspora delbrueckii與S. cerevisiae同時(shí)或依次接入葡萄醪中進(jìn)行酒精發(fā)酵，提高了葡萄酒中酒精和具果香的酯類物質(zhì)的含量，降低了乙酸的含量[11]，這充分顯示了混菌進(jìn)行酒精發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)。因此，許多學(xué)者建議在S. cerevisiae進(jìn)行酒精發(fā)酵的同時(shí)，添加NSC進(jìn)行混菌發(fā)酵，這樣既避免了葡萄酒酸敗的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)又保留了自然發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)[12]。因此，展開(kāi)本土酵母資源的研究，開(kāi)發(fā)S. cerevisiae和NSC混菌發(fā)酵劑是釀造特色葡萄酒的重要途徑。目前，我國(guó)學(xué)者正開(kāi)展大量研究挖掘本土酵母資源，對(duì)我國(guó)葡萄酒釀造酵母資源的多樣性有了更深一步的了解[4,13-16]。但對(duì)這些酵母資源的開(kāi)發(fā)與利用的研究還處于起步階段，有關(guān)本土酵母的釀造特性和應(yīng)用潛力的相關(guān)研究還較少。目前，國(guó)內(nèi)已有研究者對(duì)昌黎產(chǎn)區(qū)本土酵母資源的多樣性開(kāi)展了研究[17-19]，但對(duì)昌黎本土酵母資源的研究深度、開(kāi)發(fā)和應(yīng)用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，更鮮有從中分離適合玫瑰香干紅葡萄酒釀造的本土酵母的相關(guān)研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)從玫瑰香干紅葡萄酒自然發(fā)酵醪中分離純化優(yōu)勢(shì)酵母，對(duì)玫瑰香葡萄汁進(jìn)行單菌和混菌發(fā)酵，探討所選本土酵母在玫瑰香干紅葡萄酒釀造中的應(yīng)用潛力，為特色玫瑰香干紅葡萄酒釀造用優(yōu)良酵母及混合發(fā)酵劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰香葡萄（Vitis vinifera L. cv. Muscat Hamburg），2014年10月份購(gòu)自河北省秦皇島市昌黎縣葡萄溝。

商用活性干酵母FX10 法國(guó)Laffort公司；甘油和乙醛含量測(cè)定試劑盒 愛(ài)爾蘭Megazyme公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰香葡萄自然發(fā)酵醪中酵母菌的分離、篩選和初步分類鑒定

玫瑰香葡萄除梗、破碎置于無(wú)菌容器，于室溫進(jìn)行自然發(fā)酵。分別于發(fā)酵前、中、后期取樣，樣品梯度稀釋后涂布于酵母浸出物葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，從適宜稀釋度平皿中挑取全部酵母菌落并進(jìn)行計(jì)數(shù)、保藏。將保藏的酵母分別點(diǎn)種于WL（Wallerstein laboratory）鑒別培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察記錄菌落特征，對(duì)不同形態(tài)特征酵母進(jìn)行分類、計(jì)數(shù)[20]。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，選取其中優(yōu)勢(shì)酵母點(diǎn)種于BIGGY（bismuth sulphite glucose glycine yeast）固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)4～7 d，每天觀察菌落顏色變化，根據(jù)顏色深淺判斷菌株H2S產(chǎn)生能力，從中分離不產(chǎn)H2S酵母并保藏。判斷標(biāo)準(zhǔn)：認(rèn)為顏色依次從白色、奶油色、淺棕色、棕色、深棕色、黑色為由淺變深，顏色越深表明H2S產(chǎn)生能力越強(qiáng)[21]。

1.3.2 玫瑰香葡萄自然發(fā)酵醪中優(yōu)勢(shì)酵母的分子鑒定

將保藏菌種接種于斜面PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)2～3 d后挑取菌體至50 μL TaKara裂解緩沖液（Code No.9164），80 ℃變性15 m in，離心，取上清液為模板，選用TaKara試劑盒（Code No.RR178）對(duì)酵母26S rDNA擴(kuò)增并測(cè)序。使用Takara試劑盒（Code No.9762）切膠回收目的片段，以Seq Forward為引物進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.3.3 本土酵母生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將酵母菌接種于100 m L豆芽汁液體培養(yǎng)基，于28 ℃、180 r/m in搖床培養(yǎng)18 h，備用。將50 m L豆芽汁培養(yǎng)基分裝至100 m L三角瓶中高壓滅菌，接入2 m L測(cè)試菌液，28 ℃、180 r/m in恒溫培養(yǎng)。以未接種培養(yǎng)基為空白，從0 h開(kāi)始每4 h取樣至穩(wěn)定期，測(cè)樣品600 nm波長(zhǎng)處吸光度并繪制生長(zhǎng)曲線。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)平行。

