熊偉+陳思如+修光輝+凌斌+孫潔+劉萍

摘要：目的構(gòu)建脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)膿毒癥（sepsis）大鼠早期腸損傷模型，給予不同濃度滇重樓（Rhizoma Paridis of yunnan）灌胃預(yù)處理，探討滇重樓對(duì)膿毒癥大鼠的腸道功能保護(hù)及小腸高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）表達(dá)的影響。方法清潔級(jí)成年SD大鼠雌性80只，隨機(jī)分為5組，16只/組，對(duì)照組、模型組、低劑量組（20mg/kg.po）、中等劑量組（40mg/kg.po）、高劑量組（80mg/kg.po）。給予滇重樓預(yù)處理后，構(gòu)建膿毒癥大鼠模型（LPS 1mg/kg.iv），于24h取材，檢測(cè)血中白細(xì)胞數(shù)（WBC）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、肌酐（Cre）、乳酸（Lac）的含量，行小腸病理檢查并組織學(xué)評(píng)分，采用ELISA法檢測(cè)血漿中二胺氧化酶（DAO）和D乳酸（D-Lac）的含量，分別采用WesternBlot和Q-PCR檢測(cè)小腸中HMGB1的蛋白及mRNA表達(dá)水平。結(jié)果模型組大鼠與對(duì)照組比較全血中ALT、CK-MB、Cre、Lac含量升高，WBC含量下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組與對(duì)照組比較大鼠存活率下降，病理組織學(xué)評(píng)分>Ⅲ級(jí)百分比升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；不同濃度滇重樓預(yù)處理均能改善膿毒癥大鼠的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、存活率及病理組織學(xué)評(píng)分，但治療組與模型組比較ALT及高劑量組Cre差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。模型組血漿中DAO和D-Lac含量高于對(duì)照組，而滇重樓治療組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組大鼠小腸HMGB1的蛋白及mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，而滇重樓治療組低于模型組（P<0.05）。結(jié)論滇重樓預(yù)處理可能通過(guò)抑制HMGB1表達(dá)參與抗炎反應(yīng)，從而改善小腸黏膜屏障通透性，發(fā)揮腸道保護(hù)功能，同時(shí)提高膿毒癥大鼠的生存率，優(yōu)化預(yù)后。

關(guān)鍵詞：膿毒癥；滇重樓；腸道功能保護(hù)；高遷移率族蛋白B1

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2017）11-0071-04膿毒癥（sepsis）是重癥醫(yī)學(xué)科危重患者常見(jiàn)死因之一，患病率約為人口3‰，病死率高達(dá)20.3%～29.9%[1]，是機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙[2]，也是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、感染、外科手術(shù)等常見(jiàn)并發(fā)癥。目前，膿毒癥的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，而腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素移位導(dǎo)致的腸黏膜屏障功能障礙是其主要機(jī)制之一，也是膿毒癥發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，可誘發(fā)失控性全身炎癥反應(yīng)綜合征（systematic inflammatory response syndrome，SIRS）致多器官功能障礙綜合征（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS），常表現(xiàn)為腸道功能紊亂發(fā)生最早及恢復(fù)最遲。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一種高度保守的非組DNA結(jié)合蛋白，可誘導(dǎo)RAGE、TLR2/4、NF-κB等炎癥因子釋放導(dǎo)致多器官靶細(xì)胞損傷，作為一種晚期炎癥因子在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3-5]。

