徐瓏倩，胡凱弟，張艾青，周 康,2，劉書亮,2,*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品加工與安全研究所，四川 雅安 625014）

植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

徐瓏倩1，胡凱弟1，張艾青1，周 康1,2，劉書亮1,2,*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品加工與安全研究所，四川 雅安 625014）

為提高乳酸菌細(xì)菌素產(chǎn)量，以藤黃微球菌、銅綠假單胞桿菌為指示菌，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，5 種乳酸菌培養(yǎng)基中MRS培養(yǎng)基為該菌株產(chǎn)細(xì)菌素的適宜培養(yǎng)基；最佳培養(yǎng)條件為種子液接種量3%（V/V）、培養(yǎng)基初始pH 6.0、34℃靜置培養(yǎng)42 h；最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖添加量2 g/100 m L、酵母浸膏添加量2 g/100 mL、大豆蛋白胨添加量1.5 g/100 m L、MgSO4添加量0.058 g/100 mL、MnSO4添加量0.025 g/100 m L、FeSO4添加量0.02 g/100 m L、Tween 80添加量0.08 g/100 m L、乙酸鈉添加量0.5 g/100 m L、K2HPO4添加量0.2 g/100 m L。在此條件下，細(xì)菌素效價(jià)為1 145 IU/m L，較優(yōu)化前（362 IU/m L）提高了216%。

植物乳桿菌；細(xì)菌素；培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件

乳酸菌是一類利用可發(fā)酵性糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌[1-2]，在食品工業(yè)中有廣泛應(yīng)用[3-4]，而乳酸菌細(xì)菌素（乳酸菌素）是菌體在代謝過程中由核糖體產(chǎn)生的具有抑菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物[5-6]。該類物質(zhì)可作為天然防腐劑（如乳酸鏈球菌素）應(yīng)用于食品中[7]，由于不產(chǎn)生抗藥性，對人體無害，其應(yīng)用前景廣闊[8]。乳酸菌素產(chǎn)生于菌體對數(shù)生長中期，在對數(shù)后期或穩(wěn)定前期達(dá)到最大值，其產(chǎn)量與細(xì)菌生長相關(guān)[9-12]。培養(yǎng)溫度、接種量、初始pH值等培養(yǎng)條件[13-14]，以及培養(yǎng)基種類、碳源、氮源等營養(yǎng)條件[15-16]都對乳酸菌素產(chǎn)量有直接或間接影響。植物乳桿菌屬于我國衛(wèi)生部關(guān)于“可用于食品的菌種名單”中公布的益生菌之一，能夠通過代謝產(chǎn)生的過氧化氫、有機(jī)酸、細(xì)菌素以及其他競爭營養(yǎng)物質(zhì)達(dá)到抑菌作用[15,17]，延長食品保質(zhì)期。植物乳桿菌（Lactobacillu splantarum）P158分離于四川傳統(tǒng)發(fā)酵食品，可產(chǎn)生廣譜植物乳桿菌素，對多數(shù)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌及少數(shù)真菌有較強(qiáng)抑制活性，有望作為食品生物防腐劑[18-19]；但較低的產(chǎn)量限制了其應(yīng)用。因此，研究菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響因素，優(yōu)化發(fā)酵條件，從而提高細(xì)菌素產(chǎn)量，為其應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

植物乳桿菌（L. plantarum）P158[18]、藤黃微球菌（M icrococcus luteus）CICC10209、銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853作指示菌，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

乳酸鏈球菌素（效價(jià)106IU/g） 浙江銀象生物工程有限公司；植物蛋白胨、聚蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨均為生物試劑 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；β-甘油磷酸二鈉、抗壞血酸、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、木糖、纖維二糖、山梨醇、可溶性淀粉等均為分析純試劑 成都科龍?jiān)噭S。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配方：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 000 m L，調(diào)至pH 7.0～7.2。

CM培養(yǎng)基配方：蔗糖10 g、蛋白胨10 g、酵母浸膏10 g、K2HPO410 g、NaCl 2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、水1 000 m L，調(diào)至pH 6.2。

MRS培養(yǎng)基配方：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸膏5 g、葡萄糖20 g、K2HPO42 g、檸檬酸二銨2 g、乙酸鈉5 g、M gSO40.58 g、M nSO40.25 g、Tween 80 1 m L、水1 000 m L，調(diào)至pH 6.5。

