謝昌紀(jì) 蘇 賡 周志宇 陳杰飛 韋成聰

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院1 神經(jīng)外科，2 病理科，南寧市 530001)

·論 著·

LKB1和P57KIP2的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系▲

謝昌紀(jì)1蘇 賡2周志宇1陳杰飛1韋成聰1

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院1 神經(jīng)外科，2 病理科，南寧市 530001)

目的探討LKB1和P57KIP2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá),研究其與臨床病理特征及生物學(xué)行為的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)53例神經(jīng)膠質(zhì)瘤和20例正常腦組織中LKB1和P57KIP2基因蛋白的表達(dá)，結(jié)合病例隨訪資料分析其臨床意義。結(jié)果LKB1及P57KIP2蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)率與正常腦組織中的表達(dá)率相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05);LKB1、P57KIP2蛋白的陽性率與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的WHO分級(jí)和瘤周腦水腫具有相關(guān)性 (Plt;0.05),與性別和年齡不相關(guān)(Pgt;0.05);LKB1和P57KIP2蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)率復(fù)發(fā)組與無復(fù)發(fā)組有明顯差異(Plt;0.05);LKB1蛋白與P57KIP2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=-0.396,Plt;0.01)。結(jié)論LKB1、P57KIP2的表達(dá)與人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生及進(jìn)展相關(guān);LKB1、P57KIP2表達(dá)的降低為神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生的早期事件并且LKB1、P57KIP2低表達(dá)患者預(yù)后較差。聯(lián)合檢測(cè)LKB1、P57KIP2蛋白的表達(dá)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的早期診斷、判斷預(yù)后有參考價(jià)值。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤;LKB1；P57KIP2； 免疫組織化學(xué)

腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤是成人神經(jīng)腫瘤中最常見的致命性惡性腫瘤之一，在腦惡性腫瘤中占70%[1]。由于腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展的病理生理機(jī)制尚不明確，其替代治療的效果十分有限。因此，了解神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展過程中的分子機(jī)制對(duì)于準(zhǔn)確診斷、早期干預(yù)和有效治療有促進(jìn)作用，而治療后腫瘤的復(fù)發(fā)仍然是重大問題。周期素依賴激酶蛋白質(zhì)LKB1、P57KIP2的過度表達(dá)是許多腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，許多腫瘤均顯示出 LKB1、P57KIP2的過度表達(dá)。但是，腦膠質(zhì)瘤中是否存在LKB1、P57KIP2的過度表達(dá)仍然存在一些爭(zhēng)議。本研究旨在觀察人腦膠質(zhì)瘤組織中LKB1、P57KIP2的表達(dá)水平，并分析LKB1、P57KIP2與膠質(zhì)瘤惡性程度及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2002年12月至2010年12月共73塊存檔用蠟塊資料,其中神經(jīng)膠質(zhì)瘤(腫瘤組)53例，正常腦組織(正常組)20例;按照2000年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤組中低度惡性Ⅰ～Ⅱ級(jí)31例，高度惡性Ⅲ～Ⅳ級(jí)共22例；年齡12～66歲，中位年齡39歲，其中男性29例，女性24例；隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，3年內(nèi)復(fù)發(fā)33例，無復(fù)發(fā)20例。正常組為因良性病變需行正常腦組織切除者，其中男10例，女10例，中位年齡35歲。以上病理切片均由兩名病理高級(jí)職稱人員進(jìn)行專業(yè)診斷,并結(jié)合患者臨床癥狀,確保結(jié)果準(zhǔn)確率。患者間臨床基本資料差異行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，提示差異對(duì)本組研究無干擾性意義。

1.2 免疫組化 LKB1(批號(hào)：MAB-0529)和p57Kip2(批號(hào)：MAB-317)單克隆即用型抗體和S-PKits均購自福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品，標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，每例標(biāo)本分別進(jìn)行兩種處理:①常規(guī)切片HE染色(蘇木精-伊紅染色法；hematoxy lin-eosin staining，HE)復(fù)查診斷;②用于免疫組織化學(xué)(免疫組化)染色的標(biāo)本按如下方法處理：10%甲醛溶液固定,石蠟包埋;切片厚3～4 μm,貼在預(yù)先涂有多聚賴氨酸的干凈載玻片上,放入55～60℃恒溫箱24 h以上,至染色時(shí)取出,以防止脫片，按常規(guī)SP法染色。設(shè)立對(duì)照:以已知LKB1和P57KiP2陽性組織切片作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 LKB1和P57KIP2在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色著色為陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞的百分比為標(biāo)準(zhǔn)，陽性細(xì)胞0～10%為陰性(-)，陽性細(xì)胞數(shù)gt;10%為陽性(+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料用百分率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法分析兩種蛋白表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LKB1和P57KIP2的陽性表達(dá)率比較 神經(jīng)膠質(zhì)瘤中LKB1陽性表達(dá)率為54.79%(29/53)，見圖1；正常腦組織中LKB1陽性表達(dá)率為85.00%(17/20)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。膠質(zhì)瘤中P57KIP2陽性表達(dá)率為50.94%(27/53)，見圖2；正常腦組織中P57KIP2陽性表達(dá)率為80.00%(16/20)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。見表1。