1.3.4 本土酵母釀造因子耐性分析

分別將10 μL測(cè)試菌接種至不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（10%、12%、14%和16%），不同SO2質(zhì)量濃度（200、250 mg/L和300 mg/L），不同葡萄糖質(zhì)量濃度（100、200、300、400、500 g/L和600 g/L）的YPD培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72 h，觀察菌株生長(zhǎng)情況，判斷酵母對(duì)乙醇、SO2和糖的耐受性。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)平行。

1.3.5 葡萄汁發(fā)酵實(shí)驗(yàn)及理化指標(biāo)測(cè)定

調(diào)整玫瑰香葡萄汁糖度為21%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），將活性干酵母FX 10、本土酵母單菌或3 株菌共同接種至滅菌葡萄汁，接種量為106個(gè)/m L，20 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵。每隔24 h取樣測(cè)理化指標(biāo)，發(fā)酵液比重低于0.993時(shí)終止發(fā)酵。依據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定發(fā)酵液中還原糖、酒度、總酸、揮發(fā)酸含量，發(fā)酵液中甘油和乙醛含量均采用試劑盒測(cè)定。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)平行。

1.3.6 葡萄酒香氣成分測(cè)定

葡萄汁發(fā)酵結(jié)束后取樣，10 000 r/m in離心15 m in，取上清液冷凍貯藏備用。取5 m L酒樣加入頂空瓶，同時(shí)加入1 g NaCl和10 μL 2-辛醇（內(nèi)標(biāo)），加蓋密封，40 ℃恒溫?cái)嚢?0 m in，將固相微萃取頭插入頂空瓶靜態(tài)吸附30 m in，將萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口，250 ℃熱解吸5 m in。氣相色譜分離條件：HP-5ms石英彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣He（99.99%），流速1.0 m L/m in，不分流；升溫程序：起始溫度為50 ℃，保持1 m in，以3 ℃/m in升至230 ℃，保持10 m in，再以5 ℃/m in升至250 ℃，保持3 min。質(zhì)譜檢測(cè)條件：電子電離源溫度230 ℃，電壓70 eV，接口溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 33～450。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)結(jié)果用SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰香干紅葡萄酒自然發(fā)酵醪中酵母菌的分離鑒定

通過(guò)平板分離，從玫瑰香干紅葡萄酒自然發(fā)醪中共分離得到337 株本土酵母。根據(jù)菌落在WL培養(yǎng)基中的不同形態(tài)和顏色特征，將其初步鑒定為7 大類：S. cerevisiae（2 種）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hansen iaspora uvarum）、膜畢赤氏酵母、假絲酵母和粟酒裂殖酵母，其中一種酵母菌落形態(tài)特征文獻(xiàn)中未提及，暫時(shí)未能鑒定。過(guò)量的H2S會(huì)使葡萄酒呈現(xiàn)臭雞蛋味，因此葡萄酒釀造酵母的篩選應(yīng)避免選用產(chǎn)H2S的酵母。根據(jù)WL培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果，將其中3種優(yōu)勢(shì)酵母分別點(diǎn)種于BIGGY固體培養(yǎng)基，根據(jù)菌落顏色的深淺篩選出3 株不產(chǎn)H2S酵母菌株，分別編號(hào)為HBKS-Y 1、HBKS-Y 2、HBKS-Y 3。對(duì)3 株酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增測(cè)序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)（基因庫(kù)接受號(hào)分別為L(zhǎng)C002242.1、HM 627056.2和KM 055472.1），結(jié)果HBKS-Y1和HBKS-Y3被鑒定為S. cerevisiae，HBKS-Y2被鑒定為H. uvarum，此結(jié)果與WL培養(yǎng)基初步鑒定結(jié)果一致。

2.2 本土酵母HBKS-Y1、HBKS-Y2和HBKS-Y3的釀造特性

2.2.1 本土酵母HBKS-Y1、HBKS-Y2和HBKS-Y 3的生長(zhǎng)曲線

生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明，3 株本土酵母菌生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，都具有顯著的延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期，沒(méi)有衰亡期（圖1），這與文獻(xiàn)有關(guān)酵母生長(zhǎng)曲線的報(bào)道一致[10]。HBKS-Y1、HBKS-Y3和HBKS-Y2的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分別出現(xiàn)在發(fā)酵的8～24 h和4～16 h。表明HBKS-Y2進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較早，但持續(xù)時(shí)間較HBKS-Y 1、HBKS-Y 3短，同時(shí)HBKS-Y 2菌體數(shù)量較HBKS-Y 1和HBKS-Y3低，這一研究結(jié)果與Moreira等[11]關(guān)于H. uvarum的研究結(jié)果一致。