M 17培養(yǎng)基配方：植物蛋白胨5 g、聚蛋白胨5 g、牛肉膏2.5 g、酵母浸膏5 g、β-甘油磷酸二鈉19 g、抗壞血酸0.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、水1 000 m L，調(diào)至pH 7.1。

BCP培養(yǎng)基配方：酵母浸膏2.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖5 g、溴甲酚紫0.04 g、水1 000 m L，調(diào)至pH 6.8～7.0。

APT培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10 g、酵母浸膏5 g、檸檬酸鈉5 g、葡萄糖10 g、K2HPO45 g、Tween 80 1 m L、NaCl 5 g、MgSO4·7H2O 0.8 g、MnCl2·4H2O 0.14 g、FeSO4·7H2O 0.04 g、水1 000 m L，調(diào)至pH 6.7～7.0。

以上培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂粉為相應(yīng)固體培養(yǎng)基，均于121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-4C+酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司；Sorvall ST 16R冷凍離心機(jī)、1300 Series A2生物安全柜美國Thermo Fisher Scientific公司；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 指示菌活化及其菌懸液制備

分別挑取藤黃微球菌CICC10209和銅綠假單胞桿菌ATCC27853劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面，37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化；用5 m L無菌生理鹽水洗下菌苔，調(diào)整細(xì)胞濃度為107CFU/m L。

1.3.2 植物乳桿菌P158活化及其種子液制備

將菌株P(guān)158劃線于MRS斜面，37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化；用5 m L無菌生理鹽水洗下菌苔，調(diào)整細(xì)胞濃度為108CFU/m L作為種子液。

1.3.3 發(fā)酵上清液的制備

將菌株P(guān)158種子液按體積分?jǐn)?shù)1%接種至10 m L發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h后離心（10 000 r/m in，10 m in）得到發(fā)酵上清液。

1.3.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

采用牛津杯雙層瓊脂擴(kuò)散法，并稍作改進(jìn)[20]。在鋪有10 m L水瓊脂平板上放置牛津杯，吸取200 μL指示菌懸液至20 m L 50 ℃左右的無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻后傾注平板，放置15 min。向牛津杯內(nèi)加入100 μL菌株P(guān)158發(fā)酵上清液，37 ℃正置培養(yǎng)16～18 h，分別測量發(fā)酵上清液對指示菌CICC10209和ATCC27853抑菌圈直徑，設(shè)置添加等量無菌MRS液體培養(yǎng)基為對照；同時(shí)測定發(fā)酵上清液pH值。

1.3.5 細(xì)菌素效價(jià)測定

將發(fā)酵上清液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)70% (NH4)2SO4溶液沉淀，4 ℃鹽析過夜后離心（10 000 r/m in，20 m in），棄去上清液；利用20 mmol/L pH 4.5的檸檬酸緩沖液復(fù)溶后用于效價(jià)測定。效價(jià)測定方法：以藤黃微球菌10209為指示菌，選擇100、500、1 000、1 500、2 000 IU/m L 5 個濃度，采用牛津杯雙層瓊脂擴(kuò)散法做抑菌實(shí)驗(yàn)，以效價(jià)對數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)，繪制效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素的效價(jià)。

1.3.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.6.1 確定植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素適宜培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)

將菌株P(guān)158種子液按體積分?jǐn)?shù)1%分別接種于CM、MRS、M 17、BCP和APT 5 種培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，測定其發(fā)酵上清液抑菌圈直徑和pH值，以添加各自使用的無菌培養(yǎng)基為對照，確定最適宜的培養(yǎng)基種類。

將菌株P(guān)158種子液按體積分?jǐn)?shù)1%接入MRS培養(yǎng)基（pH 6.5），分別于26、30、34、38、42 ℃培養(yǎng)48 h，測其發(fā)酵上清液抑菌圈直徑和pH值，確定適宜的培養(yǎng)溫度；將菌株P(guān)158種子液按體積分?jǐn)?shù)1%接入MRS培養(yǎng)基（pH 6.5），34 ℃靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h，測定其發(fā)酵上清液抑菌圈直徑和pH值，確定適宜的培養(yǎng)時(shí)間。

將菌株P(guān)158種子液分別按體積分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%接入MRS培養(yǎng)基（pH 6.5），34 ℃培養(yǎng)42 h后，測定其發(fā)酵上清液抑菌圈直徑和pH值，確定適宜的接種量。

將菌株P(guān)158種子液按體積分?jǐn)?shù)3%接入MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基初始pH值分別調(diào)至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，34 ℃靜置培養(yǎng)42 h，測定其發(fā)酵上清液抑菌圈直徑和pH值，確定適宜的初始pH值。