據(jù)報(bào)道，滇重樓多種成分具有抗炎作用，臨床可用于器官保護(hù)、抗病原微生物、抗蛇蟲(chóng)毒及治療免疫系統(tǒng)和婦產(chǎn)科疾病[6]。筆者前期研究，利用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）15mg/kg腹腔注構(gòu)建大鼠腸黏膜功能障礙模型，滇重樓連續(xù)灌胃提示其腸黏膜抗炎保護(hù)作用。但結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，膿毒癥炎癥因子瀑布樣級(jí)聯(lián)釋放常使疾病迅速向MODS難逆轉(zhuǎn)性轉(zhuǎn)變，如何在SIRS早期通過(guò)抑制炎癥因子釋放成為干預(yù)疾病轉(zhuǎn)歸的重點(diǎn)。本課題擬通過(guò)LPS 1mg/kg股靜脈注射構(gòu)建膿毒癥大鼠早期腸損傷模型，探討滇重樓預(yù)處理對(duì)膿毒癥大鼠的腸道功能保護(hù)及小腸HMGB1表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1材料清潔級(jí)健康成年SD大鼠雌性80只，體重（200±10）g，由解放軍昆明總醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYXK（滇）2016-2017）。滇重樓由昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院藥劑科提供。脂多糖購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；血漿二胺氧化酶（DAO）和D乳酸（D-Lac）ELISA試劑盒購(gòu)于武漢華美公司；HMGB1一抗、二抗購(gòu)于abmart公司；Trizol Reagent 試劑盒購(gòu)于Lifetech公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)于Fermentas公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組實(shí)驗(yàn)采用成組設(shè)計(jì)，清潔級(jí)健康SD大鼠雌性80只，隨機(jī)分為5組，對(duì)照組、模型組、低劑量組、中等劑量組、高劑量組，每組16只。將滇重樓顆粒用生理鹽水制成混懸液灌胃預(yù)處理，劑量按照成人劑量的5倍、10倍、20倍，分別對(duì)應(yīng)低劑量組（20 mg/kg）、中等劑量組（40 mg/kg）、高劑量組（80 mg/kg），對(duì)照組及模型組給予相同劑量生理鹽水。除對(duì)照組經(jīng)股靜脈予以相同劑量生理鹽水外，其余組經(jīng)股靜脈予以LPS 1 mg/kg.iv。灌胃前禁食禁飲2 h，灌胃后正常飲食，密切觀察大鼠排便進(jìn)食、呼吸心跳、精神狀態(tài)等變化，于24 h取材分別進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)腹腔注射水合氯醛0.4 g/kg麻醉大鼠，迅速開(kāi)腹經(jīng)腹主動(dòng)脈采集動(dòng)脈血，分別檢測(cè)各組動(dòng)物白細(xì)胞數(shù)（WBC）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、肌酐（Cre）、乳酸（Lac）觀察模型成立及臟器功能變化情況。

1.2.3存活率及病理組織學(xué)評(píng)分觀察24 h內(nèi)膿毒癥大鼠存活率。分別取各組大鼠小腸用10%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、常規(guī)切片和蘇木素-伊紅染色后，封片鏡檢，并對(duì)小腸切片病理組織學(xué)評(píng)分[7]：0級(jí)，黏膜無(wú)明顯炎癥；I級(jí)，黏膜有明顯水腫，黏膜下及肌層內(nèi)輕度白細(xì)胞浸潤(rùn)；II級(jí)，黏膜明顯水腫，黏膜下及肌層內(nèi)白細(xì)胞浸潤(rùn)增多；III級(jí)，黏膜部分缺失，腺體部分不完整，白細(xì)胞聚集；IV級(jí)，黏膜廣泛破壞，腺體多數(shù)不完整，潰瘍形成，肉芽組織形成，組織結(jié)構(gòu)明顯破壞。endprint

1.2.4ELISA法檢測(cè)DAO和D-Lac水平分別取各組大鼠全血離心制成血漿，按每孔100ul分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本，37℃溫育，依次加生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液、底物溶液、終止溶液，終止反應(yīng)后5min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)依次測(cè)量各孔OD值，分別對(duì)照DAO和D-Lac標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5WesternBlot法檢測(cè)小腸HMGB1水平分別取小腸標(biāo)本制成檢測(cè)標(biāo)本，在樣品中等體積2×上樣緩沖液，按每孔100 ug蛋白上樣液。配10% SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)印，恒流轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂牛奶封閉，室溫，搖床上搖2 h，加β-actin一抗，1：1000，4℃，過(guò)夜；TBST漂洗，加入HRP標(biāo)記通用型二抗（goat來(lái)源），孵育1 h，TBST漂洗，成像。掃描條帶，并用Image J進(jìn)行分析。

1.2.6Q-PCR檢測(cè)小腸mRNA水平采用Trizol法分別提取小腸組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，Q-PCR儀擴(kuò)增（按說(shuō)明書(shū)操作）。大鼠HMGB1上游引物5-TTCTTCTTGTTCTGTTCTGAG-3，下游引物5-CTTCGCAACATCACCAAT-3，PCR產(chǎn)物大小219 bp；內(nèi)參照β-actin上游引物5-CGAGAAGATGACCCAGAT-3，下游引物5-GATAGCACAGCCTGGATA-3。軟件自行得出△Ct、△△Ct、2-△△Ct值，由溶解曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。全部數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P>0.05無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組的組間及組內(nèi)均采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。率的比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料χ2檢驗(yàn)，P<0.05提示兩個(gè)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05提示兩個(gè)率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果模型組大鼠與對(duì)照組比較全血中ALT、CK-MB、Cre、Lac含量升高，WBC含量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較全血中CK-MB、Lac含量下降，WBC含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但治療組與模型組比較ALT及高劑量組Cre差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2膿毒癥大鼠存活率及病理組織學(xué)評(píng)分結(jié)果模型組與對(duì)照組比較大鼠存活率下降，病理組織學(xué)評(píng)分>Ⅲ級(jí)百分比升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且模型組大鼠死亡率高達(dá)62.5%；滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較大鼠存活率升高，病理組織學(xué)評(píng)分>Ⅲ級(jí)百分比下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2，圖1。