圖1 3 株本土酵母生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Grow th curve of the indigenous yeasts

2.2.2 本土酵母HBKS-Y1、HBKS-Y2和HBKS-Y 3的釀造因子耐性分析

表1 3 株本土酵母釀造因子耐受性Table 1 Tolerance of the indigenous yeast strains

表1數(shù)據(jù)表明，HBKS-Y 1、HBKS-Y2和HBKS-Y3可分別耐受16%、14%和16%的乙醇溶液，均對(duì)酒精具有一定的耐受性，能滿足葡萄酒正常發(fā)酵需求。在SO2質(zhì)量濃度為200～300 mg/L時(shí)3 株菌均能生長(zhǎng)，說(shuō)明3 株酵母對(duì)SO2均具有一定的耐受性，能夠在葡萄酒釀造SO2范圍內(nèi)正常發(fā)酵。3 株本土酵母均能耐受500 g/L以下的葡萄糖質(zhì)量濃度，但不能耐受600 g/L的糖質(zhì)量濃度。

2.2.3 本土酵母HBKS-Y1、HBKS-Y 2和HBKS-Y3發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

HBKS-Y1、HBKS-Y2和HBKS-Y3單菌及3 株酵母混菌發(fā)酵均能在11 d內(nèi)完成（圖2）。發(fā)酵結(jié)束后，活性干酵母發(fā)酵殘?zhí)橇孔畹?，發(fā)酵最徹底（表2）。據(jù)報(bào)道，酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)殘?zhí)橇咳舸笥? g/L則表明發(fā)酵不徹底，有酸敗的危險(xiǎn)[22]。HBKS-Y2單菌發(fā)酵速度相對(duì)較慢，殘?zhí)橇扛哂? g/L，有酸敗危險(xiǎn)；但與HBKS-Y 1、HBKS-Y 3混菌發(fā)酵后，發(fā)酵速度有所提升，殘?zhí)橇拷档停▓D2和表2），說(shuō)明HBKS-Y 2不會(huì)延緩混菌發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，活性干酵母發(fā)酵酒度（乙醇體積分?jǐn)?shù)）最高（12.869%），HBKS-Y 2產(chǎn)乙醇能力介于HBKS-Y 1和HBKS-Y3之間，混菌發(fā)酵對(duì)3 株菌產(chǎn)乙醇能力稍有影響。

圖2 本土酵母發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量Fig. 2 Change in reducing sugar content during w ine fermentation

表2 本土酵母葡萄汁發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab le 2 Physicochem ical properties of w ines fermented w ith the indigenous yeast strains

HBKS-Y2單菌發(fā)酵總酸質(zhì)量濃度最高（4.273 g/L），活性干酵母發(fā)酵最低（4.003 g/L），混菌發(fā)酵對(duì)HBKS-Y 2產(chǎn)酸有抑制作用，有利于總酸含量的降低。GB 15037—2006《葡萄酒》中規(guī)定葡萄酒中總酸與總糖含量的差值不大于2.000 g/L即可，本實(shí)驗(yàn)所有發(fā)酵結(jié)果均符合此要求。各發(fā)酵形式揮發(fā)酸含量均保持在較低水平（表2），符合葡萄酒釀造國(guó)標(biāo)要求，HBKS-Y2單菌發(fā)酵揮發(fā)酸質(zhì)量濃度最高（0.271 g/L），混菌發(fā)酵可顯著降低葡萄酒中揮發(fā)酸含量?；炀l(fā)酵乙醛含量最低，甘油含量?jī)H次于活性干酵母發(fā)酵（表2），表明混菌發(fā)酵對(duì)乙醛和甘油的影響有益于葡萄酒感官和風(fēng)味。

2.3 本土酵母HBKS-Y1、HBKS-Y2和HBKS-Y3發(fā)酵酒樣香氣成分

不同酵母對(duì)玫瑰香葡萄汁進(jìn)行發(fā)酵，氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)和分析酒樣香氣成分。HBKS-Y 3單菌發(fā)酵香氣成分種類最多（49 種），活性干酵母發(fā)酵次之（42 種），3 株本土酵母混菌發(fā)酵香氣成分種類最少（28 種）。