1.3.6.2 確定植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素適宜碳/氮源的單因素和正交試驗(yàn)

在1.3.6.1節(jié)獲得的培養(yǎng)菌株P(guān)158培養(yǎng)基種類及最佳條件基礎(chǔ)上，以不同碳源、氮源、碳/氮源適宜比例為因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，具體如下：以MRS培養(yǎng)基去除碳源為基礎(chǔ)，分別添加2 g/100 m L的葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、纖維二糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、木糖和可溶性淀粉，測定菌株P(guān)158發(fā)酵液抑菌圈直徑和pH值；以MRS培養(yǎng)基去除氮源為基礎(chǔ)，分別添加2 g/100 m L的酵母浸膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、氨水、硝酸鈉和檸檬酸氫二銨，測定菌株P(guān)158發(fā)酵上清液抑菌圈直徑和pH值。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行培養(yǎng)基碳/氮源適宜比例實(shí)驗(yàn)，將葡萄糖作為最適碳源，按不同質(zhì)量濃度0、1、2、3、4、5、7.5、10 g/100 m L添加于MRS培養(yǎng)基，測菌株P(guān)158發(fā)酵上清液抑菌圈直徑和pH值；將酵母浸膏按不同質(zhì)量濃度0、0.5、1、1.5 g/100 m L添加于MRS培養(yǎng)基，測菌株P(guān)158發(fā)酵上清液抑菌圈直徑及其pH值；除酵母浸膏外，將大豆蛋白胨按不同質(zhì)量濃度0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 g/100 m L添加于MRS培養(yǎng)基中，測菌株P(guān)158發(fā)酵上清液抑菌圈直徑和pH值。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基碳/氮源組合。

1.3.6.3 確定植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素適宜金屬離子的單因素和正交試驗(yàn)

在1.3.6.2節(jié)基礎(chǔ)上，分別考察Mg2+、Mn2+和Fe2+對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響。將MgSO4按不同質(zhì)量濃度0、0.029、0.058、0.087、0.116 g/100 m L分別添加于培養(yǎng)基中，在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)菌株P(guān)158，測定其發(fā)酵液上清液抑菌圈直徑和pH值；將M nSO4按不同質(zhì)量濃度0、0.012 5、0.025、0.037 5、0.05 g/100 m L分別添加于培養(yǎng)基中，在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)菌株P(guān)158，測定其發(fā)酵上清液抑菌圈直徑及其pH值；將FeSO4按不同質(zhì)量濃度0、0.02、0.04、0.06、0.08 g/100m L分別添加于培養(yǎng)基中，在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)菌株P(guān)158，測定其發(fā)酵上清液抑菌圈直徑及其pH值。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化金屬離子添加量。

1.3.6.4 確定植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素適宜Tween 80質(zhì)量濃度

在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，分別添加不同質(zhì)量濃度0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08、0.1 g/100 m L Tween 80，在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)菌株P(guān)158并進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，測定其發(fā)酵上清液抑菌圈直徑及其pH值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取其平均值，數(shù)據(jù)采用SPSS V 22進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素適宜培養(yǎng)條件的確定

圖1 培養(yǎng)基對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 1 Effect of different media on production of bacteriocin by strain P158

2.1.1 乳酸菌培養(yǎng)基種類對植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素的影響由圖1可知，5 種培養(yǎng)基對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的效果依次為MRS＞APT＞CM＞BCP＞M 17。雖然使用MRS培養(yǎng)基時(shí)其發(fā)酵液pH值較APT和BCP略高，但是抑菌圈直徑最大（P＜0.05），故選擇MRS培養(yǎng)基做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 培養(yǎng)溫度對植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素的影響

圖2 培養(yǎng)溫度對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 2 Effect of culture temperature on production of bacteriocin by strain P158

由圖2可知，抑菌圈直徑隨著培養(yǎng)溫度的升高而增大，并在34 ℃時(shí)達(dá)到最大值（P＜0.05）；當(dāng)溫度繼續(xù)上升，抑菌圈直徑反而減小甚至為0，發(fā)酵液pH值相對較高，可見P158生長已受到影響。

2.1.3 培養(yǎng)時(shí)間對植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素的影響

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 3 Effect of incubation time on production of bacteriocin by strain P158

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，發(fā)酵液pH值持續(xù)下降并最終穩(wěn)定在3.5左右，對2 種指示菌的抑制活性均顯著增強(qiáng)（P＜0.05），42 h時(shí)最強(qiáng)；當(dāng)培養(yǎng)超過60 h，抑菌圈直徑均開始減??；故選擇42 h作為最佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.1.4 接種量對植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素的影響

