高平章,齊 肖,謝曉蘭,黃曉平,林惠彬

(1.泉州師范學(xué)院化工與材料學(xué)院，福建泉州 362000；2.惠安縣凈峰鎮(zhèn)政府，福建惠安 362100)

養(yǎng)殖水體鄰苯二甲酸二乙酯暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶的影響

高平章1,齊 肖1,謝曉蘭1,黃曉平1,林惠彬2

(1.泉州師范學(xué)院化工與材料學(xué)院，福建泉州 362000；2.惠安縣凈峰鎮(zhèn)政府，福建惠安 362100)

鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)是常用的塑化劑，也是環(huán)境廣泛存在的內(nèi)分泌干擾物。采用酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分析養(yǎng)殖水體DEP暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)殼膜幾丁質(zhì)酶的比活力和酶系列基因mRNA表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示不同濃度組的DEP暴露對(duì)殼膜幾丁質(zhì)酶比活力的影響不具有顯著性；10 μg/L DEP暴露120 h后，對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶系的LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT7等三個(gè)基因的mRNA表達(dá)量均被顯著抑制，但隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，這種顯著性差異轉(zhuǎn)化成非顯著性；而20 μg/L DEP脅迫對(duì)LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT7等三個(gè)基因的mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著性影響，不同濃度組的DEP暴露不同時(shí)間后對(duì)LV-CHT5、LV-CHT6兩個(gè)基因的mRNA表達(dá)量也均不具有顯著性影響。

鄰苯二甲酸二乙酯；凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)；殼膜幾丁質(zhì)酶；酶比活力；酶mRNA表達(dá)量

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對(duì)蝦、萬(wàn)氏對(duì)蝦等，原產(chǎn)于秘魯北部至墨西哥桑諾拉一帶的太平洋沿岸水域，生長(zhǎng)于熱帶、亞熱帶、暖溫帶、溫帶海域。隨著人工養(yǎng)殖大規(guī)模增加，凡納濱對(duì)蝦已成為世界對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大品種之一。泉州地處沿海地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)比較發(fā)達(dá)，但養(yǎng)殖環(huán)境的污染特別是水質(zhì)中嚴(yán)重超標(biāo)的金屬離子、有機(jī)化合物等都將引起對(duì)蝦體內(nèi)生理生化的變化，導(dǎo)致對(duì)蝦蛻殼困難、生長(zhǎng)滯緩、患病率和死亡率升高等問(wèn)題的出現(xiàn)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