酯類物質(zhì)是葡萄酒最重要的香氣成分，表3分別列出了不同發(fā)酵主要酯類物質(zhì)及其含量。其中活性干酵母發(fā)酵酯類物質(zhì)總量最高（168.500 mg/L），混菌發(fā)酵最低（43.641 mg/L），遠(yuǎn)低于各酵母單菌發(fā)酵，表明混菌發(fā)酵抑制了各酵母的產(chǎn)酯能力，這一點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道H. uvarum可以增加葡萄酒中酯類物質(zhì)含量的報(bào)道并不一致[5]。乙酸乙酯是葡萄酒中最重要和最常見(jiàn)的酯類物質(zhì)，乙酸乙酯含量過(guò)高會(huì)使葡萄酒帶有強(qiáng)烈的醋酸味，對(duì)葡萄酒風(fēng)味不利。HBKS-Y 2發(fā)酵乙酸乙酯質(zhì)量濃度最高（111.028 mg/L），遠(yuǎn)高于其他發(fā)酵形式，混菌發(fā)酵含量?jī)H為HBKS-Y 2單菌發(fā)酵時(shí)的9.46%。表明混菌發(fā)酵抑制乙酸乙酯的形成，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味產(chǎn)生有益影響。

高級(jí)醇為葡萄酒重要香氣成分，含量適當(dāng)時(shí)賦予葡萄酒復(fù)雜感。表3列出了不同發(fā)酵產(chǎn)生的主要高級(jí)醇及其含量。HBKS-Y3發(fā)酵高級(jí)醇總量最高（379.12 mg/L），活性干酵母發(fā)酵次之（378.792 mg/L），HBKS-Y2發(fā)酵最低（248.33 mg/L）?；炀l(fā)酵高級(jí)醇總量為276.74 mg/L，遠(yuǎn)低于S. cerev isia e發(fā)酵，表明混菌發(fā)酵抑制了S. cerevisiae（HBKS-Y1和HBKS-Y3）高級(jí)醇的產(chǎn)生。

表3 不同本土酵母發(fā)酵葡萄酒樣中主要香氣成分含量Table 3 Aroma compounds identified in Muscat wines from different yeast fermentations

萜烯醇類物質(zhì)是玫瑰香葡萄重要的品種香氣。由表4可見(jiàn)，雖然活性干酵母發(fā)酵檢測(cè)出的萜烯醇種類最多（6種），HBKS-Y1單菌發(fā)酵檢測(cè)出的種類最少（4種），但混菌發(fā)酵萜烯醇類物質(zhì)總量最高（416.525 μg/L），活性干酵母發(fā)酵總量最低（293.686 μg/L）。由此可見(jiàn)，本土酵母發(fā)酵尤其是混菌發(fā)酵最有利于提高葡萄酒中萜烯醇類物質(zhì)的含量。

表4 不同本土酵母發(fā)酵葡萄酒樣中萜類物質(zhì)含量Tab le 4 Terpene concentrations in M uscat w ines from different indigenous yeasts fermentation

3 討 論

3.1 NSC對(duì)葡萄酒釀造的影響

本實(shí)驗(yàn)從玫瑰香干紅葡萄酒自然發(fā)酵醪中分離出2 株S. cerevisiae和1 株H. uvarum，為玫瑰香干紅葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)酵母。參與葡萄酒釀造的酵母主要有兩大類：S. cerevisiae和NSC。在葡萄酒釀造過(guò)程中，S. cerevisiae將糖轉(zhuǎn)化為乙醇和CO2，是葡萄酒釀造的主要完成者。通常認(rèn)為，發(fā)酵初期NSC占主導(dǎo)地位，隨著發(fā)酵的進(jìn)行S. cerevisiae迅速替代NSC直至酒精發(fā)酵結(jié)束[12]。過(guò)去認(rèn)為，NSC通常會(huì)產(chǎn)生較高含量的揮發(fā)酸、乙醛等不良風(fēng)味物質(zhì)，同時(shí)還會(huì)引起葡萄酒的酸敗，對(duì)葡萄酒釀造不利[23-24]。所以，現(xiàn)代化的葡萄酒釀造只使用單一活性干酵母作為葡萄酒發(fā)酵劑。隨著對(duì)NSC研究的深入，發(fā)現(xiàn)許多NSC對(duì)葡萄酒的風(fēng)味和感官具有積極作用[25-27]。因此，越來(lái)越多的研究關(guān)注NSC在葡萄酒釀造過(guò)程中的作用。

