代 靜，焦 雪，張培軍，冷東澤，巴翠玉，茆安婷，李月紅

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130000；2.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心，長春 130000)

七彩鮭雌核發(fā)育及其倍性研究

代 靜1，焦 雪1，張培軍2，冷東澤1，巴翠玉1，茆安婷1，李月紅1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130000；2.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心，長春 130000)

利用紫外線照射對七彩鮭(Salvelinusfontinalis)精子進(jìn)行滅活處理，使其遺傳物質(zhì)失活，作為同源精子誘導(dǎo)源，與七彩鮭卵子進(jìn)行受精，采用冷休克方法誘導(dǎo)雌核發(fā)育。結(jié)果表明：同源精子可以誘導(dǎo)七彩鮭的雌核發(fā)育，紫外照射強(qiáng)度為72 mJ/cm2；距離為8 cm；冷休克溫度為20 ℃。七彩鮭減數(shù)分裂雌核發(fā)育倍性測定以雞(Gallussp.)紅細(xì)胞DNA含量(2.5 pg/N) 為標(biāo)準(zhǔn)、七彩鮭普通育苗子一代為參照，采用流式細(xì)胞術(shù)和微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對30尾七彩鮭減數(shù)分裂雌核發(fā)育魚苗進(jìn)行分析,證明了雌核發(fā)育魚苗為雌核發(fā)育二倍體。

七彩鮭(Salvelinusfontinalis)；雌核發(fā)育；流式細(xì)胞術(shù)；DNA含量；微衛(wèi)星標(biāo)記

七彩鮭(Salvelinusfontinalis)，又稱美洲紅點鮭。原產(chǎn)于加拿大東部的拉布拉多地區(qū)，屬于鮭形目鮭科紅點鮭屬，其背部與其它鮭鱒魚類軀體不同之處是布滿了五顏六色的斑點，因此也被譽(yù)為冰水皇后[1]。七彩鮭肉質(zhì)中所富含不飽和脂肪酸18碳2烯酸和18碳3烯酸，具有極高的營養(yǎng)價值[2]。

近年來，由于過度捕撈和水域環(huán)境污染等人為因素造成七彩鮭資源數(shù)量下降，給七彩鮭養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失。由于雌、雄個體生長有較大差異，已有研究表明單性化的養(yǎng)殖成活率高[3]，可有效提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。

流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)是利用流式細(xì)胞儀對處于液流中的細(xì)胞和生物顆粒的理化及生物學(xué)特性(細(xì)胞大小、DNA/RNA含量、細(xì)胞表面抗原表達(dá)等)進(jìn)行快速的定量并通過設(shè)置多參數(shù)客觀地對特定群體加以檢測和分選的新技術(shù)[4]。其中，細(xì)胞周期檢測和DNA倍體分析是一種準(zhǔn)確鑒定魚類倍性的理想方法[5-7]。本研究利用 FCM 測定七彩鮭減數(shù)分裂雌核發(fā)育魚苗DNA 含量，探討其倍性特征，并借助微衛(wèi)星標(biāo)記等手段對誘導(dǎo)的雌核發(fā)育子代進(jìn)行鑒定，為建立和完善七彩鮭的種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫和資源保護(hù)提供理論基礎(chǔ)；為進(jìn)一步研究七彩鮭遺傳組成及生殖方式及服務(wù)于七彩鮭的規(guī)?；庇⑷斯ゐB(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

七彩鮭二倍體的制備：以延邊自治州青龍漁場實驗站七彩鮭群親魚為材料，其中，雌性七彩鮭(2齡魚，1.25 kg)；雄性七彩鮭(2齡魚，1.44 kg)分別采用人工擠壓腹部的方法獲取精液和卵子。取出大約500粒卵子放入柱式托盤中進(jìn)行固定，取出的精液先進(jìn)行2倍稀釋，然后倒入托盤中與卵子充分混合，室溫靜置20 min后，加入20 ℃流動海水使其激活并均勻攪拌，5 min后放入網(wǎng)箱中孵化。用普通苗種培育方法培育。

減數(shù)分裂雌核發(fā)育二倍體(meiotic gynogenetic diploid，MGD)的誘導(dǎo)：雌性親魚為制備七彩鮭二倍體的同一批卵子；以七彩鮭作為同源精子，取2 mL精液用生理鹽水進(jìn)行50倍稀釋，經(jīng)UV滅活。其中，MGD誘導(dǎo)方法參照劉海金等[8]進(jìn)行。