鄰苯二甲酸酯類(Phthalic Acid Esters，簡(jiǎn)稱PAEs)又稱酞酸酯，作為塑化劑被廣泛應(yīng)用于塑料、涂料、醫(yī)藥、化妝品等產(chǎn)品。研究發(fā)現(xiàn)PAEs類化合物是一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有雌激素樣活性，能對(duì)生物的正常行為及生殖、發(fā)育相關(guān)的激素代謝過(guò)程產(chǎn)生影響，其在環(huán)境中富集和隨食物鏈遷移將成為水生動(dòng)物乃至人類的潛在威脅[2]。鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)是美國(guó)國(guó)家環(huán)保局(EPA)列出的6種優(yōu)先控制的PAEs有毒污染物之一，也是我國(guó)確定的3種PAEs環(huán)境優(yōu)先控制污染物之一[3]。我國(guó)水體的PAEs檢出率較高，其中福建九龍江水樣含有多種PAEs類化合物，最主要的污染物是鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP) 和DEP，含量分別達(dá)17.2 和11.7 μg/L[4]。泉州灣表層海水中各種PAEs類化合物含量均值為82.28 ng/L，DBP、DEP 和鄰苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯(DEHP)是主要成分，占總含量的71.15%[5]。水生動(dòng)物對(duì)PAEs 有較強(qiáng)的生物富集能力，故近年來(lái)關(guān)于PAEs在水產(chǎn)品中的富集及毒性報(bào)道不少，姜琳琳[6]調(diào)查了閩南沿海地區(qū)各類水產(chǎn)品中的PAEs殘留水平，發(fā)現(xiàn)海水魚(yú)類、淡水魚(yú)類、蝦類、蟹類、貝類等水產(chǎn)品體內(nèi)均含有不同量的PAEs，殘留量為貝類>淡水魚(yú)>蝦≈蟹>海水魚(yú)。王興強(qiáng)等[7]研究發(fā)現(xiàn)DEP暴露會(huì)導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦血清蛋白含量、血清酚氧化酶和超氧化歧化酶活性降低，蝦免疫能力與存活率下降。但目前未見(jiàn)DEP等PAEs污染物對(duì)凡納濱對(duì)蝦健康發(fā)育密切相關(guān)的幾丁質(zhì)酶系的影響研究。幾丁質(zhì)酶是多基因家族，廣泛分布在蝦蟹等甲殼動(dòng)物的內(nèi)臟、殼膜等組織中，與甲殼動(dòng)物的蛻殼、孵化、食物消化及抗菌防御等密切相關(guān)。研究人員已克隆出7個(gè)凡納濱對(duì)蝦幾丁質(zhì)酶基因(LV-CHT1、LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT4、LV-CHT5、LV-CHT6、LV-CHT7)，并分析該基因家族各成員的功能分工，LV-CHT1、LV-CHT3和LV-CHT4基因編碼的幾丁質(zhì)酶不僅具有消化酶的功能，還與抗病防御和圍食膜蛻換有關(guān)；LV-CHT2、LV-CHT6和LV-CHT7基因編碼的幾丁質(zhì)酶與對(duì)蝦的周期性蛻殼密切相關(guān)；LV-CHT5基因編碼的幾丁質(zhì)酶與對(duì)蝦的先天免疫有關(guān)[8-9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體的DEP暴露實(shí)驗(yàn)，采用酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力及酶系列基因 mRNA表達(dá)量變化，研究結(jié)果將闡明DEP對(duì)與對(duì)蝦蛻殼生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的殼膜幾丁質(zhì)酶系的影響機(jī)制，同時(shí)有助于了解DEP暴露對(duì)對(duì)蝦的毒理機(jī)制及為養(yǎng)殖水體塑化劑的監(jiān)控提供理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：凡納濱對(duì)蝦(購(gòu)于泉州秀土對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng))，體長(zhǎng)約(9.0±1.0) cm

實(shí)驗(yàn)試劑：考馬斯亮藍(lán)G-250(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；鄰苯二甲酸二乙酯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；牛血清白蛋白(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；葡萄糖(天津市福晨化學(xué)試劑廠)；其他化學(xué)試劑均為西隴化工股份有限公司。使用的蒸餾水均為玻璃重蒸水。RNA提取試劑盒(OMEGA bio-tek公司)；5×PrimeScript Buffer(TaKaRa公司)；Taq酶(TaKaRa公司)；相關(guān)引物均為上海生物工程股份有限公司合成。Beta-actin基因引物：Beta-actin-F：5′-TACACCTTCACGACCACCGC-3′、Beta-actin-R：5′-TCTCCAGCGAGGAGGAGGAA-3′ ；幾丁質(zhì)酶系基因引物：

LV-CHT2-F:5′-CGGCAAGTACAGACCTGAAGACAT-3′

LV-CHT2-R:5′-AATCATAATCAGCCCAAGTGTCGTG-3′

LV-CHT3-F:5′-AACACCTCCGGCGGTTACAA-3′

LV-CHT3-R:5′-ACACCGAAGCCCAATCG-3′

LV-CHT5-F:5′-TGTCTCCGCTTTGGTGAGG-3′

LV-CHT5-R:5′-ATGGTGGTGGGCGTATTGTT-3′

LV-CHT6-F:5′-CGCTTTCATCCAACACCACC-3′

LV-CHT6-R:5′-CCTCGCGGAGTTCCTTAACC-3′

LV-CHT7-F:5′-CTTGTTCCAGATGGCACTGTATTT-3′

LV-CHT7-R:5′-TGGTTCTTGTTCAGGTGTCTTTTC-3′)

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 凡納濱對(duì)蝦DEP暴露實(shí)驗(yàn)

