趙 龍，周池虹伶，趙謀明，崔 春*，王 煒

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

解淀粉芽孢桿菌SW JS22和米曲霉混合制曲在醬油發(fā)酵中的應(yīng)用

趙 龍，周池虹伶，趙謀明，崔 春*，王 煒

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

以解淀粉芽孢桿菌SW JS22和米曲霉為發(fā)酵菌株，考察米曲霉單獨(dú)制曲發(fā)酵、米曲酶和解淀粉芽孢桿菌曲料混合發(fā)酵以及雙菌種混合制曲發(fā)酵對(duì)醬油理化指標(biāo)及風(fēng)味的影響。結(jié)果表明：曲料混合發(fā)酵的醬油氨基酸轉(zhuǎn)化率有較大提高，色率和色深物質(zhì)均低于米曲霉單獨(dú)制曲發(fā)酵的醬油和雙菌種混合制曲發(fā)酵的醬油，曲料混合發(fā)酵醬油和雙菌種混合制曲發(fā)酵的醬油谷氨酸含量有明顯提高。采用氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)比分析3 種不同曲料發(fā)酵醬油的風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果表明：3 種醬油的風(fēng)味物質(zhì)種類差別不明顯，重要風(fēng)味成分在3 種醬油中均有檢出，曲料混合發(fā)酵的醬油酸類物質(zhì)的含量最低。

解淀粉芽孢桿菌SWJS22；雙菌種混合制曲發(fā)酵；曲料混合發(fā)酵

醬油是廣受人們歡迎的傳統(tǒng)調(diào)味品，其制作原料主要包括豆粕、大豆、小麥、面粉、麩皮等。在米曲霉等微生物分泌的酶系作用下，大分子的淀粉和蛋白質(zhì)被降解成多種糖類、小分子肽和氨基酸等小分子物質(zhì)，并經(jīng)乳酸菌、酵母菌在后期進(jìn)一步發(fā)酵形成的風(fēng)味獨(dú)特、色澤誘人、滋味鮮美的調(diào)味液[1-2]。目前國(guó)內(nèi)90%以上的醬油制造商使用米曲霉滬釀3.042菌種進(jìn)行制曲，但單一菌種制曲容易導(dǎo)致分泌酶系不全，原料利用率較低，醬油原油鮮味不足[3]。

為提高醬油品質(zhì)和生產(chǎn)效率，有不少研究者對(duì)混菌制曲方面進(jìn)行了研究。徐歡歡等[4]通過(guò)往米曲霉中加入適量的糖化增香曲，混合制曲來(lái)釀造醬油，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵58 d時(shí)，混合制曲釀造醬油的還原糖、總氮、氨氮、氨基酸轉(zhuǎn)化率較純米曲霉制曲醬油分別增加了5%、12%、14%和9%，且紅黃指數(shù)都有明顯提高。Feng Jie等[5]在醬油保溫發(fā)酵30 d和60 d時(shí)兩次接入埃切假絲酵母，發(fā)酵結(jié)束時(shí)其氨氮和無(wú)鹽固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較對(duì)照組分別高出了23.1%和17.6%，且游離氨基酸和香氣物質(zhì)含量大幅度提高。韓國(guó)全明希等[6]將一株從傳統(tǒng)醬曲中分離出來(lái)的高產(chǎn)蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）CJ3-27和米曲霉（Aspergillus oryzae）CJ KG混合制造韓式醬曲，將解淀粉芽孢桿菌運(yùn)用到醬料產(chǎn)業(yè)，使蛋白質(zhì)分解酶效價(jià)得到改善，氨基酸態(tài)氮含量增加，醬香和滋味得到提高，大醬的整體口味得到改善。Lee等[7]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，醬醪發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌和酵母菌通過(guò)不同的代謝途徑，生成不同的風(fēng)味物質(zhì)，進(jìn)而可以接種乳酸菌和酵母菌來(lái)改善醬油風(fēng)味。