2.3滇重樓對(duì)膿毒癥大鼠腸道功能保護(hù)作用模型組與對(duì)照組比較血漿中DAO和D-Lac含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較血漿中DAO和D-Lac含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3，圖2。

2.4滇重樓對(duì)膿毒癥大鼠小腸HMGB1的表達(dá)影響模型組與對(duì)照組比較小腸中HMGB1蛋白和mRNA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較小腸中HMGB1蛋白和mRNA含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中中等劑量組下降最明顯。見(jiàn)表4，圖3～4。

3討論

滇重樓為云南道地藥材，資源豐富，品質(zhì)優(yōu)良，具有極高的藥用價(jià)值，其起效方式表現(xiàn)在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用以及對(duì)炎癥細(xì)胞和因子、下丘腦-垂體-腎上腺軸、細(xì)胞凋亡、凝血/纖溶系統(tǒng)的影響[6]，呈現(xiàn)出多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的起效方式，對(duì)于致病機(jī)制復(fù)雜的膿毒癥可以起到多方位作用。周滿紅等[7]利用重樓總皂苷（RPTS）干預(yù)膿毒癥大鼠肺損傷可使血中早期炎癥因子TNF-α和IL-1顯著降低。黃彥峰等[8]報(bào)道證實(shí)重樓水提液可調(diào)節(jié)小腸運(yùn)動(dòng)從而治療腸道功能紊亂，其機(jī)理可能與M膽堿能受體、腎上腺素能系統(tǒng)有關(guān)。前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，滇重樓連續(xù)灌胃可明顯改善膿毒癥大鼠腹瀉、精神萎靡、運(yùn)動(dòng)遲緩等癥狀，但是，膿毒癥炎癥因子瀑布樣級(jí)聯(lián)釋放常使疾病迅速向MODS難逆轉(zhuǎn)性轉(zhuǎn)變，如何在SIRS早期通過(guò)抑制炎癥因子釋放成為干預(yù)疾病轉(zhuǎn)歸的重點(diǎn)。

Tropskaya NS和Zhang Y等[9-11]研究發(fā)現(xiàn)滇重樓等中藥可改善重癥患者APACHE-Ⅱ評(píng)分、腸鳴音評(píng)分和SIRS評(píng)分，緩解腹脹、血白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，減少與膿毒癥相關(guān)的胃腸功能障礙，其機(jī)制可能與營(yíng)養(yǎng)支持、抗炎反應(yīng)、調(diào)節(jié)腸蠕動(dòng)、抗膽堿能通路等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中，模型組與對(duì)照組相比大鼠血中ALT、CK-MB、Cre、Lac含量升高，WBC含量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示模型組大鼠全身多個(gè)系統(tǒng)（肝、心、腎、循環(huán)及免疫等）均表現(xiàn)出功能障礙，且死亡率>60%，符合膿毒癥模型指標(biāo)。但治療組ALT和Cre與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可能與滇重樓的肝腎毒性有關(guān)。經(jīng)滇重樓預(yù)處理的治療組與模型組比較，血漿中DAO和D-Lac降低，小腸病理組織學(xué)評(píng)分>Ⅲ級(jí)百分比下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明滇重樓可改善腸黏膜通透性，早期預(yù)防腸內(nèi)細(xì)菌移位及內(nèi)毒素入血，阻斷膿毒癥進(jìn)展，從而起到腸道保護(hù)作用。

HMGB1通過(guò)壞死細(xì)胞破壞被動(dòng)釋放或主動(dòng)活化炎癥細(xì)胞，而介導(dǎo)早期和晚期炎癥反應(yīng)及適應(yīng)性免疫應(yīng)答，其含量與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12-14]。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組小腸中HMGB1蛋白和mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，而滇重樓治療組低于模型組（P<0.05），其中中等劑量組下降最明顯，說(shuō)明滇重樓對(duì)晚期炎癥因子HMGB1的分泌有抑制作用。綜上所述，滇重樓預(yù)處理可能通過(guò)抑制HMGB1表達(dá)參與抗炎反應(yīng)，從而改善小腸黏膜屏障通透性，發(fā)揮腸道保護(hù)功能，同時(shí)提高膿毒癥大鼠的生存率，優(yōu)化預(yù)后。endprint