養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)置對(duì)蝦在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)穩(wěn)定后，挑選同一生長(zhǎng)期的對(duì)蝦在50 cm×35 cm×30 cm的養(yǎng)殖桶中進(jìn)行暴露養(yǎng)殖。暴露養(yǎng)殖條件：養(yǎng)殖桶放水體20 L，對(duì)蝦50尾，水溫為(22±1) ℃，鹽度為10，pH值為7.6，DEP 暴露濃度分別為0(對(duì)照)、10、20 μg/L，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行組。實(shí)驗(yàn)期間，每天持續(xù)增氧，定時(shí)換水。暴露120 h、240 h后分別取樣備用。

1.2.2 凡納濱對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶的抽提制備

凡納濱對(duì)蝦在1.2.1的暴露養(yǎng)殖條件下暴露一定時(shí)間后，每個(gè)濃度組取6條蝦，用蒸餾水將蝦體沖洗干凈，用吸水紙吸干蝦體表面水分后，分別取殼膜，研磨均勻，加入預(yù)冷的Tris-HCl(pH7.5)緩沖液1 mL，4 ℃下抽提1 h后，12 000 r/min冷凍離心20 min，收集上清液得幾丁質(zhì)酶粗酶液，冷凍備用。

1.2.3 酶蛋白濃度、酶活力及酶比活力測(cè)定

按考馬斯亮藍(lán)法[10]，采用試劑空白，用UV-1800紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白(牛血清白蛋白)溶液經(jīng)染色反應(yīng)后在595 nm下的吸光度值(OD值)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量(μg)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=4.6×10-3×X,R2= 0.992 3。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程測(cè)定酶蛋白溶液。

[11]，以N-乙酰氨基葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)物，采用DNS法測(cè)定還原糖濃度，以N-乙酰氨基葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，500 nm處的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線得方程Y=1.25X，R2= 0.998。根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]，往0.5 mL 0.1 mol/L pH 6.0磷酸緩沖液中加入等體積的1% 膠體幾丁質(zhì)溶液，混勻后在45 ℃下預(yù)熱10 min，加入0.3 mL幾丁質(zhì)酶液和0.2 mL蒸餾水，反應(yīng)1 h后，沸水浴20 min終止反應(yīng)，并迅速冷卻后加入1.5 mL DNS試劑，再沸水浴20 min后，冷卻至室溫再用蒸餾水定容至25 mL，搖勻后離心取上清，試劑空白，在500 nm下測(cè)吸光度，根據(jù)還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線換算酶解產(chǎn)物N-乙酰氨基葡萄糖含量。以N-乙酰氨基葡萄糖的生成速度來(lái)衡量幾丁質(zhì)酶活性大小。

酶活力單位(u)的定義：在溫度45 ℃、pH 6.0的測(cè)活條件下，每小時(shí)水解膠體幾丁質(zhì)生成1 μg N-乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量為一個(gè)活力單位；比活力定義為每毫克酶蛋白具有的酶活力單位數(shù)。

1.2.4 總RNA提取、純化與反轉(zhuǎn)錄

快速取殼膜的一小部分(大約100 mg)加入1 mL RNA-Slove regent和3顆鋼珠，用勻漿機(jī)勻漿三分鐘，4 ℃放置30 min，加入200 μL氯仿，混勻，在冰上放置10 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液加入250 μL無(wú)水乙醇混勻，用HiBind RNA Spin柱子過(guò)濾，分別用300 mL與400 mL Wash Buffer I、兩次500 mL Wash Buffer II各沖洗柱子，并在10 000 r/min離心1 min去除濾液，在14 000 r/min離心2 min甩干，用40 μL DEPC-水將mRNA溶解轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即得到總RNA。用微量核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA濃度。

RT-PCR反應(yīng)體系：2 μL的5×PrimeScript Buffer(含有PrimeScriptRTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反應(yīng)Buffer)，500 ng RNA，最后用DEPC-水補(bǔ)足至10 μL，反應(yīng)條件為：37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85 ℃反轉(zhuǎn)錄酶失活5 s。在該反轉(zhuǎn)錄體系及條件下反轉(zhuǎn)錄得cDNA。

1.2.5 幾丁質(zhì)酶的實(shí)時(shí)熒光定量PCR及mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