1.2 固定液制備

取70 mL無水乙醇加入 0.01 mol/L的PBS中，定容到100 mL，至終濃度為70%；0.01 mol/L的PBS (pH 7.2)：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.58 g，去離子水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 7.2[9]。

1.3 單細(xì)胞懸液的制備

在待測細(xì)胞中加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃固定24 h。1 000g左右離心3～5 min，沉淀細(xì)胞。小心吸除上清，加入約1 mL冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

1.4 細(xì)胞計數(shù)

將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。吸取20 μL細(xì)胞懸液滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，靜置3 min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。然后放到光學(xué)顯微鏡下觀察并進(jìn)行計數(shù)，只計左側(cè)和上方細(xì)胞。然后按公式細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×104計算。(注意：鏡下偶見有兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團(tuán)在10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液)。

1.5 PI熒光染色

取制備好的胚胎單細(xì)胞懸液進(jìn)行PI染色，PI染色試劑盒購自碧云天生物科技有限公司，加染色緩沖液 0.5 mL；碘化丙啶染色液(20×) 25 μL；RNase A(50×) 10 μL。緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min。隨后可以4 ℃或冰浴避光存放。400目尼龍網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀(BD- LSRFortessaTM)上機(jī)檢測，波長為488 nm。

1.6 雌核發(fā)育二倍體微衛(wèi)星分析

取親本雌雄七彩鮭尾鰭鰭條并提取DNA，DNA的提取參照寶生生物有限公司DNA提取試劑盒。微衛(wèi)星引物摘自文獻(xiàn)[10]，上游引物：5′-CACGAGGAGTGTTCTCAATG-3′；下游引物：5′-AGTACTCTAACCACTAGGCTAC-3′。由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系參照張春雷等[11]所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增，顯影方法按照劉夢培等[12]新的微衛(wèi)星PAGE的DNA 顯帶方法進(jìn)行操作。

1.7 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

應(yīng)用modfit LT軟件進(jìn)行DNA含量分析，主要檢測指標(biāo)：CV值、G0/G1、SPF(S期細(xì)胞比率)和模擬細(xì)胞數(shù)。

樣品魚DNA絕對含量依照以下公式進(jìn)行計算：P1=E2/E1xP2(P1代表待檢七彩鮭DNA的絕對含量(pg/N)；P2表示標(biāo)準(zhǔn)雞紅細(xì)胞DNA的絕對含量(2.5 pg/N)，E1代表雞紅細(xì)胞的相對DNA含量，E2表示檢測七彩鮭魚苗的相對DNA含量。

2 結(jié)果

2.1 七彩鮭雌核發(fā)育DNA檢測直方圖

以雞紅細(xì)胞為內(nèi)參，用流式細(xì)胞儀測定30尾七彩鮭魚苗、30尾七彩鮭減數(shù)分裂雌核發(fā)育魚苗細(xì)胞含量，由圖1可知，橫坐標(biāo)表示七彩鮭細(xì)胞熒光頻道數(shù)，即魚細(xì)胞的相對DNA含量；縱坐標(biāo)表示檢測的細(xì)胞核數(shù)，(圖1B)中主要出現(xiàn)二個峰：第一個峰最高，其DNA 的相對含量最低，但細(xì)胞頻率最高，它代表細(xì)胞周期中的G0/G1期細(xì)胞；第二個峰最低，但 DNA 含量約等于前一個峰的二倍，其細(xì)胞率較低，它代表細(xì)胞周期中的G2/M 期細(xì)胞。圖中的圖像清晰干凈，前后無雜峰出現(xiàn)，CV值<8% ，表明樣品處理及檢測方法理想，結(jié)果可靠。從圖1看出雞紅細(xì)胞DNA相對含量為47.77(圖1A)；七彩鮭普通魚苗細(xì)胞DNA相對含量接近48(圖1B) ，七彩鮭雌核發(fā)育魚苗DNA相對含量接近49(圖1C)。