H. uvarum是葡萄酒自然發(fā)酵醪中最常見(jiàn)的NSC，同時(shí)也是各葡萄酒產(chǎn)區(qū)含量較高的NSC之一[4,16]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為H. uvarum發(fā)酵效率低、發(fā)酵不徹底、不耐酒精，且生成較多的醋酸，是對(duì)葡萄酒質(zhì)量不利的菌種[23]。有研究報(bào)道，尖端酵母（H. uvarum屬于尖端酵母）與S. cerevisiae混菌發(fā)酵，會(huì)對(duì)S. cerevisiae生長(zhǎng)繁殖不利，從而導(dǎo)致發(fā)酵延滯甚至酸敗[23,28]。但有研究發(fā)現(xiàn)，H. uvarum與S. cerevisiae混菌發(fā)酵可以增加葡萄酒的香氣復(fù)雜性，有利于葡萄酒的質(zhì)量提高[5]。近些年來(lái)，由于較高的產(chǎn)酯能力及其對(duì)葡萄酒風(fēng)味和質(zhì)量的有利作用，H. uvarum越來(lái)越受研究者的關(guān)注[5,23]。

為篩選適合玫瑰香干紅葡萄酒釀造發(fā)酵劑，本研究重點(diǎn)考察3 株酵母的葡萄酒釀造特性，并以商用活性干酵母FX10發(fā)酵為對(duì)照，初步探討3 株本土酵母混菌發(fā)酵應(yīng)用于玫瑰香干紅葡萄酒釀造的可能性，及其對(duì)于突出玫瑰香干紅葡萄酒品種香氣的應(yīng)用潛力。

3.2 本土酵母對(duì)葡萄酒釀造因子耐受性分析

在葡萄酒的釀造中，酵母酒精耐受性低可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵緩慢甚至中止，因此具有較高酒精耐性是保證發(fā)酵順利進(jìn)行的前提條件。本研究考察的3 株酵母均對(duì)酒精具有一定的耐受性，可以滿足葡萄酒的正常發(fā)酵需求。但S. cerevisiae HBKS-Y 1和HBKS-Y 3對(duì)乙醇耐受性高于HBKS-Y2，這一結(jié)果與一些文獻(xiàn)中關(guān)于H. uvarum酒精耐受性低的報(bào)道一致[11,23]。在葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程中，加入適量的SO2可以抑制有害微生物，同時(shí)可達(dá)到抗氧化、護(hù)色等作用。優(yōu)良葡萄酒酵母需對(duì)SO2具有一定的耐受性。本實(shí)驗(yàn)獲得的3 株菌對(duì)SO2具有一定的耐受性，能夠在葡萄酒釀造SO2范圍內(nèi)正常發(fā)酵。葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中存在的一些NSC，本身發(fā)酵能力差、不能單獨(dú)完成酒精發(fā)酵，同時(shí)對(duì)乙醇、SO2的耐性低，這是導(dǎo)致NSC在酒精發(fā)酵過(guò)程中數(shù)量降低甚至消失的原因之一。但也有些研究提出酒精發(fā)酵時(shí)NSC的衰亡是S. cerevisiae本身引起的，而不是乙醇的作用[29-30]；尤其是現(xiàn)在還分離到一些NSC，它們對(duì)酒精耐性遠(yuǎn)大于曾經(jīng)報(bào)道的數(shù)據(jù)，更說(shuō)明酒精并不是引起NSC衰亡的關(guān)鍵因素[31]。本實(shí)驗(yàn)所篩選到的HBKS-Y2，是玫瑰香干紅葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)酵母，WL培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果表明，該菌存在于自然界過(guò)程中的各個(gè)時(shí)期，說(shuō)明HBKS-Y 2對(duì)葡萄酒釀造因子具有一定的耐性，具有一定的應(yīng)用潛力。