在LightCycle 480 II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：Taq酶(含有TaKaRa Ex Taq HS DNA Polymerase,dNTP mixture,Mg2+,Tli RNaseH和SYBR Green I.)10 μL，前后引物各0.8 μL(0.4 μmol/L)，DEPC-水6.4 μL，cDNA模板2 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，共1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.6 DEP暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶系基因的mRNA表達(dá)量影響測(cè)定

按1.2.1暴露方法進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，暴露一定時(shí)間后，每個(gè)濃度組取6條蝦(同1.2.2的對(duì)蝦樣品)，用蒸餾水將蝦體沖洗干凈，用吸水紙吸干蝦體表面水分后，快速取蝦殼的一小部分，按1.2.4方法提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按1.2.5方法分別對(duì)凡納濱對(duì)蝦的內(nèi)參基因Beta-actin和幾丁質(zhì)酶系基因LV-CHT1、LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT4、LV-CHT5、LV-CHT6、LV-CHT7進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，PCR反應(yīng)結(jié)束，記錄其復(fù)制次數(shù)。以Beta-actin為內(nèi)參，根據(jù)文獻(xiàn)[13]公式CT=(CT,Target-CT,Actin)Time x-(CT,Target-CT,Actin)Time 0，用濃度代替其中的時(shí)間即可計(jì)算在不同濃度下的CT值，再計(jì)算即可得出各基因相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理和分析

采用 SPSS 20.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差(ANOVA)和Duncan統(tǒng)計(jì)分析.得到平均值和標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD)，當(dāng)P<0.05時(shí)，表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1DEP暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力影響

以水體終濃度分別為0、10、20 μg/L的DEP進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦暴露養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，分別在暴露120 h、240 h后取樣，分析測(cè)定殼膜幾丁質(zhì)酶的比活力，由圖 1可見(jiàn)，與非暴露組的對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力比較，養(yǎng)殖水體DEP暴露120 h后，暴露組的殼膜幾丁質(zhì)酶比活力隨著DEP暴露濃度增大出現(xiàn)先下降后回升的趨勢(shì)，10 μg/L的DEP使對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力下降了32.4%，但20 μg/L的DEP暴露下，對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力基本沒(méi)有變化，統(tǒng)計(jì)分析各濃度組幾丁質(zhì)酶比活力差異不具有顯著性。但隨著DEP暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)暴露240 h后，DEP的脅迫激活了對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力，10、20 μg/L的DEP 分別使幾丁質(zhì)酶比活力上升了138.7%、71.0%，但這種激活作用也沒(méi)有顯著性。

圖1 DEP暴露不同時(shí)間后凡納濱對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力比較.

2.2DEP暴露對(duì)對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶系基因的mRNA表達(dá)量影響

通過(guò)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體的DEP暴露實(shí)驗(yàn)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶系基因LV-CHT1、LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT4、LV-CHT5、LV-CHT6、LV-CHT7的 mRNA表達(dá)量變化，結(jié)果表明，DEP暴露前后，凡納濱對(duì)蝦殼膜部位均檢測(cè)不到LV-CHT1和LV-CHT4基因的表達(dá)；但能檢測(cè)到LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT5、LV-CHT6和LV-CHT7基因的表達(dá)，且在不同濃度的DEP暴露不同時(shí)間后，各基因的mRNA表達(dá)量均發(fā)生不同程度變化。

2.2.1 DEP暴露對(duì)對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT2基因的mRNA表達(dá)量影響

凡納濱對(duì)蝦分別在含不同濃度DEP的養(yǎng)殖水體中暴露不同時(shí)間后取樣，分析測(cè)定殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT2基因的mRNA表達(dá)量。圖 2結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，凡納濱對(duì)蝦在含不同濃度DEP的水體中脅迫養(yǎng)殖120 h與240 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT2基因的mRNA表達(dá)量均呈現(xiàn)先抑后揚(yáng)趨勢(shì)。與其它濃度組相比，10 μg/L的DEP脅迫120 h后讓殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT2基因的mRNA表達(dá)量出現(xiàn)顯著性下降，而20 μg/L的DEP脅迫120 h則使mRNA表達(dá)量上升，這種上升趨勢(shì)與空白對(duì)照組比較不具有顯著性，但與10 μg/L濃度組相比具有顯著性。DEP暴露240 h后，10 μg/L的DEP使殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT2基因的mRNA表達(dá)量明顯下降，而20 μg/L的DEP使mRNA表達(dá)量大幅上升，但統(tǒng)計(jì)分析顯示各濃度組間不存在顯著性差異。

圖2 DEP暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦幾丁質(zhì)酶LV-CHT2基因的mRNA表達(dá)量影響.