圖1 不同細(xì)胞DNA含量Fig.1 DNA content in different cells

2.2 七彩鮭魚苗、七彩鮭減數(shù)分裂魚苗細(xì)胞DNA含量與倍性

測定的七彩鮭魚苗與標(biāo)準(zhǔn)樣參照值的紅細(xì)胞核DNA絕對統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1 流式細(xì)胞儀檢測七彩鮭 DNA 含量Tab.1 The content of DNA in S.fontinalis by flow cytometry

從表1可知，測定30尾七彩鮭普通魚苗的DNA含量為2.58 pg/N，測定的30尾七彩鮭雌核發(fā)育魚苗的DNA含量為2.46。30尾七彩鮭雌核發(fā)育魚苗DNA=1.05∶1，比值接近1。根據(jù)DNA指數(shù)(DI)=1.0±0.1為二倍體，DI=1.5±0.15為三倍體的判斷依據(jù)[13]，可知檢測的30尾七彩鮭雌核發(fā)育魚苗均為二倍體，證明雌核發(fā)育減數(shù)分裂二倍體孵化成功。

2.3 微衛(wèi)星結(jié)果

采用微衛(wèi)星引物鑒定雌核發(fā)育家系的親本及其子代，母本親魚出現(xiàn)DNA條帶而父本親魚不出條帶，且雌核發(fā)育幼苗存在條帶證明雌核發(fā)育的遺傳物質(zhì)均來自于母本，異源精子(箭頭指向處)經(jīng)紫外線滅活后，其遺傳物質(zhì)已被破壞。其遺傳信息并沒有傳給子代。

圖2 微衛(wèi)星引物擴(kuò)增條帶Fig.2 microsatellite primers amplified bandsMaker為X174 Hinc II digest；1為母本條帶；6為父本條帶

3 討論

目前，魚類倍性檢測方法有染色體核型分析和流式細(xì)胞術(shù)，但染色體核型分析則需計數(shù)大量的中期分裂相細(xì)胞，方法復(fù)雜且費(fèi)時。近年來，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測DNA含量發(fā)現(xiàn)，DNA含量越高的七彩鮭其染色體數(shù)目也越多，倍性越大；反之，含量越低的七彩鮭，染色體數(shù)目就越少，倍性也就越小[14]，這與染色體核型分析的結(jié)果一致，故從核DNA含量鑒別倍性應(yīng)更加可靠。

雞紅細(xì)胞是用來檢測流式細(xì)胞儀變異系數(shù)(coeffience of variation，CV)穩(wěn)定性的質(zhì)控試劑，同時，在流式細(xì)胞儀上可將G0/G1期峰的雞紅細(xì)胞與正常細(xì)胞或超二倍體細(xì)胞完全分開，以確定正常組織細(xì)胞的二倍體DNA含量，故可以將雞紅細(xì)胞作為檢測的生物標(biāo)準(zhǔn)品使用[15]。并且利用流式細(xì)胞術(shù)，以雞紅細(xì)胞為內(nèi)參標(biāo)記，不僅可以準(zhǔn)確計算并識別多種待測樣品DNA倍體，還可以輔助流式檢測的質(zhì)量控制，簡便易行。

自然界中雌雄個體之間生長速度存在差異是一種普遍的現(xiàn)象，許多魚類，如真鯛、虹鱒、大黃魚、鯉等的雌性生長速度明顯快于雄性，因此，在相同養(yǎng)殖周期下，雌性相比于雄性魚類，具有更高的經(jīng)濟(jì)效益。之所以選擇人工誘導(dǎo)七彩鮭減數(shù)分裂雌核發(fā)育，是因為減數(shù)分裂雌核發(fā)育相比有絲分裂雌核發(fā)育操作簡便、易于誘導(dǎo)、成活率高，并在多數(shù)養(yǎng)殖場中獲得成功。

采用同源精子激活七彩鮭卵子，利用冷休克誘導(dǎo)七彩鮭的減數(shù)分裂雌核發(fā)育，并與哺乳類和水生實驗動物[8]相比較，MGD親子間的遺傳相似系數(shù)接近1，表明只經(jīng)過一代減數(shù)分裂雌核發(fā)育即可具備很高的遺傳相似度。利用魚類雌核發(fā)育的這一特點，篩選經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的母本，通過雌核發(fā)育技術(shù)固定母本性狀，可以加快新品種或新品系的培育進(jìn)程，縮短選育周期。

[1]龔雪芬,蘇軍虎.七彩鮭PAPD反應(yīng)體系的構(gòu)建及優(yōu)化[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011，46(5):12-17.