圖4 接種量對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 4 Effect of inoculum amount on production of bacteriocin by strain P158

由圖4可知，當(dāng)種子液接種量為3%時(shí)，抑菌圈直徑較大。

2.1.5 初始pH值對植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素的影響

圖5 初始pH值對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 5 Effect of initial pH on p roduction of bacteriocin by strain P158

由圖5可知，隨著初始pH值的增大，藤黃微球菌和銅綠假單胞桿菌的抑菌圈直徑均呈現(xiàn)先增大后緩慢降低的趨勢；中性和偏堿性環(huán)境不利于乳酸菌生長故抑菌活性偏低[21]（P＜0.05）；初始pH值為6.0時(shí)抑菌效果最好。

2.2 植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素適宜培養(yǎng)基成分的確定

2.2.1 碳源對植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素的影響

圖6 碳源對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 6 Effect of carbon sources on p roduction of bacteriocin by strain P158

由圖6可知，以葡萄糖為碳源時(shí)，菌株發(fā)酵上清液對藤黃微球菌抑制活性與添加麥芽糖相比無明顯差異（P＞0.05），但顯著優(yōu)于半乳糖等其他處理組（P＜0.05）；并且銅綠假單胞桿菌抑菌圈最大（P＜0.05），pH值最低；當(dāng)以乳糖為碳源時(shí)，P158對藤黃微球菌沒有活性；而添加木糖和可溶性淀粉時(shí)，藤黃微球菌和銅綠假單胞桿菌均未出現(xiàn)抑菌圈，此現(xiàn)象與Turgis等[22]研究結(jié)果相似。因此選擇葡萄糖作為最佳碳源。

2.2.2 氮源對植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素的影響

圖7 氮源對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 7 Effect of nitrogen sources on production of bacteriocin by strain P158

由圖7可知，相比于無機(jī)氮源，有機(jī)氮源更有利于菌株產(chǎn)細(xì)菌素，且不同氮源之間差異較大。酵母浸膏和大豆蛋白胨為氮源時(shí)，菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素能力遠(yuǎn)強(qiáng)于其他氮源（P＜0.05），但二者之間并無顯著性差異（P＞0.05）；二者發(fā)酵液pH值分別為3.54與3.52，幾乎無差異。

2.2.3 培養(yǎng)基碳/氮源適宜比例

2.2.3.1 葡萄糖質(zhì)量濃度對植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素的影響

圖8 葡萄糖質(zhì)量濃度對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 8 Effect of glucose concentration on production of bacteriocin by strain P158

由圖8可知，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度維持在1～3 g/100 m L時(shí)，2 種抑菌圈直徑均較大，pH值變化較?。ňS持pH 3.5左右）；2 g/100 m L時(shí)效果顯著（P＜0.05）。

2.2.3.2 酵母浸膏質(zhì)量濃度對植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素的影響

圖9 酵母浸膏質(zhì)量濃度對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 9 Effect of yeast extract concentration on p roduction of bacteriocinby strain P158

由圖9可知，質(zhì)量濃度的酵母浸膏對植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素影響較大；當(dāng)添加1～2 g/100 m L時(shí)，抑菌圈直徑較其他實(shí)驗(yàn)組大（P＜0.05）。

2.2.3.3 大豆蛋白胨質(zhì)量濃度對植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素的影響

圖10 大豆蛋白胨質(zhì)量濃度對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 10 Effects of soy peptone concentration on production of bacteriocin by strain P158

如圖10所示，當(dāng)大豆蛋白胨添加量在1～2 g/100 m L時(shí)，P158發(fā)酵液對2 種指示菌的抑制活性較高，且pH值保持平穩(wěn)，維持pH 3.5左右。

2.2.3.4 培養(yǎng)基碳/氮源組分正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基碳/氮源組合，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1，直觀分析見表2。由表2可知，影響菌株P(guān)158對2 種指示菌抑制活性的主次因素為葡萄糖＞酵母浸膏＞大豆蛋白胨。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)號5和9對藤黃微球菌抑菌圈直徑顯著大于其他試驗(yàn)組號（P＜0.05）；而銅綠假單胞桿菌則是試驗(yàn)號4～9組優(yōu)于試驗(yàn)號1～3組，且第5和第9試驗(yàn)號之間無顯著差異（P＞0.05）?？紤]到成本問題，故選擇第5組作為碳/氮源最佳配比。