2.2.2 DEP暴露對(duì)對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT3基因的mRNA表達(dá)量影響

由圖3可見(jiàn)，與對(duì)照組相比較，凡納濱對(duì)蝦在含不同濃度DEP的水體中脅迫養(yǎng)殖120 h與240 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT3基因的mRNA表達(dá)均被抑制。與其它濃度組相比，對(duì)蝦在10 μg/L的DEP水體中脅迫120 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT3基因的mRNA表達(dá)量出現(xiàn)顯著性大幅度下降，20 μg/L的DEP脅迫120 h也使mRNA表達(dá)量下降，這種下降趨勢(shì)與空白對(duì)照組比較不具有顯著性，但與10 μg/L濃度組相比具有顯著性。DEP暴露240 h后，與對(duì)照組相比，不同濃度暴露組的殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT3基因的mRNA表達(dá)受抑制程度相當(dāng)，且抑制趨勢(shì)均不具有顯著性。

圖3 DEP暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦幾丁質(zhì)酶LV-CHT3基因的mRNA表達(dá)量影響

2.2.3 DEP暴露對(duì)對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT5基因的mRNA表達(dá)量影響

由圖4可知，與對(duì)照組相比較，凡納濱對(duì)蝦分別在含10、20 μg/L的DEP水體中脅迫養(yǎng)殖120 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT5基因的mRNA表達(dá)均被小幅抑制，且抑制程度相當(dāng)，統(tǒng)計(jì)分析表明不同濃度組間的mRNA表達(dá)量不具有顯著性差異。而凡納濱對(duì)蝦分別在含10、20 μg/L的DEP水體中脅迫養(yǎng)殖240 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT5基因的mRNA表達(dá)均被小幅激活，且激活程度相當(dāng)，統(tǒng)計(jì)分析表明不同濃度組間的mRNA表達(dá)量同樣不具有顯著性差異。

圖4 DEP暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦幾丁質(zhì)酶LV-CHT5基因的mRNA表達(dá)量影響.

2.2.4 DEP暴露對(duì)對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT6基因的mRNA表達(dá)量影響

圖5結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，凡納濱對(duì)蝦在含不同濃度DEP的水體中脅迫養(yǎng)殖120 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT6基因的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)先激活后抑制趨勢(shì)。與對(duì)照組比較，10 μg/L的DEP脅迫120 h后使殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT6基因的mRNA表達(dá)量上升了72.4%；而20 μg/L的DEP使mRNA表達(dá)量下降了25.8%，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析比較不同濃度組間的表達(dá)量差異，結(jié)果表明不具有顯著性。當(dāng)DEP暴露延長(zhǎng)至240 h后，與對(duì)照組比較，不同濃度暴露組均因DEP的脅迫使殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT6基因的mRNA表達(dá)被激活，激活程度隨著DEP濃度增大而增大，但激活趨勢(shì)不具有顯著性。

圖5 DEP暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦幾丁質(zhì)酶LV-CHT6基因的mRNA表達(dá)量影響.

2.2.5 DEP暴露對(duì)對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT7基因的mRNA表達(dá)量影響

由圖6可見(jiàn)，與對(duì)照組相比較，凡納濱對(duì)蝦在含10 μg/L 的DEP水體中脅迫養(yǎng)殖120 h后，殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT7基因的mRNA表達(dá)被顯著性抑制，表達(dá)量下降了57.0%。而20 μg/L的DEP脅迫120 h后也使殼膜幾丁質(zhì)酶LV-CHT7基因的mRNA表達(dá)量下降了14.0%，但這種下降趨勢(shì)與其它濃度組相比不具有顯著性。凡納濱對(duì)蝦在含不同濃度DEP中暴露240 h后，LV-CHT7基因的mRNA表達(dá)量也均受到不同程度抑制，10 μg/L的DEP對(duì)LV-CHT7基因的mRNA表達(dá)抑制程度比20 μg/L的DEP抑制程度大，但不同濃度的DEP脅迫對(duì)LV-CHT7基因的mRNA表達(dá)量影響均不具有顯著性。

圖6 DEP暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦幾丁質(zhì)酶LV-CHT7基因的mRNA表達(dá)量影響.

