趙 斌，崔飛云，徐 溢,張曉鳳，李澤全

(1.重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400044；2.新型微納器件與系統(tǒng)技術(shù)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044；3.重慶大學(xué) 光電工程學(xué)院微系統(tǒng)研究中心，重慶 400044；4.微納系統(tǒng)及新材料技術(shù)國(guó)際研發(fā)中心，重慶 400044；5.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400050)

應(yīng)用糖基化碳量子點(diǎn)研究甘露糖與致病菌之間的相互作用

趙 斌1,2,4，崔飛云1,2,4，徐 溢2,3,4*,張曉鳳2,4,5，李澤全1*

(1.重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400044；2.新型微納器件與系統(tǒng)技術(shù)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044；3.重慶大學(xué) 光電工程學(xué)院微系統(tǒng)研究中心，重慶 400044；4.微納系統(tǒng)及新材料技術(shù)國(guó)際研發(fā)中心，重慶 400044；5.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400050)

以檸檬酸為碳源，通過(guò)水熱法制備得到熒光碳量子點(diǎn)(CQDs)，基于其表面的—COOH，將4-氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷以共價(jià)鍵的方式固定在CQDs表面，得到甘露糖基化碳量子點(diǎn)(Man-CQDs)，并通過(guò)熒光競(jìng)爭(zhēng)法，結(jié)合Scatchard方程計(jì)算了Man-CQDs與大腸桿菌JM109、大腸桿菌DH5a和沙門(mén)氏菌S.123443的結(jié)合常數(shù)Ka。實(shí)驗(yàn)得到CQDs的粒徑為26 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為445 nm，熒光產(chǎn)率相較于54%硫酸奎寧為76%，Man-CQDs熒光強(qiáng)度與CQDs相比基本保持不變，通過(guò)苯酚-硫酸法計(jì)算得到Man-CQDs濃度為2.832 mmol/L，Man-CQDs納米顆粒中甘露糖含量約為40%。根據(jù)Man-CQDs、D-Mannose與致病菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn),結(jié)合 Scatchard模型方程，計(jì)算得到Man-CQDs與大腸桿菌JM109的結(jié)合常數(shù)Ka=2.39×103L/mol,Man-CQDs與沙門(mén)氏菌S.123443的結(jié)合常數(shù)Ka=1.17×105L/mol,Man-CQDs與大腸桿菌DH5a無(wú)有效結(jié)合。研究結(jié)果顯示，該方法可用于甘露糖與致病菌非共價(jià)結(jié)合的結(jié)合常數(shù)測(cè)定，為研究糖與致病菌相互作用提供了參考。

甘露糖基化碳量子點(diǎn)(Man-CQDs)；大腸桿菌JM109；大腸桿菌DH5a；沙門(mén)氏菌S.123443；結(jié)合常數(shù)；相互作用；熒光光譜

致病菌對(duì)宿主細(xì)胞的粘附主要通過(guò)致病菌菌毛/鞭毛末端的凝集素與宿主細(xì)胞表面聚糖發(fā)生選擇性識(shí)別結(jié)合完成，從而導(dǎo)致炎癥和痢疾等疾病[1]。在細(xì)胞水平上定量研究致病菌與糖的相互作用，以及在分子水平上研究凝集素與糖的相互作用，均能為致病菌粘附機(jī)制的研究、致病菌的特異性檢測(cè)提供新的策略。

目前，凝集素/細(xì)菌與糖相互作用的定量研究主要采用等溫滴定量熱法[2]、親和毛細(xì)管電泳法[3]、石英晶體微天平[4]、表面等離子體共振法[5]和熒光光譜法[6]等。熒光光譜法具有檢測(cè)靈敏度高、選擇性好、所需樣品量少以及方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是目前采用較多的測(cè)試手段。如Wang等[7]基于熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究了Man-Au與FITC-ConA的相互作用，F(xiàn)ITC-ConA與Man-Au、D-Mannose競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合平衡后，根據(jù)Cheng-Prusoff方程計(jì)算得到Man-Au與ConA的解離常數(shù)在nmol級(jí)別。Okada等[8]在已修飾熒光染料的膠原蛋白肽的末端接枝甘露糖制備得到MPOG10復(fù)合物，采用熒光偏振結(jié)合非線性最小二乘法計(jì)算得到MPOG10與ConA的解離常數(shù)為1.9×10-5mol/L。然而，這些研究?jī)H在分子水平上以凝集素替代致病菌菌毛/鞭毛末端的識(shí)別分子，難以真實(shí)地反映出致病菌與糖的相互作用，在細(xì)胞水平上對(duì)致病菌-糖相互作用的研究尚少。