3.3 本土酵母混菌發(fā)酵對(duì)葡萄酒理化指標(biāo)的影響

目前的一些研究發(fā)現(xiàn)，混菌發(fā)酵過(guò)程中酵母間會(huì)產(chǎn)生不利影響，例如：某些NSC分泌的中長(zhǎng)鏈脂肪酸對(duì)S. cerev isiae有抑制作用[24]。同時(shí)，有研究表明S. cerevisiae代謝產(chǎn)物中某些蛋白或抗菌肽AMP可能是混菌發(fā)酵過(guò)程中導(dǎo)致NSC提前衰亡的主要原因[31-34]。以上研究說(shuō)明，順利完成混菌發(fā)酵并非易事，需對(duì)酵母間的交互作用進(jìn)行有效控制。但需要確定混菌發(fā)酵過(guò)程中S. cerevisiae和NSC的交互作用機(jī)理，但目前尚無(wú)明確的研究結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)中3 株優(yōu)勢(shì)酵母單菌和混菌發(fā)酵結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBKS-Y 2與HBKS-Y 1、HBKS-Y 3混菌發(fā)酵相互之間沒(méi)有不利影響，發(fā)酵液中酒精度、殘?zhí)橇?、總酸和揮發(fā)酸含量均在干紅葡萄酒正常發(fā)酵范圍之內(nèi)（表2），表明3 株本土酵母單菌或混菌均能順利完成酒精發(fā)酵。雖然HBKS-Y 2單菌發(fā)酵揮發(fā)酸含量較高，但與HBKS-Y 1、HBKS-Y 3混菌發(fā)酵后揮發(fā)酸總量降低顯著，低于各單菌發(fā)酵?？梢?jiàn)3 株本土酵母混菌發(fā)酵抑制了HBKS-Y2揮發(fā)酸物質(zhì)的合成，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味起積極作用，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的混菌發(fā)酵過(guò)程中，H. uvarum不會(huì)引起揮發(fā)酸含量增高的結(jié)果一致[5,27]。作者分析認(rèn)為，3 株菌來(lái)自于昌黎玫瑰香干紅葡萄酒自然發(fā)酵醪，是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期優(yōu)勝劣汰存活、適應(yīng)相應(yīng)環(huán)境的優(yōu)勢(shì)酵母，相互之間具有一定的適應(yīng)性，這對(duì)釀造地域特色葡萄酒是非常有利的，是開(kāi)發(fā)特色葡萄酒釀造發(fā)酵劑的優(yōu)良資源。以上分析表明，從昌黎產(chǎn)區(qū)玫瑰香干紅葡萄酒自然發(fā)酵醪中分離獲得的葡H. uvarum具有優(yōu)良的釀造特性，可與本土S. cerevisiae進(jìn)行混菌發(fā)酵。

3.4 本土酵母混菌發(fā)酵對(duì)葡萄酒香氣的影響

香氣是葡萄酒產(chǎn)品風(fēng)格和特征差異的重要方面。參與酒精發(fā)酵的酵母菌種類和數(shù)量對(duì)葡萄酒的香氣最為重要。不同酵母的生理活性及代謝過(guò)程不同，對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的影響不同。HBKS-Y1和HBKS-Y3單菌發(fā)酵酒樣香氣成分種類遠(yuǎn)多于HBKS-Y2單菌和混菌發(fā)酵，說(shuō)明混菌發(fā)酵中3 株酵母間產(chǎn)生了交互作用，影響了某些香氣成分的合成，這一研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道混菌發(fā)酵可增加葡萄酒風(fēng)味的復(fù)雜性并不太一致[27,32]，具體原因需進(jìn)一步研究。

乙酸乙酯是葡萄酒中主要酯類物質(zhì)，質(zhì)量濃度為150～200 mg/L時(shí)會(huì)給葡萄酒帶來(lái)強(qiáng)烈的醋酸味[30]。尖端酵母，尤其是K. apiculata發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生較高含量的乙酸和乙酸乙酯已被廣泛報(bào)道[5,35-37]。這是之所以一些研究者盡量避免使用尖端酵母作為葡萄酒發(fā)酵劑的主要原因之一。表3的數(shù)據(jù)表明，與HBKS-YI、HBKS-Y 3單菌發(fā)酵相比，HBKS-Y2單菌發(fā)酵確實(shí)產(chǎn)生了大量的乙酸乙酯，但與HBKS-Y1和HBKS-Y3混菌發(fā)酵后，乙酸乙酯含量顯著降低，說(shuō)明3 株本土酵母混菌發(fā)酵抑制了HBKS-Y 2乙酸乙酯的生成，對(duì)葡萄酒香氣產(chǎn)生有益作用。