3 討論

DEP是一種塑化劑，是生產(chǎn)聚氯乙烯的原料，伴隨著我國(guó)聚氯乙烯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，DEP造成的水質(zhì)污染日趨嚴(yán)重。該物質(zhì)已成為水環(huán)境中檢出最多的有機(jī)污染物之一[14]。王興強(qiáng)等[7]對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行DEP暴露實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)90 d的暴露實(shí)驗(yàn)，由于蝦一直處于應(yīng)激狀態(tài)，不斷消耗對(duì)蝦體內(nèi)免疫因子，最終導(dǎo)致血清蛋白、血清酚氧化酶和超氧化歧化酶等免疫因子含量及活性下降，對(duì)蝦免疫系統(tǒng)崩潰，導(dǎo)致對(duì)蝦生理機(jī)能失調(diào)，影響對(duì)蝦生長(zhǎng)。幾丁質(zhì)酶在對(duì)蝦生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮多種生化功能，具有促進(jìn)幾丁質(zhì)類食物消化吸收、調(diào)控圍食膜和外殼周期性蛻換及抗菌防御等作用[9]。本研究考察DEP暴露120 h和240 h對(duì)凡納濱對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶的影響，結(jié)果表明不同濃度組的DEP暴露對(duì)殼膜幾丁質(zhì)酶比活力的影響不具有顯著性；但比較同一濃度組暴露不同時(shí)間的殼膜幾丁質(zhì)酶比活力，結(jié)果顯示非暴露組的殼膜幾丁質(zhì)酶比活力基本不變，而暴露組隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)酶比活力明顯提高，說(shuō)明DEP脅迫對(duì)殼膜幾丁質(zhì)酶比活力有促進(jìn)作用，對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶對(duì)養(yǎng)殖水體DEP的存在會(huì)表現(xiàn)出應(yīng)激反應(yīng)。幾丁質(zhì)酶活力變化趨勢(shì)與王興強(qiáng)等[7]的DEP暴露實(shí)驗(yàn)后的酚氧化酶、超氧化歧化酶的變化趨勢(shì)相反，這可能與幾丁質(zhì)酶具有多種生理功能作用有關(guān)，也可能與暴露時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。

為了進(jìn)一步了解PAEs 對(duì)凡納濱對(duì)蝦的免疫毒性和發(fā)育毒性，故本研究進(jìn)一步考察了DEP暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶系基因的影響。結(jié)果顯示10 μg/L DEP暴露120 h后，對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶系的LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT7等三個(gè)基因的mRNA表達(dá)量均是被顯著抑制，但隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)到240 h，這種顯著性差異轉(zhuǎn)化成非顯著性；20 μg/L DEP脅迫對(duì)LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT7等三個(gè)基因的mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著性影響，不同濃度組的DEP脅迫對(duì)LV-CHT5、LV-CHT6等兩個(gè)基因的mRNA表達(dá)量影響也沒(méi)有顯著性。進(jìn)一步分析同濃度組不同暴露時(shí)間點(diǎn)各個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的mRNA表達(dá)量差異，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)考察過(guò)程中，對(duì)照組的各個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的mRNA表達(dá)量均比較穩(wěn)定，而DEP暴露組中，除了LV-CHT7基因的mRNA表達(dá)量基本不受暴露時(shí)間影響，LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT5和LV-CHT6基因的mRNA表達(dá)量均會(huì)受暴露時(shí)間影響。DEP暴露組的殼膜LV-CHT2及LV-CHT5基因的mRNA表達(dá)量均隨DEP脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而上調(diào)；10 μg/L DEP暴露會(huì)隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)使殼膜LV-CHT3基因的mRNA表達(dá)量提高，但在20 μg/L DEP暴露過(guò)程中比較穩(wěn)定；殼膜LV-CHT6基因在10 μg/L DEP暴露下，會(huì)隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)mRNA表達(dá)量被輕微回調(diào)，但20 μg/L DEP則隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)mRNA表達(dá)量被大幅度提高。可見(jiàn)，DEP暴露對(duì)對(duì)蝦殼膜各個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的mRNA表達(dá)具有影響，時(shí)間延長(zhǎng)基本上導(dǎo)致LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT5和LV-CHT6基因的mRNA表達(dá)量上調(diào)。Zhao等[15]研究也表明凡納濱對(duì)蝦感染白斑病毒后，體內(nèi)幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)上調(diào)。Zhao等和本實(shí)驗(yàn)室DEP脅迫研究結(jié)果說(shuō)明，在外界脅迫影響和體內(nèi)病毒感染情況下，對(duì)蝦產(chǎn)生的免疫反應(yīng)會(huì)使體內(nèi)幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)上調(diào)，這種基因表達(dá)影響將導(dǎo)致酶活力受影響，從而導(dǎo)致對(duì)蝦的蛻殼生長(zhǎng)發(fā)育受影響。