華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生物技術(shù)團(tuán)隊(duì)[8-9]在深海海泥中篩選出一株高產(chǎn)蛋白酶和谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢桿菌SW JS22。本實(shí)驗(yàn)利用解淀粉芽孢桿菌SW JS22豐富的酶系，將其運(yùn)用到高鹽稀態(tài)醬油的制曲過(guò)程中，采用復(fù)合菌制曲發(fā)酵和曲料混合發(fā)酵兩種方式制備醬油，從滋味和香氣兩方面全面評(píng)價(jià)解淀粉芽孢桿菌在醬油發(fā)酵中的應(yīng)用，旨在改善醬油品質(zhì)，并拓寬解淀粉芽孢桿菌的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從中國(guó)南海海泥中篩選出的解淀粉芽孢桿菌SWJS22（B. amyloliquefaciens SWJS22，CGMCC No. 8425），由華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供[8]。菌種保存于斜面培養(yǎng)基（4 ℃），每3個(gè)月轉(zhuǎn)接一次。

斜面培養(yǎng)基：牛肉浸膏0.4%，蛋白胨0.6%，浸出酵母粉0.2%，氯化鈉0.5%，瓊脂2.0%，pH 7.0；ZoBell2261E：酪蛋白1.0%，牛肉浸膏0.3%，氯化鈉0.5%，磷酸二氫鉀0.2%，瓊脂1.5%，pH 7.4±0.1；種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0%，酵母抽提物0.5%，蔗糖1.0%，F(xiàn)e2(SO4)3·X H2O 0.01%，M nSO4·H2O 0.000 1%，CuSO4·5H2O 0.000 1%，pH 7.0。

豆粕、小麥粉、去離子水、食鹽均為市購(gòu)。氯化鈉天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酪蛋白（干酪素）上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉、硼酸 天津市福晨化學(xué)試劑廠；甲醛 廣東光華化學(xué)有限公司；硫酸 江蘇省強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；鹽酸 廣東省東紅化工廠；氫氧化鈉 天津市明亮化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

VARIOSKAN FLASH型全波長(zhǎng)掃描多功能讀數(shù)儀美國(guó)賽默飛世爾科技公司；3-18K型臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；KDC-2C型微量凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；KDN-40消化爐 上海新嘉電子有限公司；Tim840自動(dòng)單位滴定儀 雷迪美特公司；UV-2100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼克（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 主要工藝流程

米曲霉單獨(dú)制曲發(fā)酵得到的醬油，簡(jiǎn)稱為空白樣；解淀粉芽孢桿菌種子液-涼豆粕比6∶100（m L/g），米曲酶和解淀粉芽孢桿菌復(fù)合制曲發(fā)酵得到的醬油，簡(jiǎn)稱為雙菌種發(fā)酵樣；米曲霉制曲曲料與解淀粉芽孢桿菌制曲曲料質(zhì)量比6∶4混合曲料發(fā)酵得到的醬油，簡(jiǎn)稱為混曲樣。醬油制備工藝如圖1所示。

圖1 醬油制備工藝流程圖Fig. 1 Flow chart of soy sauce preparation p rocess

1.3.2 基本理化指標(biāo)測(cè)定

蛋白酶活力的測(cè)定：參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》，1 m L酶液或1 g干質(zhì)量曲料在40 ℃、pH 7.0的條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個(gè)酶活力單位（U）。淀粉酶活力的測(cè)定：采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法，參照張艷芳等[10]的測(cè)定方法。

總氮含量的測(cè)定：凱氏定氮法，參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定：甲醛滴定法，參照參考GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》。谷氨酸含量的測(cè)定：分別測(cè)定0.006、0.010、0.020、0.040、0.060 g/L的L-谷氨酸質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的吸光度，以L-谷氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；分別吸取酶解反應(yīng)后試樣濾液和空白樣實(shí)驗(yàn)濾液20 μL，用R-biopharm公司的L-谷氨酸檢測(cè)試劑盒，在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其L-谷氨酸含量。

1.3.3 頂空-固相微萃取法提取醬油中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)

參考Feng Yunzi等[11]的方法。樣品的準(zhǔn)備：將8 m L的醬油裝入20 m L氣質(zhì)瓶中，并加入1 g氯化鈉，使其鹽質(zhì)量濃度達(dá)到飽和；進(jìn)樣前，加入內(nèi)標(biāo)20 μL的2-甲基-3-庚酮甲醇溶液（1.724 mg/L）進(jìn)待測(cè)樣品中。固相微萃取的方法：45 ℃保溫20 m in，采用CAR/PDMS萃取頭45 ℃萃取40 m in，萃取結(jié)束后，萃取頭插入進(jìn)樣口解吸3 m in。萃取頭在使用前以270 ℃老化1 h，每個(gè)樣品間萃取頭在270 ℃老化10 m in以防止污染。