文獻(xiàn)報(bào)道，葡萄酒中高級(jí)醇總量低于300 m g/L時(shí)賦予葡萄酒愉悅的香氣，當(dāng)其總量高于400 m g/L時(shí)對(duì)葡萄酒香氣產(chǎn)生不利影響[38]。經(jīng)檢測(cè)，活性干酵母、HBKS-Y 1、HBKS-Y 3單菌發(fā)酵高級(jí)醇總量遠(yuǎn)高于HBKS-Y 2單菌發(fā)酵，3 株酵母混菌發(fā)酵后高級(jí)醇含量雖高于HBKS-Y 2單菌發(fā)酵，但是卻遠(yuǎn)低于HBKS-Y 1、HBKS-Y 3和活性干酵母發(fā)酵，表明混菌發(fā)酵過(guò)程中，HBKS-Y 2的存在與S. cerevisiae產(chǎn)生了交互作用，抑制了高級(jí)醇生產(chǎn)，對(duì)于控制酒樣中高級(jí)醇的含量產(chǎn)生了積極作用。此結(jié)果與M o reira等[11]報(bào)道的尖端酵母（H. guilliermondii和H. uvarum）與S. cerevisiae混菌發(fā)酵可以降低葡萄酒中高級(jí)醇含量的研究結(jié)果一致。

葡萄酒香氣成分中，萜烯類物質(zhì)含量雖低，但其嗅覺(jué)閾值低，氣味活性很高，且呈香具疊加效應(yīng)，因此萜烯類物質(zhì)是葡萄酒中重要的呈香成分[39]。玫瑰香葡萄是玫瑰香型葡萄的代表品種，萜烯類物質(zhì)是玫瑰香葡萄的主要品種香氣物質(zhì)，其中橙花醇、香葉醇、里哪醇、香茅醇、松油醇等萜烯醇是最主要的萜烯物質(zhì)，該類物質(zhì)含量越高葡萄酒的品種香氣越突出。表4的數(shù)據(jù)表明，活性干酵母發(fā)酵萜烯醇類物質(zhì)種類最多，但本土酵母混菌發(fā)酵酒樣中萜烯醇總量卻最高，HBKS-Y1和HBKS-Y2單菌發(fā)酵酒樣中萜烯醇物質(zhì)總量次之，而商用活性干酵母發(fā)酵萜烯醇含量最低。由此可見(jiàn)，酒精發(fā)酵選用菌種對(duì)葡萄品種香氣的含量具有重要影響。以上分析表明，本土酵母尤其是混菌發(fā)酵有利于增加葡萄酒中萜烯醇類物質(zhì)的含量，從而更有利于突出玫瑰香干紅葡萄酒的品種香氣。傳統(tǒng)的葡萄和葡萄酒產(chǎn)區(qū)的本土酵母，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的優(yōu)勝劣汰，適應(yīng)了本土氣候和環(huán)境，許多研究證明本土酵母更加有益于釀造品種特色突出的葡萄酒[2-3]。本研究結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

此外，葡萄中的萜類物質(zhì)以糖苷結(jié)合態(tài)形式存在，不具揮發(fā)性，不能呈現(xiàn)香氣。釀酒過(guò)程中，S. cerevisiae和葡萄漿果內(nèi)源糖苷酶可以催化部分結(jié)合態(tài)萜類物質(zhì)，但葡萄酒高糖量、高酒精、低pH值等釀造條件，限制了內(nèi)源糖苷酶的活性[40]，葡萄酒釀造過(guò)程中結(jié)合態(tài)萜類物質(zhì)的水解并不充分。新發(fā)酵生成的葡萄新酒中還存在大量的結(jié)合態(tài)香氣糖苷。因此，在釀造過(guò)程中提高糖苷水解酶的活性，是突出葡萄酒品種香氣的有效途徑，尤其適用于萜烯類物質(zhì)含量較高的麝香類葡萄品種的葡萄酒。近些年來(lái)，隨著對(duì)NSC研究的深入，發(fā)現(xiàn)NSC較S. cerevisiae含有更多的糖苷水解酶，將其應(yīng)用于葡萄酒的釀造，對(duì)于促進(jìn)葡萄酒中結(jié)合態(tài)糖苷香氣物質(zhì)的水解，增加游離香氣成分含量和種類起到積極促進(jìn)作用[41-42]。表4數(shù)據(jù)表明，混菌發(fā)酵后萜烯醇類物質(zhì)總量顯著升高，很可能與HBKS-Y 2具有一定的糖苷水解酶活性有關(guān)。本課題組會(huì)進(jìn)一步考察HBKS-Y 2的水解酶系、糖苷酶活性及其釀造因子耐性，以揭示該NSC對(duì)玫瑰香干紅葡萄酒香氣的影響機(jī)制，為葡萄酒香氣的調(diào)控等相關(guān)研究提供參考數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從昌黎玫瑰香干紅葡萄酒自然發(fā)酵醪中分離獲得3 株優(yōu)勢(shì)酵母，對(duì)其釀造特性及單菌、混菌發(fā)酵進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)，3 株本土酵母單菌和混菌發(fā)酵均符合干紅葡萄酒釀造的標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)，與H. uvarum HBKS-Y2單菌發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵降低總酸、揮發(fā)酸及乙酸乙酯含量；與S. cerevisiae HBKS-Y1和HBKS-Y3單菌發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵酒樣高級(jí)醇含量顯著降低；雖然混菌發(fā)酵香氣種類比活性干酵母發(fā)酵較少，但本土酵母發(fā)酵，無(wú)論單菌還是混菌發(fā)酵，表征玫瑰香葡萄品種香氣的萜烯醇類物質(zhì)總量均高于活性干酵母發(fā)酵。以上結(jié)果表明，3 株本土酵母混菌發(fā)酵，在玫瑰香干紅葡萄酒釀造中具有一定的應(yīng)用潛力，有助于突出玫瑰香干紅葡萄酒的品種香氣。

