游燕，牛延菲，張曉南，普冰清，和東陽，劉慧

HPLC測定膽清片中虎杖苷的含量

游燕，牛延菲，張曉南，普冰清，和東陽，劉慧

目的：建立高效液相色譜法測定膽清片中虎杖苷的含量，為該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供科學(xué)依據(jù)。方法：色譜柱采用Agilent ZORBAX SB C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動相為水-乙腈(80:20)；流速:1.0 mL﹒min-1，柱溫:30 ℃；檢驗(yàn)波長為306 nm；進(jìn)樣體積10 μL。結(jié)果：虎杖苷進(jìn)樣量在0.0047 μg～2.3500 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.9998)，平均回收率為98.56%，RSD值為3.43%(n=9)。結(jié)論：HPLC法測定虎杖苷的含量簡單、準(zhǔn)確，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可作為膽清片中虎杖苷含量測定質(zhì)量控制方法。

膽清片；虎杖苷；高效液相色譜法

膽清片(糖衣片)為云南白藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，由虎杖、竹葉柴胡、梔子、香附(醋炙)四味中藥材加工而成，有清化濕熱、疏肝利膽的作用，用于慢性膽囊炎肝膽濕熱證。其中虎杖為處方中君藥，是蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖及根，性寒、味苦，歸肝、膽、肺經(jīng)[1]，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效?；⒄溶帐腔⒄鹊奶卣鞒煞郑休^強(qiáng)的抗肝損傷能力，具有保肝利膽和抗菌的作用，主要用于治療膽石癥、膽囊炎、急慢性肝炎等病癥[2～6]。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中膽清片的含量測定是以紫外分光光度法測定大黃素含量，隨著藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求提高，建立準(zhǔn)確、穩(wěn)定地測定膽清片中虎杖苷含量的方法就顯得非常有必要。本文采用HPLC法對膽清片中虎杖苷進(jìn)行含量測定以及方法學(xué)驗(yàn)證，旨在建立一種準(zhǔn)確可行的測定虎杖苷含量分析方法，以期更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

美國Agilent高效液相色譜儀(Agilent 1200，美國安捷倫科技有限公司)；超聲波清洗儀(SK3200 LH，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；電子天平(AG 285型，梅特勒-托利多公司)；純水機(jī)(Advantage A10，Milli-Q)；電熱恒溫水浴鍋(XMTD-4000，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

1.2 試藥

膽清片，由云南白藥集團(tuán)股份有限公司提供，批號為040210、040728、050315、050824、070330、080425、080811、090108、101116、120109；膽清片缺少虎杖的陰性樣品由云南白藥集團(tuán)股份有限公司提供。

虎杖苷對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號：111575-200502，純度99.9%)；所用流動相水為超純水，乙腈為色譜純，處理樣品的乙醇為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：水-乙腈(80:20)等度洗脫；柱溫：30℃；檢驗(yàn)波長：306 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL﹒min-1。理論塔板數(shù)按虎杖苷計(jì)算不低于4000，在該色譜條件下，供試品、對照品分離較好，與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取經(jīng)五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的虎杖苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 mL含20 μg溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取膽清片10片，去除糖衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取約0.1 g，精密加入稀乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。按上述供試品溶液處理方法制備陰性供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按供試品溶液制備方法制備供試品溶液和缺虎杖的陰性供試品溶液，按上述項(xiàng)色譜條件，分別進(jìn)樣對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液、空白溶液各10 μL。結(jié)果見圖1，由圖譜可以看出供試品溶液色譜中與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上有相同的色譜峰出現(xiàn)，而陰性供試品溶液和空白溶液無此峰出現(xiàn)，表明處方中其他成分對成品中虎杖苷的含量測定無干擾。

圖1 虎杖苷HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取經(jīng)五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的虎杖苷對照品11.75 mg，置25 mL棕色容量瓶，加稀乙醇制成虎杖苷濃度為0.47 mg﹒mL-1的對照品儲備液，再逐級稀釋成濃度為235 μg﹒mL-1，94 μg﹒mL-1，47 μg﹒mL-1，23.5 μg﹒mL-1，9.4 μg﹒mL-1，4.7 μg﹒mL-1，2.35 μg﹒mL-1，0.94 μg﹒mL-1，0.47 μg﹒mL-1的系列對照品溶液，按上述項(xiàng)色譜條件測定。以虎杖苷吸收峰面積的積分值為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=3854.7X+6.2646，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，虎杖苷在0.0047 μg～2.3500 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，符合要求。

2.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取經(jīng)五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的虎杖苷對照品12.5 mg，置25 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液。分別精密吸取上述對照品溶液0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL各三份，共九份，自然揮干溶劑后，精密加入已知含量(0.59%)同一批號樣品約0.05 g，按供試品溶液制備方法制備，將處理好的供試品溶液按含量測定方法測定，結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，該分析方法回收率在93.66%～101.46%之間，平均回收率為98.56%，RSD值為3.43%(n=9)，回收率良好。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果表