1.3.4 頂空-固相微萃取分離條件

色譜柱：T R-5 M S彈性石英毛細(xì)色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；起始溫度40 ℃，保持2 m in，以5 ℃/m in升至120 ℃，保持2 m in，再以7 ℃/m in升至220 ℃，保持5 m in；載氣：高純氦氣；流量：1.0 m L/m in；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；分流比：10∶1；電子電離源，電子能量70 eV；電子倍增器電壓350 V；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量范圍m/z 35～350；掃描速率3.00 scans/s。

1.3.5 風(fēng)味化合物的定性、定量

參考Feng Yunzi等[11]的方法。根據(jù)NIST08數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)化合物進(jìn)行鑒定，化合物的保留指數(shù)（retention index，RI）通過(guò)正構(gòu)烷烴（C6～C26）計(jì)算得到，定量分析采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行。氣相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Xcalibur軟件（版本2.0）分析處理。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3 組平行樣品的平均值，表示為 ±s，使用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用SPSS 22.0對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本T檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同醬油曲料酶活力的比較

醬油生產(chǎn)中將大曲浸入鹽水后形成的混合物，在日本醬油的生產(chǎn)中稱為“morom i”，在我國(guó)生產(chǎn)的高鹽稀態(tài)醬油中稱為“醬醪”。在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)約17%條件下，米曲霉生長(zhǎng)受抑制甚至失活，而其生成的酶系能繼續(xù)參與降解作用，形成醬油獨(dú)特的色、香、味。不同醬油曲料酶活力的結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各種醬油曲料的酶活力Table 1 Enzyme activities of different soy sauce kojis

蛋白酶是醬油釀造的關(guān)鍵酶類，其作用是將大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)分解成小分子蛋白、多肽和氨基酸。蛋白酶活力是制曲工藝中的關(guān)鍵指標(biāo)，關(guān)系到醬油曲料的原料利用率以及醬油的品質(zhì)。在高鹽稀態(tài)醬油的釀造過(guò)程中，最初鹽水的pH值為中性，大曲入池后，pH值顯著下降至6左右，因此中性蛋白酶活力是考察重點(diǎn)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值不斷下降[12]，致使醬油發(fā)酵過(guò)程中體系的pH值偏低，因此考察酸性蛋白酶活力對(duì)后期發(fā)酵工藝具有實(shí)際意義。如表1所示，空白樣曲料和混曲樣曲料的中性蛋白酶活力沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），而雙菌種發(fā)酵樣曲料中性蛋白酶活力最高，與其他醬油曲料有顯著性差異（P＜0.05）。酸性蛋白酶活力表現(xiàn)為：雙菌種發(fā)酵樣曲料＞空白樣曲料＞混曲樣曲料，且差異顯著（P＜0.05），雙菌種發(fā)酵樣曲料的酸性蛋白酶活力是混曲樣曲料的1.85 倍。

淀粉酶作為醬油成曲的主要酶系之一，能夠使原料中的淀粉糖化，進(jìn)而為米曲霉、酵母、乳酸菌等微生物的生長(zhǎng)提供碳源，另外，糖化的后的淀粉還是醬油甜味的組成成分。淀粉酶有α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、1,4-葡萄糖苷酶、1,6-糊精酶、麥芽糖酶等，這些酶分別作用于淀粉分子中的不同部位，生成葡萄糖、麥芽糖、極限糊精等小分子糖類，且這些酶既單獨(dú)作用又會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，因此，本實(shí)驗(yàn)采用的測(cè)定方法為測(cè)定綜合淀粉酶活力。淀粉酶活力之間有顯著性差異（P＜0.05），酶活力高低的順序?yàn)椋弘p菌種發(fā)酵樣曲料＞空白樣曲料＞混曲樣曲料?？瞻讟忧系牡矸勖富盍_(dá)到55.08 U/g，而解淀粉芽孢桿菌固體發(fā)酵得到的曲料，其淀粉酶活力為39.51 U/g，低于米曲霉的淀粉酶活力，解淀粉芽孢桿菌的淀粉酶系與米曲霉的淀粉酶系在酶學(xué)特性上有很大差異[13]。米曲霉和解淀粉芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵制曲得到的醬油曲料，既有米曲霉的淀粉酶系，又有解淀粉芽孢桿菌的淀粉酶系，故其淀粉酶活力值最高，能達(dá)到58.40 U/g，且差異顯著（P＜0.05）。