[2]沈連靜,李 壯.美洲紅點鮭的品種優(yōu)勢及開發(fā)、推廣前景[J].河北漁業(yè),2014，241(1):58-59.

[3]葛永春,吳旭干,姜曉東,等.河蟹雌雄分養(yǎng)對其亞成體養(yǎng)殖性能和性腺發(fā)育的影響[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報,2017,(2):221-226.

[4]杜立穎,馮仁青.流式細(xì)胞術(shù)[M].北京:北京大學(xué)出版社,2008：2-15.

[5]葉玉珍,吳清江.人工復(fù)合三倍體鯉與親本相對DNA含量及倍性分析[J].水生生物學(xué)報.1998,22(2):119-122.

[6]張之晟,董成穩(wěn),趙 俊，等.基于DNA 含量的復(fù)合鯽倍性分析[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006(1):99-103.

[7]耿 波,孫效文.流式細(xì)胞術(shù)在水生生物DNA含量和倍性分析中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)學(xué)雜志.2008,21(2):21-24.

[8]劉海金,侯吉倫,常玉梅,等.真鯛精子誘導(dǎo)牙鲆減數(shù)分裂雌核發(fā)育[J].水產(chǎn)學(xué)報.2010,34(4):508-514.

[9]楊翟平,劉 奕，等.虹鱒胚胎組織單細(xì)胞懸液制備方法的研究[J].水產(chǎn)學(xué)雜志.2010,23(3):40-43.

[10] Holm L E，Loeschcke V，Bendixen C.Elucidation of the molecular basis of a null allele in a rainbow trout microsatellite [J].Mar Biotechnol，2001，6(3)：555-560.

[11]張春雷,佟廣香.哲羅魚微衛(wèi)星親子鑒定的應(yīng)用[J].動物學(xué)研究.2010,31(4):394-400.

[12]劉夢培,田 敏,傅大立,等.一種新的微衛(wèi)星PAGE的DNA顯帶方法[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,17:145-148.

[13]凌山鳳,黃根東,王松剛.“中科3號”異育銀卿無公害清潔生產(chǎn)技術(shù)[J].科學(xué)養(yǎng)魚,2013,(8):89-90.

[14] Hinegardner R，Rosen D E.Cellular DNA content and the evolution of teleostean fishes [J].Am Nat，1972，951(106)：621-644.

[15] Darzynkiewicz Z，Juan G.DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis.In：Current protocols in cytometry [M].New York：John Wiley & Sons，Inc，2003：861-876.

ResearchaboutgynogenesisandploidyinSalvelinusfontinalis

DAI Jing1,JIAO Xue1，ZHANG Pei-jun2，LENG Dong-ze1，BA Cui-yu1，MAO An-ting1，LI Yue-hong1

(1.JilinAgriculturalUniversity，Changchun130000，China；2.JilinProvinceHealthSurveillanceInspectionCenter，Changchun130000，China)

The use of ultraviolet irradiation onSalvelinusfontinalissperm quenching treatment，the genetic inactivation，as homologous sperm inducement and withS.fontinaliseggs were fertilized by cold shock induced gynogenesis.The results showed that the homologous sperm could induce theS.fontinalisgynogenesis，the intensity of ultraviolet irradiation for 72 mJ/cm2；distance of 8 cm；cold shock temperature is -20 ℃.S.fontinalismeiotic division female nucleus development of ploidy determination in Gallus sp..red blood cell DNA content 2.5 pg/N standards，S.fontinaliscommon raising seedling generation as a reference，using flow cytometry and micro satellite markers for the determination of 30S.fontinalismeiotic division gynogenetic fry were analyzed.Proof of the gynogenetic diploid gynogenetic fry for.

Salvelinusfontinalis；gynogenesis；flow cytometry；DNA content；microsatellite markers

2017-04-30；

2017-08-04

國家自然科學(xué)基金(30972191)；吉林省留學(xué)人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(201523)；長春市農(nóng)業(yè)先進(jìn)實用技術(shù)的示范推廣項目(20130215)

代 靜(1995- )，女，碩士，專業(yè)方向為病原微生物免疫學(xué)。E-mail：2291667665@qq.com，Tel：18844146100。

李月紅。E-mail：liyhong@sina.com

S917.4

A

1000-6907-(2017)06-0021-05