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 方法精密度試驗(yàn) 精密吸取虎杖苷對照品溶液(23.5 μg﹒mL-1)，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積，RSD值為0.68%(n=6)，結(jié)果表明本法具有良好的方法精密度。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號樣品(批號為：120109)6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，虎杖苷在樣品中的平均含量為0.59%，RSD值為1.72%(n=6)，結(jié)果表明本法具有良好的重復(fù)性。

2.6.3 中間精密度試驗(yàn) 精密稱取同一批號樣品(批號為：120109)2份，由兩位分析人員在不同時間按照“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，使用不同高效液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，虎杖苷在樣品中的含量為0.58%，RSD值為1.0%(n=4)，結(jié)果表明本法具有良好的中間精密度。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別于0 h、4 h、6 h、12 h、24 h進(jìn)樣，測定峰面積，虎杖苷峰面積RSD值為0.84%(n=5)，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 樣品測定

取10批樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，同時按上述“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中虎杖苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 10批樣品虎杖苷測定結(jié)果表

3 討論

3.1 提取溶劑、提取方法選擇

根據(jù)虎杖的理化性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)參考2015版中國藥典一部虎杖項(xiàng)下虎杖苷的前處理(使用稀乙醇作為溶劑進(jìn)行前處理)，同時結(jié)合膽清片的處方工藝(用70%乙醇回流提取)，選擇了稀乙醇和70%乙醇進(jìn)行樣品前處理考察。結(jié)果表明，用稀乙醇作為提取溶媒，效果最好，故確定以稀乙醇作為提取溶劑。本實(shí)驗(yàn)同時比較了超聲、回流兩種提取方法，結(jié)果表明回流提取方式比超聲提取方式含量較高，能將虎杖苷完全提取出來，故最終確定回流提取作為樣品前處理方法。

3.2 稱樣范圍的考察

本實(shí)驗(yàn)選擇了不同的稱樣量進(jìn)行回流提取，發(fā)現(xiàn)稱樣量在50%-150%范圍內(nèi)含量基本相同，鑒于稱樣量為0.1 g時供試品溶液的峰面積較合理，故確定稱樣量為0.1 g。

3.3 限量確定

對10批樣品測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，本品每片含虎杖以虎杖苷計(jì)，剔除測定結(jié)果最高值(5.67 mg)及最低值(1.94 mg)，平均值為2.99 mg。按其平均值的70%確定含量限度，建議膽清片每片含虎杖以虎杖苷計(jì)為不少于2.0 mg。

4 結(jié)論

本文建立了HPLC法測定膽清片中虎杖苷的含量，此方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、精密度高，陰性無干擾，可作為膽清片中虎杖苷含量測定的方法。該方法為膽清片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了可靠依據(jù)，可以更好地指導(dǎo)生產(chǎn)，保證藥品質(zhì)量。

[1] 中國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[S](2015版).中國醫(yī)藥出版社,2015;208.

[2] 張海歡,繆紅.HPLC法測定疏風(fēng)解毒膠囊中虎杖苷[J].中成藥,2013,35(10):2281.

[3] 富玉海，張立升.HPLC法測定清肝利膽膠囊中虎杖苷的含量[J].中國藥師,2007,10(2):147.

[4] 陳 剛.高效液相色譜法測定清肝利膽排石丸中虎杖苷含量[J].中國藥業(yè),2015,24(1):46.

[5] 張紅,饒俊珍,程璐.高效液相色譜法測定前列回春丸中虎杖苷的含量[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析,2015,15(8):1032.

[6] 郝立芳,袁曉芳.HPLC法測定金膽片中龍膽苦苷、虎杖苷含量[J].中國藥師,2011,3(9):1369.

Determination of polydatin in Danqing tablet by HPLC

/ YOU Yan, NIU Yan-fei ,ZHANG Xiao-nan, PU Bing-qing, HE Dong-yang, LIU Hui//(Yunnan Bai Yao Group Innovation and Ramp;D Center, Yunnan Institute of Materia Medica, Yunnan Province Company Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation, kunming 650111, Yunnan)

Objective:To establish a HPLC method for the determination of polydatin in Danqing tablet, and provide scientific basis for improving the quality standard of the drug.Method:Agilent ZORBAX SB C18column (4.6x250 mm, 5 μm) was used. Water-acetonitrile (80:20) was used as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL﹒min-1. The column temperature was 30℃.The detection wavelength was 306 nm and the injection volume was 10 μL.Result:The liner range of polydatin was in the range of 0.0047 μg～2.3500 μg (r=0.9998). The average recovery was 98.56% and the RSD was 3.43% (n=9).Conclusion:The method is simple, accurate with good reproducibility and stability, and can be used as a quality control method for the determination of polydatin in Danqing tablet.

Danqing tablet; polydatin; HPLC

282.6

A

1674-926X(2017)05-007-03

云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心, 云南省藥物研究所,云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650111，云南 昆明 650111

游燕，女，高級工程師，主要從事中藥分析 Email:yf_niu@126.com Tel:13577074553

2017-07-21

（責(zé)任編輯：李蕓霞）