表1 培養(yǎng)基碳/氮源組分正交試驗(yàn)優(yōu)化及結(jié)果Table 1 O rthogonal array design w ith response values for the op tim ization of glucose, yeast extract and soy pep tone concentration in the medium

表2 培養(yǎng)基碳/氮源組分正交試驗(yàn)直觀分析Table 2 Range analysis of bacteriostatic activity

2.2.4 金屬離子成分

2.2.4.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖11可知，隨著M g2+質(zhì)量濃度逐漸增大，抑菌圈直徑表現(xiàn)為先增大后減小，其中銅綠假單胞桿菌抑菌圈在M g2+質(zhì)量濃度為0.058 g/100 m L時(shí)達(dá)到最大（P＜0.05）。當(dāng)添加量為0.058～0.116 g/100 m L時(shí)，抑菌活性較強(qiáng)，故選擇此范圍做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖11 M g2質(zhì)量濃度對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 11 Effect of M g2+ concentration on production of bacteriocin by strain P158

圖12 M n2質(zhì)量濃度對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 12 Effect of M n2+ concentration on production of bacteriocin by strain P158

由圖12可知，Mn2+質(zhì)量濃度在0.025～0.05 g/100 m L之間，菌株P(guān)158發(fā)酵上清液對2 種指示菌有較大抑制活性（P＜0.05）。

圖13 Fe2質(zhì)量濃度對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 13 Effect of Fe2+ concentration on production of bacteriocin by strain P158

由圖13可知，菌株P(guān)158細(xì)菌素產(chǎn)量在Fe2+添加量為0.02～0.06 g/100 m L時(shí)較高。

2.2.4.2 培養(yǎng)基金屬離子正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步考察金屬離子比例對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，直觀分析見表4。P158對藤黃微球菌抑制效果影響主次因素為Mg2+＞Mn2+＞Fe2+，最優(yōu)組合為試驗(yàn)2；而對銅綠假單胞桿菌則是M n2+＞Fe2+＞M g2+，試驗(yàn)1效果最好；顯著性分析表明，二者差異不顯著。從成本角度考慮，選擇試驗(yàn)1中各項(xiàng)水平作為最優(yōu)組合添加于培養(yǎng)基中。

表3 培養(yǎng)基金屬離子正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design w ith response values for the optim ization of m etal ion concentrations in the medium

表4 培養(yǎng)基金屬離子正交試驗(yàn)直觀分析Table 4 Range analysis of bacteriostatic activity

2.2.5 Tween 80質(zhì)量濃度的影響

圖14 Tween 80質(zhì)量濃度對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig. 14 Effect of Tween 80 concentration on production of bacteriocin by strain P158

由圖14可知，Tween 80對菌株P(guān)158產(chǎn)細(xì)菌素有一定刺激作用；其質(zhì)量濃度為0.08 g/100 m L時(shí)，發(fā)酵上清液抑菌活性最強(qiáng)（P＜0.05）。

2.3 植物乳桿菌素P158的效價(jià)結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以效價(jià)對數(shù)值為自變量，抑菌圈直徑為因變量進(jìn)行線性擬合，得到效價(jià)線性回歸方程：y=4.432 6x+3.980 7（R2=0.997 8）。分別以優(yōu)化前后條件培養(yǎng)菌株P(guān)158，發(fā)酵液經(jīng)粗提后得到細(xì)菌素粗提物，按1.3.4節(jié)分別測定其抑菌圈直徑和pH值。結(jié)果表明，優(yōu)化前的抑菌圈為15.32mm，優(yōu)化后為17.54mm；分別代入回歸方程計(jì)算得到效價(jià)依次為362 IU/m L和1 145 IU/m L，提高了216%；優(yōu)化前后的pH值一致。該結(jié)果優(yōu)于陳蕓蕓等[23]和Pal等[24]的研究。