谷氨酰胺酶可催化谷氨酰胺水解生成谷氨酸，而谷氨酸又是醬油中重要的鮮味氨基酸，故谷氨酰胺酶的作用十分重要[14]。若谷氨酰胺酶活力低，谷氨酰胺會(huì)不可逆的轉(zhuǎn)化成焦谷氨酸，對(duì)醬油的風(fēng)味和滋味都沒(méi)有提升作用，因此，醬油原油中谷氨酸含量會(huì)隨谷氨酰胺酶活力的提高而得到提升，鮮味也得到增強(qiáng)[15]。谷氨酰胺酶活力高低的順序?yàn)椋夯烨鷺忧希究瞻讟忧希倦p菌種發(fā)酵樣曲料，且有顯著性差異（P＜0.05）。該酶活力的差異有一定的特殊性，空白樣的谷氨酰胺酶全部來(lái)自于米曲霉酶系，其谷氨酰胺酶活力高，但韓銘海等[16]研究表明該種菌所產(chǎn)的谷氨酰胺酶不耐鹽、易失活，不利于醬油中谷氨酰胺向谷氨酸轉(zhuǎn)化，雙菌種發(fā)酵樣曲料的前3 種酶活力都有一定提高，而谷氨酰胺酶活力最低，這可能與微生物的產(chǎn)酶狀態(tài)有關(guān)，米曲霉的制曲條件有利于解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)其他酶，而對(duì)其產(chǎn)谷酰胺酶有抑制作用?；烨鷺忧现校獾矸垩挎邨U菌在優(yōu)化后的發(fā)酵條件與培養(yǎng)基的情況下產(chǎn)谷氨酰胺酶，因此，其產(chǎn)酶能力強(qiáng)，酶活力最高，達(dá)到4.55 U/g[17]。

2.2 總氮和氨基酸態(tài)氮含量的變化

原料利用率是評(píng)價(jià)醬油發(fā)酵效率的重要指標(biāo)之一，也是提高產(chǎn)品質(zhì)量的基礎(chǔ)。醬油生產(chǎn)中的原料利用率，主要指蛋白質(zhì)和淀粉利用率，即原料中蛋白質(zhì)和淀粉等成分進(jìn)入成品中的比例。不同的曲料發(fā)酵對(duì)醬油總氮含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同曲料發(fā)酵醬油的總氮含量變化Fig. 2 Changes in total nitrogen content in soy sauce produced w ith different soy sauce kojis

由圖2可知，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，總氮含量大小依次為：雙菌種發(fā)酵樣＞空白樣＞混曲樣，有顯著性差異（P＜0.05）?；烨鷺俞u油的總氮含量偏低，可能是由于米曲霉制曲的曲料與解淀粉芽孢桿菌固體發(fā)酵的曲料之間的水分含量差異較大，最終曲料干基質(zhì)量較低所致。雙菌種發(fā)酵樣發(fā)酵得到的醬油，由于有耐鹽的解淀粉芽孢桿菌的作用，其總氮含量高于其他醬油。從發(fā)酵速率分析，發(fā)酵前5 d，雙菌種發(fā)酵樣和混曲樣的總氮含量顯著高于空白樣，說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌所產(chǎn)的蛋白酶具有一定的耐鹽性，能促進(jìn)蛋白酶解。空白樣、雙菌種發(fā)酵樣和混曲樣的總氮含量在發(fā)酵前15 d增加速率較大，增加速率均大于0.02 g/（100 m L·d），與李丹等[12]的研究結(jié)果一致，總氮質(zhì)量濃度分別達(dá)到1.16、1.26、1.18 g/100 m L。30 d后總氮含量增加逐漸趨于平緩，由于微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)度，90 d呈略微下降的趨勢(shì)，與60 d無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