表1 LKB1和P57KIP2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和正常腦組織中陽性的表達(dá)率比較

圖1 LKB1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(SP法×200倍)

圖2 P57KIP2在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(SP法×200倍)

2.2 LKB1和P57KIP2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中的臨床病理特征 53例神經(jīng)膠質(zhì)瘤中LKB1和P57KIP2的陽性表達(dá)率均與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病理分化程度及瘤周腦組織有無水腫相關(guān)，LKB1和P57KIP2蛋白陽性表達(dá)的患者術(shù)后無明顯水腫；LKB1和P57KIP2在病理Ⅳ～Ⅴ級(jí)組表達(dá)率明顯低于Ⅰ～Ⅱ級(jí)組(Plt;0.05)；LKB1和P57KIP2的陽性表達(dá)均與患者性別和年齡無相關(guān)性(Pgt;0.05)，見表2。

表2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征與LKB1和P57KIP2蛋白蛋白表達(dá)的關(guān)系

2.3 神經(jīng)膠質(zhì)瘤中LKB1和P57KIP2表達(dá)的相關(guān)性 應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析分析LKB1和P57KIP2蛋白表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)r=0.396，P=0.003，提示P57KIP2和LKB1表達(dá)呈正相關(guān)。

2.4 神經(jīng)膠質(zhì)瘤LKB1蛋白和P57KIP2表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)關(guān)系 隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，53例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者3年內(nèi)復(fù)發(fā)33例，無復(fù)發(fā)20例。其中復(fù)發(fā)組LKB1蛋白陽性表達(dá)率為42.42%，明顯低于無復(fù)發(fā)組的75.00%(Plt;0.05)；復(fù)發(fā)組P57KIP2蛋白陽性表達(dá)率為39.39%，明顯低于無復(fù)發(fā)組的70.00%(Plt;0.05)。見表3。

表3 神經(jīng)膠質(zhì)瘤有無復(fù)發(fā)中LKB1蛋白和P57KIP2蛋白陽性表達(dá)率比較

3 討 論

LKB1基因，也被稱為絲氨酸-蘇氨酸激酶11(STK11) ，人類LKB1基因已被定位于染色體19p13.3。該基因跨越23kb，由9個(gè)編碼外顯子和非編碼外顯子組成。LKB1編碼在端粒到著絲粒方向轉(zhuǎn)錄的2.4kb的mRNA 。LKB1蛋白在人體中含有433個(gè)氨基酸(aa)，在小鼠中含有436個(gè)氨基酸。其催化結(jié)構(gòu)域從aa49延伸至aa309，序列與任何已知的蛋白激酶無關(guān)。LKB1在所有胎兒和成年組織中廣泛表達(dá)，盡管有不 同的水平。LKB1形成具有兩個(gè)附件亞基的Ste20相關(guān)銜接蛋白(STRAD)和小鼠蛋白-25(MO25)異源三聚復(fù)合物，并作為組成型活性的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其為AMPK家族成員[2-4]。在許多腫瘤細(xì)胞系中LKB1表達(dá)通過誘導(dǎo)G1細(xì)胞周期停滯而抑制其生長，與腫瘤惡變相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)肝癌[5]、肺癌[6]等腫瘤中LKB1過度表達(dá)提示較差的預(yù)后。LKB1在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與腫瘤預(yù)后方面，目前國內(nèi)罕見有報(bào)道。本文數(shù)據(jù)表明，LKB1的下調(diào)與人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)，在較高等級(jí)下顯示較低的表達(dá)。這與Godlewski等[7-8]的研究結(jié)果類似。我們通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)，LKB1基因參與細(xì)胞周期調(diào)控，值得注意的是，LKB1可作為手術(shù)后膠質(zhì)瘤患者的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CKIs)是通過負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)來控制細(xì)胞周期進(jìn)程的酶家族。CKI放松管制就會(huì)導(dǎo)致不受控制的增殖和腫瘤發(fā)生。 Cip/Kip家族的最新成員p57Kip2(其功能尚未完全闡明)被認(rèn)為是重要的推定腫瘤抑制基因[9]，因?yàn)槠淠軌蛞种瓢┌Y的幾個(gè)標(biāo)志物。P57KIP2在抑制癌癥中的重要性在Beckwith-Wiedemann綜合征(癌癥預(yù)處理綜合征)中的突變/失活突出， P57KIP2在癌細(xì)胞中的表達(dá)由啟動(dòng)子DNA甲基化在CpG島和(或)組蛋白修飾，例如甲基化和脫乙酰化介導(dǎo)的。值得注意的是，腫瘤中p57KIP2表達(dá)的缺乏與存活率差相關(guān)，并且已被鑒定為許多上述癌癥類型的預(yù)后標(biāo)志物[10-11]。P57KIP2在G1-S期和G2-M期階段具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和CDKs的功能，控制DNA復(fù)制和參與腫瘤細(xì)胞增殖[12]，在各種腫瘤中P57KIP2基因突變的缺失表明轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后機(jī)制可能參與其下調(diào)的蛋白質(zhì)表達(dá)[13]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中P57kIP2陽性表達(dá)率明顯低于鄰近組織;分化越差的腫瘤組織，其P57KIP2表達(dá)越低，并與P57的表達(dá)降低之間沒有相關(guān)性瘤周腦組織水腫。結(jié)果表明，P57KIP2的表達(dá)減少與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性程度有關(guān)。膠質(zhì)瘤中P57KIP2表達(dá)下降，惡性程度和伴隨癥狀均升高，另外P57KIP2陽性表達(dá)率高的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者與陽性率低者相比，術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率較低， 說明P57KIP2在膠質(zhì)瘤的發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。此結(jié)果與Tsugu等[15]的研究結(jié)果類似。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中LKB1與P57KIP2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)呈正相關(guān)系 (r=0.396，Plt;0.01)。LKB1與P57KIP2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的共同作用機(jī)制，目前未見報(bào)道，推測(cè)可能是在受各種致瘤因素共同作用下，LKB1和P57KIP2的共同缺失導(dǎo)致其失去了腫瘤抑制基因的功能，基因的損傷得不到及時(shí)的修復(fù)，從而促進(jìn)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的進(jìn)展,共同促進(jìn)腫瘤生長與侵襲?？傊@些細(xì)胞周期蛋白通過各種腫瘤類型的不同機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。