乳酸菌素作為生物防腐劑，可提高食品安全性與品質(zhì)[18]。其產(chǎn)量與菌體生長有關(guān)，但最佳發(fā)酵條件往往與菌體最適生長條件不一致[10-11]，溫度、pH值、氮源、碳源等諸多因素對乳酸菌素產(chǎn)量有不同程度的影響，盡管原因尚未系統(tǒng)闡明[25]，但優(yōu)化乳酸菌素產(chǎn)量并提高其活性顯得尤為重要[26]。Tabbene等[14]從培養(yǎng)基成分入手，對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）B38產(chǎn)細(xì)菌素條件進(jìn)行研究，結(jié)果表明乳糖、(NH4)2SO4和Mn2+對其產(chǎn)量影響顯著；Anthony等[27]則發(fā)現(xiàn)高濃度酵母浸膏和NaCl對細(xì)菌素產(chǎn)量有正效應(yīng)，堿性環(huán)境和較高的培養(yǎng)溫度亦是如此；而Raza等[28]考察了不同金屬離子對Paenibacillus polymyxa SQR-21產(chǎn)細(xì)菌素的影響，結(jié)果表明Zn2+對產(chǎn)量有抑制作用，而M g2+相反，F(xiàn)e2+雖然影響不顯著，但與Mg2+有協(xié)同作用?？v觀優(yōu)化乳酸菌素產(chǎn)量的文獻(xiàn)，大多局限于某一方面因素；與之不同的是，本實(shí)驗(yàn)不僅從培養(yǎng)條件，也從培養(yǎng)基成分方面，對植物乳桿菌P158產(chǎn)乳酸菌素發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，系統(tǒng)考察了不同因素的影響效果并作優(yōu)化，為菌株的應(yīng)用提供了更詳細(xì)的數(shù)據(jù)參考。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Tween 80對植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素有一定促進(jìn)作用，這與Collado等[29]報(bào)道相一致，可能是Tween 80作為一種乳化劑，改變了菌體細(xì)胞膜通透性，從而有利于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸[30]。

3 結(jié) 論

植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素的適宜培養(yǎng)基為MRS，其最佳培養(yǎng)條件為種子液接種量3%（V/V）、培養(yǎng)基初始pH 6、34℃靜置培養(yǎng)42 h。最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖質(zhì)量濃度2 g/100 m L、酵母浸膏質(zhì)量濃度2 g/100 m L、大豆蛋白胨質(zhì)量濃度1.5 g/100 m L、M gSO4質(zhì)量濃度0.058 g/100 m L、M nSO4質(zhì)量濃度0.025 g/100 m L、FeSO4質(zhì)量濃度0.02 g/100 m L、Tw een 80質(zhì)量濃度0.08 g/100 m L、乙酸鈉質(zhì)量濃度0.5 g/100 m L、K2HPO4質(zhì)量濃度0.2 g/100 m L。在此條件下，細(xì)菌素產(chǎn)量提高了216%，效價(jià)達(dá)到1 145 IU/m L。

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Optimization of Medium and Culture Conditions for Bacteriocin Production by Lactobacillus plantarum P158

XU Longqian1, HU Kaidi1, ZHANG Aiqing1, ZHOU Kang1,2, LIU Shuliang1,2,*
(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014, China;2. Institute of Food Processing and Safety, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

To increase the yield of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum P158, the medium and culture conditions for this strain were optimized using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The bacteriostatic activity of bacteriocin against Micrococcus luteus and Pseudomonas aeruginosa and pH were used as response variables.Results showed that MRS was the most suitable for bacteriocin production among five culture media for lactic acid bacteria.The optimal culture conditions were obtained as follow s: inoculum amount, 3% (V/V); initial pH, 6.0; and static culture at 34 ℃ for 42 h; the optimum medium was composed of glucose 2 g/100 m L, yeast extract 2 g/100 m L, soy peptone 1.5 g/100 m L, MgSO40.058 g/100 m L, MnSO40.025 g/100 m L, FeSO40.02 g/100 m L, Tween 80 0.08 g/100 m L, sodium acetate 0.5 g/100 m L, and K2HPO40.2 g/100 m L. Under these conditions, bacteriocin titer was 1 145 IU/m L, which was 216% higher than that (362 IU/m L) before optimization.

Lactobacillus plantarum; bacteriocin; medium; culture conditions

10.7506/spkx1002-6630-201722017

TS201.6

A

1002-6630（2017）22-0109-08引文格式：

徐瓏倩, 胡凱弟, 張艾青, 等. 植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22): 109-116.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722017. http://www.spkx.net.cn

XU Longqian, HU Kaidi, ZHANG Aiqing, et al. Optimization of medium and culture conditions for bacteriocin production by Lactobacillus plantarum P158[J]. Food Science, 2017, 38(22): 109-116. (in Chinese w ith English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722017. http://www.spkx.net.cn

2017-01-17

四川省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（14NZ0012）；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015FZ0001）

徐瓏倩（1996—），女，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：540922828@qq.com

*通信作者：劉書亮（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c發(fā)酵工程。E-mail：lsliang999@163.com