氨基酸態(tài)氮含量是評(píng)定醬油等級(jí)的重要指標(biāo)之一，在醬油發(fā)酵的過(guò)程中，蛋白質(zhì)被蛋白酶水解成肽類，又被肽酶水解成分子更小的小分子肽、氨基酸等物質(zhì)，而這些物質(zhì)是醬油中主要的呈鮮物質(zhì)，一般氨基酸含量越高，醬油滋味越好[18]。不同曲料發(fā)酵醬油的氨基酸態(tài)氮含量變化如圖3所示。

圖3 不同曲料發(fā)酵醬油的氨基酸態(tài)氮含量變化Fig. 3 Changes in am ino acid nitrogen content in soy sauce p roduced w ith different soy sauce kojis

由圖3可知，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量大小依次為混曲樣＞空白樣＞雙菌種發(fā)酵樣，均達(dá)到了特級(jí)醬油的標(biāo)準(zhǔn)（氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度≥0.8 g/100 m L）[12]。空白樣與雙菌種發(fā)酵樣無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而空白樣和雙菌種發(fā)酵樣與混曲樣有顯著性差異（P＜0.05）。從發(fā)酵速率分析，發(fā)酵前30 d，雙菌種發(fā)酵樣和混曲樣的氨基酸態(tài)氮含量顯著高于空白樣，說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌在前期對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的提高有一定作用?？瞻讟?、雙菌種發(fā)酵樣和混曲樣的氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵前5 d均有較大提升，且增加速率均大于0.06 g/（100 m L·d）[12]，30 d后氨基酸態(tài)氮含量增加幅度較?。ǎ?.01 g/（100 m L·d）），變化趨勢(shì)與總氮含量基本一致。

2.3 谷氨酸含量的變化

醬油中氨基酸的種類和含量決定了醬油的品質(zhì)，高鹽稀態(tài)醬油中的氨基酸主要是以游離氨基酸的形式存在，各種游離氨基酸的含量卻存在著較大差異，其中谷氨酸含量居于游離氨基酸含量之首，而谷氨酸與鮮味的呈味有很大關(guān)系，谷氨酸可以作為判斷醬油是否添加鮮味劑的特征氨基酸。不同曲料發(fā)酵對(duì)醬油谷氨酸含量的影響結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同曲料發(fā)酵對(duì)醬油谷氨酸含量的影響Table 2 Effects of different soy sauce kojis on glutam ine acid content of soy sauce

由表2可知，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，谷氨酸含量大小依次為雙菌種發(fā)酵樣＞混曲樣＞空白樣，有顯著性差異（P＜0.05）。谷氨酸含量的變化，都遵循著先增加后下降的趨勢(shì)，且增加速率大于下降速率。雙菌種發(fā)酵樣和混曲樣在第60天谷氨酸質(zhì)量濃度較空白樣高，分別為16.70 mg/m L和16.47 mg/m L，比Kyoko等[19]在醬油中添加γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的效果略差，與Wakayama[20]、葉茂[21]、Ye M ao[22]等研究的添加谷氨酰胺酶能夠提高醬油谷氨酸含量的結(jié)果一致?？瞻讟印㈦p菌種發(fā)酵樣和混曲樣的谷氨酸含量的最高值分別出現(xiàn)在30、60 d和60 d，且質(zhì)量濃度的最大值分別為13.54、16.70、16.47 mg/m L。其中混曲樣谷氨酸質(zhì)量濃度在第1天即可達(dá)到5.63 mg/m L，明顯高于其他曲料醬油，這與解淀粉芽孢桿菌SWJS22固態(tài)發(fā)酵的特性有關(guān)[23]，且根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，米曲酶所產(chǎn)的谷氨酰胺酶不耐鹽[24-25]，而解淀粉芽孢桿菌所產(chǎn)的谷氨酰胺酶具有一定的耐鹽性。

2.4 香氣化合物的變化

醬油揮發(fā)性物質(zhì)主要來(lái)源于醬油制曲和醬醪發(fā)酵的過(guò)程，所以原料、菌種、制曲工藝以及發(fā)酵方式的不同都會(huì)對(duì)醬油的香氣產(chǎn)生各種不同程度的影響[11]。3 種不同曲料發(fā)酵的醬油，其香氣化合物的種類見(jiàn)表3。