總之，本研究表明LKB1和P57KIP2的表達(dá)在膠質(zhì)瘤中呈負(fù)相關(guān)。P57KIP2和LKB1均與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后相關(guān)，高LKB1和高P57KIP2指數(shù)可預(yù)測(cè)更差的預(yù)后。此外，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LKB1可以直接調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞體內(nèi)P57KIP2的降解。這些發(fā)現(xiàn)表明，LKB1在調(diào)節(jié)P57KIP2中起重要作用，也表明這些標(biāo)記物的組合在膠質(zhì)瘤的診斷和治療中具有預(yù)后價(jià)值。LKB1、P57KIP2的表達(dá)與人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生及進(jìn)展相關(guān);LKB1、P57KIP2表達(dá)的降低為神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生的早期事件，并且LKB1、P57KIP2呈低表達(dá)患者的預(yù)后較差，檢測(cè)LKB1、P57KIP2的表達(dá)對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的早期診斷、判斷預(yù)后及篩選高?；颊哂兄匾饬x。它們能否作為腫瘤相關(guān)抗原來引發(fā)機(jī)體特異性免疫反應(yīng)，從而成為腫瘤生物學(xué)靶向治療的靶點(diǎn)呢? 這還需要大規(guī)模的臨床觀察來進(jìn)一步證實(shí)。

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RelationshipofLKB1andP57KIP2expressionswithclinicopathologicalfeaturesandprognosisofneurospoagioma

XIEChangji1,SUGeng2，ZHOUZhiyu1,CHENJiefei1,WEIChengcong1

(1.DepartmentofNeurologicalSurgery, 2.Departmentofpathology，MinzuHospitalAffiliatedtoGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530001,China)

ObjectiveTo explore the expressions of LKB1 and P57KIP2 in neurospoagioma，and to investigate the relationship of their expressions with clinicopathological features and biological behavior.MethodsThe expressions of LKB1 and P57KIP2 proteins were detected in 53 cases of neurospoagioma tissues and 30 cases of normal brain tissues using S-P immunohistochemical method, and its clinical significance was analyzed on the basis of follow-up data.ResultsThere were significant differences in the expression rates of LKB1 and P57KIP2 proteins between neurospoagioma and normal brain tissues(Plt;0.05).The positive rates of LKB1 and P57KIP2 proteins correlated to WHO grade of neurospoagioma and peritumorous encephaledema(Plt;0.05), but did not correlate to age and gender(Pgt;0.05). There were significant differences in the LKB1 and P57KIP2 expression rates of neurospoagioma tissues between recurrence group and non-recurrence group(Plt;0.05). LKB1 protein expression positively correlated to P57KIP2 protein expression(r=-0.396,Plt;0.01).ConclusionThe expressions of LKB1 and P57KIP2 protein were related to the occurrence and development of human neurospoagioma. Decreased LKB1 and P57KIP2 expressions may be an early event for the incidence of neurospoagioma, and the patients with decreased LKB1 and P57KIP2 expressions have poor prognosis. Determination of LKB1 and P57KIP2 protein is valuable in the early diagnosis and prognosis assessment of neurospoagioma.

Neurospoagioma; LKB1; P57KIP2; Immunohistochemistry

廣西區(qū)衛(wèi)生計(jì)委科研課題(編號(hào)：Z2015111)

R 739.4

A

1673-6575(2016)05-04

10.11864/j.issn.1673.2017.05.02

2017-06-14

2017-08-07)