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Screening, Identification and Potential Use of Indigenous Yeasts from Muscat W ine Spontaneous Fermentation

YAN Hejing1, SHI Yue1, LIU Chang1, ZHAO Linlin2
(1. College of Food Science & Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Changli 066600, China;2. Wuhan Scientific Research & Design Institute, State Administration for Grain Reservation, Wuhan 430079, China)

Developing indigenous yeast strains is currently one of the most important trends in the production of featured Muscat w ine. In this work, 337 yeasts were isolated by using PDA medium from spontaneously fermented Muscat w ine,and then they were identified, counted and classified into seven groups by using Wallerstein laboratory (WL) solid medium.According to the results of yeast counting, the dominant strains were determined and then they were inoculated to bismuth sulphite glucose glycine yeast (BIGGY) agar to select yeast strains w ithout H2S production ability, and the selected strains were molecularly identified for further characterization of enological traits. The physicochemical indexes and volatile compounds of Muscat w ine fermented w ith these yeasts in mono-cultures or co-cultures were studied. Based on our experimental results, the potential of using these autochthonous yeast strains in Muscat w ine production were discussed.Out of 337 yeast strains, three were selected for less or no H2S production, which were cataloged as HBKS-Y1, HBKS-Y2 and HBKS-Y 3, and molecularly identified as Saccharomyces cerevisiae, Hanseniaspora uvarum and Saccharomyces cerevisiae, respectively. The alcohol, SO2and sugar tolerance of the 3 yeast strains were high and met the requirements of w ine vinification. When they were used to must fermentation either in mono- or co-culture, the physicochem ical indexes including reducing sugar, alcohol, total acids, volatile acids, glycerol and acetaldehyde contents were w ithin the range for dry red w ine. In mono-culture fermentation, HBKS-Y2 was a strong producer of total and volatile acids. When HBKS-Y2 was co-cultured w ith HBKS-Y 1 and HBKS-Y 3, a synergistic effect was observed, which resulted in a decrease in total acids content and a significant decrease in volatile acids content compared w ith single culture of HBKS-Y2 while havingno disadvantageous effects on the physicochem ical indexes of w ine. Furthermore, significantly higher contents of terpene alcohols, the characteristic aroma compounds of Muscat w ine, were produced by fermentation w ith indigenous yeasts especially in co-cultures compared w ith dry active yeast. These results suggest that HBKS-Y1, HBKS-Y2, and HBKS-Y3 can be used as a fermentation starter for Muscat w ine, and their co-culture has potential use in improving the variety-specific aroma of Muscat w ine.

Muscat w ine; indigenous yeast; screening; identification; enological characteristics; co-culture fermentation

2017-01-04

河北省教育廳項(xiàng)目（QN2014143）；河北科技師范學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目；秦皇島市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（201101A176）

閻賀靜（1978—），女，副教授，博士，主要從事釀造微生物學(xué)研究。E-mail：yhj2203yhj@163.com

10.7506/spkx1002-6630-201722018

TS262.6

A

1002-6630（2017）22-0117-08

閻賀靜, 時(shí)月, 劉暢, 等. 玫瑰香干紅葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)酵母分離鑒定及其應(yīng)用潛力分析[J]. 食品科學(xué), 2017,38(22): 117-124. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722018. http://www.spkx.net.cn

YAN Hejing, SHI Yue, LIU Chang, et al. Screening, identification and potential use of indigenous yeasts from Muscat w ine spontaneous fermentation[J]. Food Science, 2017, 38(22): 117-124. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722018. http://www.spkx.net.cn