表3 香氣化合物的種類Table 3 Classes of aroma com pounds detected in soy sauce produced w ith different soy sauce kojis

從總種類上來(lái)看，3 種不同曲料發(fā)酵的醬油的香氣化合物種類相差不大，均在50 種以上，其中雙菌種發(fā)酵樣醬油，種類有52 種，多于其他曲料發(fā)酵的醬油。

各類不同風(fēng)味化合物的含量上，3 種不同曲料發(fā)酵的醬油有明顯差別，結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)于醇類化合物，空白樣和雙菌種發(fā)酵樣含量差別不大，混曲樣醇類含量高于其他制曲方式，對(duì)于醛類化合物，雙菌種發(fā)酵樣含量高于其他醬油。對(duì)于酸類化合物，含量差別很大，空白樣＞雙菌種發(fā)酵樣＞混曲樣，空白樣的酸類化合物總量是混曲樣的7.93 倍，說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵醬油有明顯的降酸作用，對(duì)于吡嗪類化合物，空白樣與雙菌種發(fā)酵樣明顯高于混曲樣。對(duì)于酮類化合物和酚類化合物，雙菌種發(fā)酵樣高于其他發(fā)酵樣。綜合香味化合物種類和各類化合物的含量分析，雙菌種發(fā)酵樣醬油較優(yōu)。

醬油的揮發(fā)性醇類主要來(lái)自于原料和發(fā)酵過(guò)程中[26]。乙醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、苯乙醇和1-辛烯-3-醇在3 種醬油中均有檢出，苯乙醇是芳香族醇，可能主要來(lái)自于酵母菌體內(nèi)的Ehrlich反應(yīng)，也可能來(lái)源于苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的降解。1-辛烯-3-醇帶有蘑菇香味，是米曲霉孢子的特征揮發(fā)性物質(zhì)[27]，在3 種不同曲料發(fā)酵的醬油中，1-辛烯-3-醇的含量差別不大。混曲樣的醬油中3-甲基-1-丁醇的含量是空白樣的4.31 倍，是雙菌種發(fā)酵樣的6.32 倍。

醬油中的醛、酮類化合物在含量較低時(shí)，具有令人愉悅的香味，如果香、草香、甜香和焦香等，濃度較高時(shí)，則會(huì)給人刺激感[28-29]。其中，2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、苯甲醛和苯乙醛含量較高，2-甲基丁醛、3-甲基丁醛是醬油香氣的重要組成部分，一方面來(lái)源于亮氨酸和異亮氨酸的Strecker降解，另一方面是微生物利用游離氨酸的去羰基和轉(zhuǎn)氨作用[28]。糠醛在空白樣中含量不低，雙菌種發(fā)酵樣中含量較低，在混曲樣中沒(méi)有檢測(cè)出。

表4 不同曲料醬油化合物的香氣物質(zhì)的含量Table 4 The contents of aroma components in soy sauce produced w ith different soy sauce kojis

酸類化合物通常由細(xì)菌發(fā)酵階段進(jìn)行代謝活動(dòng)產(chǎn)生，將糖類化合物轉(zhuǎn)化成有機(jī)酸酸，酸類化合物是酯化反應(yīng)的前提物質(zhì)，一定含量的有機(jī)酸能夠增加醬油風(fēng)味。3 種醬油的酸類化合物含量差異主要是乙酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸，其中空白樣的乙酸含量是混曲樣的2.83 倍，空白樣的2-甲基丁酸是混曲樣的30.85 倍，空白樣的3-甲基丁酸是混曲樣制曲發(fā)酵醬油的20.78 倍，差異十分顯著。

酯類化合物是食品中重要的香氣種類之一，具有果香、甜香或花香樣氣味。3 種不同制曲方式發(fā)酵的醬油中均檢測(cè)出乙酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯乙酸乙酯、2-甲基丙酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯，與已有文獻(xiàn)報(bào)道相同[30]，乙酸乙酯是醬油中最常見(jiàn)的酯類物質(zhì)，丁二酸-甲酯在空白樣和雙菌種發(fā)酵樣中均有檢出，而混曲樣醬油中沒(méi)有檢出。