進(jìn)一步整體分析DEP暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶活力及基因表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)DEP暴露對(duì)酶活力及基因表達(dá)的影響趨勢(shì)基本一致，短時(shí)間低濃度DEP脅迫對(duì)對(duì)蝦殼膜幾丁質(zhì)酶mRNA的表達(dá)量和比活力具有抑制現(xiàn)象，這應(yīng)該是對(duì)蝦對(duì)外界DEP脅迫產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。而隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，殼膜幾丁質(zhì)酶的mRNA表達(dá)量和酶比活力均出現(xiàn)上升趨勢(shì)，這種趨勢(shì)與王興強(qiáng)等[7]研究發(fā)現(xiàn)的免疫因子活力受DEP長(zhǎng)期脅迫后呈現(xiàn)的下降趨勢(shì)相反，可見(jiàn)，在我們實(shí)驗(yàn)考察的時(shí)間范圍內(nèi)，DEP脅迫沒(méi)有引起對(duì)蝦的免疫系統(tǒng)崩潰，反而是啟動(dòng)應(yīng)激免疫調(diào)控系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，但這種免疫應(yīng)答反應(yīng)隨著暴露時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)是否將會(huì)再發(fā)生改變，這還有待今后進(jìn)一步研究。

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EffectsofdiethylphthalateexposureonchitinasefromepidermisofLitopenaeusvannamei

GAO Ping-zhang1,QI Xiao1,XIE Xiao-lan1,HUANG Xiao-ping1,LIN Hui-bin2

(1.CollegeofChemicalEngineeringandMaterials,QuanzhouNormalUniversity,QuanzhouFujian362000,China; 2.JingfengTownGovernment,HuianCounty,Huian362100Fujian,China)

Diethyl phthalate (DEP) is one of the commonly used plasticizers.It is also a widespread environmental endocrine disruptors.In this paper,the effects of DEP exposure on the activity and mRNA expressions ofLitopenaeusvannameiepidermal chitinase were investigated using enzymatic reaction dynamic method and the real-time fluorescent quantitative PCR.The results showed that DEP exposure have no significant influence on the activity of epidermal chitinase.The mRNA expressions of epidermal chitinase gene such as LV-CHT2,LV-CHT3,LV-CHT7 were significantly inhibited after exposure to 10 μg/L DEP for 120 hrs.However,data significance disappeared when the exposures were continued.The 20 μg/L DEP had no significant effects on the mRNA expression of LV-CHT2,LV-CHT3 and LV-CHT7.Similar effects was observed for the mRNA expressions of LV-CHT5 and LV-CHT6 after DEP exposure.

diethyl phthalate;Litopenaeusvannamei;epidermal chitinase;enzymatic activity;mRNA expression

2017-03-28；

2017-09-25

國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(31302190)；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012J01047)；泉州市優(yōu)秀人才培養(yǎng)專項(xiàng)(16D04)

高平章(1980- )，男，博士，副教授，研究方向?yàn)樗幚砑岸纠硇?yīng)研究。E-mail:gaopingzhang@126.com

謝曉蘭。E-mail:xxl_qztc@163.com

X524

A

1000-6907-(2017)06-0101-07