酚類和吡嗪化合物在發(fā)酵的豆制品中十分重要。愈創(chuàng)木酚在3 種醬油中均有檢出，研究表明愈創(chuàng)木酚與木質(zhì)素代謝有關(guān)，且雙菌種發(fā)酵樣醬油含量最高，2,6-二甲氧基苯酚只在雙菌種發(fā)酵樣醬油中檢測(cè)出。吡嗪類化合物種類豐富，2-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪和2-乙基-6-甲基吡嗪在3 種醬油中均有檢出。

含硫化合物雖然含量低，但對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味的影響很大。甲硫醇在3 種醬油中均有檢出，3-甲硫基丙醛只有在雙菌種發(fā)酵樣醬油中檢出。此外，α-柏木烯、β-柏木烯、1,3-辛二烯在3 種醬油中均有檢出，3-甲基-丁醛肟卻只在混曲樣醬油中檢出。

3 結(jié) 論

利用解淀粉芽孢桿菌SW J22和米曲霉為發(fā)酵菌株，探究米曲霉單獨(dú)制曲發(fā)酵、解淀粉芽孢桿菌和米曲霉曲料混合發(fā)酵以及雙菌種混合制曲發(fā)酵對(duì)醬油理化指標(biāo)及風(fēng)味的影響?？疾觳煌习l(fā)酵醬油的基本理化指標(biāo)，與傳統(tǒng)發(fā)酵醬油進(jìn)行對(duì)比，全面評(píng)價(jià)將解淀粉芽孢桿菌運(yùn)用到醬油發(fā)酵的可行性。3 種不同曲料發(fā)酵的醬油，總氮和氨基酸態(tài)氮均在發(fā)酵初期迅速生成，其中混曲樣醬油氨基酸轉(zhuǎn)化率最高，混曲樣和雙菌種發(fā)酵樣，谷氨酸含量較空白樣有明顯提高?；烨鷺俞u油色澤上與空白樣、雙菌種發(fā)酵樣區(qū)別明顯，色率和色深物質(zhì)均低于其他曲料發(fā)酵醬油。從香氣種類上來(lái)看，3 種醬油的差別不大，重點(diǎn)香氣成分在3 種醬油中均有檢出，混曲樣醬油酸類物質(zhì)含量最低。

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Application of M ixed Cultures of Bacillus amyloliquefaciens SWJS22 and Aspergillus oryzae in Soy Sauce Fermentation

ZHAO Long, ZHOU Chihongling, ZHAO Moum ing, CUI Chun*, WANG Wei
(School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Bacillus amyloliquefaciens SW JS22 and Aspergillus oryzae were used as starters for soy sauce fermentation in this paper. To study the effects of koji making on soy sauce fermentation, soy sauces produced w ith koji containing Aspergillus oryzae alone (control) and in combination w ith Bacillus amyloliquefaciens SWJS22 and w ith mixed koji cultures of the strains were tested for physicochem ical parameters and flavor compounds. Compared w ith the control group and soy sauce fermented by koji containing mixed strains, soy sauce fermented by mixed koji cultures showed higher amino acid conversion, lower color index and lower pigment content. Soy sauce fermented by m ixed cultures had a significantly higher content of glutamic acid compared w ith the control group. Comparative analysis of flavor compounds by gas chromatographmass spectrometry (GC-MS) indicated that only a slight diff erence was seen in the flavor substances of three soy sauces and the important ones were detected in all of them. The content of acids was lowest in soy sauce fermented by mixed koji cultures.

Bacillus amyloliquefaciens SWJS22; koji containing mixed strains; m ixed koji cultures

10.7506/spkx1002-6630-201722019

TS264.21

A

1002-6630（2017）22-0125-06

趙龍, 周池虹伶, 趙謀明, 等. 解淀粉芽孢桿菌SW JS22和米曲霉混合制曲在醬油發(fā)酵中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2017,38(22): 125-130. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722019. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Long, ZHOU Chihongling, ZHAO Moum ing, et al. Application of m ixed cultures of Bacillus amyloliquefaciens SWJS22 and Aspergillus oryzae in soy sauce fermentation[J]. Food Science, 2017, 38(22): 125-130. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722019. http://www.spkx.net.cn

2016-12-21

中國(guó)科學(xué)院生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（2015KF-04）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201604020067）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2017ZD093）

趙龍（1992—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：410891730@qq.com

*通信作者：崔春（1978—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：cuichun@scut.edu.cn