本文以檸檬酸為碳源，采用水熱法制備得到熒光產(chǎn)率高、水溶性和生物相容性好的CQDs-COOH，利用羧基和氨基的酰胺化反應(yīng)將修飾有氨基的甘露糖固定在CQDs表面，制備得到甘露糖基化碳量子點(diǎn)(Man-CQDs)。將Man-CQDs作為甘露糖與致病菌相互作用的熒光探針，以大腸桿菌K12變異型菌種JM109、大腸桿菌DH5a和沙門(mén)氏菌S.123443為研究對(duì)象，通過(guò)加入系列濃度的Man-CQDs，與固定濃度的D-Mannose競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合致病菌的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合平衡后離心將Man-CQDs/致病菌復(fù)合物與殘余游離的Man-CQDs和D-Mannose分離，測(cè)試上清液的熒光光譜，結(jié)合Scatchard模型，計(jì)算得到Man-CQDs與大腸桿菌JM109/沙門(mén)氏菌S.123443 2種致病菌的結(jié)合常數(shù)。以期為糖與致病菌的相互作用的定量研究起到指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301熒光光譜儀、UV-2450紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)和IRprestige-21傅立葉紅外光譜儀(日本島津公司)；JEM-1230透射電子顯微鏡(日本電子光學(xué)研究所)。LB培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自上海生工；檸檬酸、D-Mannose、4-氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷(A-D-mannopyanoside)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、奎寧均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二胺、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)等購(gòu)自成都科龍化工試劑廠;所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水；實(shí)驗(yàn)在常溫常壓下進(jìn)行。

磷酸鹽緩沖溶液(PBS)：精確稱(chēng)取 0.24 g KH2PO4、1.44 g Na2HPO4、8 g NaCl、0.2 g KCl 溶于去離子水中，用0.1 mol/L的NaOH調(diào)至pH 7.4。

大腸桿菌JM109/大腸桿菌DH5a/沙門(mén)氏菌S.123443標(biāo)本：菌種均由第三軍醫(yī)大學(xué)檢驗(yàn)系提供，在LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12～14 h；將原菌液以8 000 r/min離心3 min，去除上清液后重懸于PBS緩沖液中，重復(fù)離心2～3次，最后懸浮在PBS緩沖液中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Man-CQDs的制備參考Zhu等[9]的水熱法制備高熒光產(chǎn)率CQDs。將0.42 g檸檬酸和536 μL乙二胺溶解于10 mL去離子水中，轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應(yīng)釜(30 mL)中，在200 ℃烘箱中反應(yīng)5 h。自然冷卻至室溫后，避光透析(透析袋MW：3 500 Da)去除粒徑小的納米顆粒，得到粒徑均勻的CQDs，并置于4 ℃儲(chǔ)存。

圖1 Man-CQDs制備原理圖Fig.1 Scheme of the coupling process of Man-CQDs

利用CQDs表面的—COOH，將氨基化的甘露糖通過(guò)酰胺鍵的方式固定在CQDs表面，制備得到Man-CQDs(如圖1)。取1 mL稀釋濃度[10]為1 mg/mL的CQDs，加入EDC(1 mL，60 mmol/L)和NHS(1 mL，30 mmol/L)于37 ℃活化30 min，隨后加入4-氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷(1 mL，1 mg/mL)，振搖120 min，加入Tris-HCl緩沖溶液封閉未反應(yīng)的活性羧基，4 ℃條件下反應(yīng)過(guò)夜，最后透析(透析袋MW：3 500 Da)去除多余的4-氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷，制備得到Man-CQDs。

1.2.2Man-CQDs與致病菌的結(jié)合實(shí)驗(yàn)將108cfu/mL的大腸桿菌JM109、沙門(mén)氏菌S.123443和大腸桿菌DH5a分別懸浮在pH 7.4的 PBS緩沖溶液中，加入1 mL 1 mmol/LD-Mannose溶液，隨后各自加入系列濃度(0.023 4～0.291 6 mmol/L)的Man-CQDs,用PBS緩沖溶液定容至3 mL,37 ℃孵育60 min，結(jié)合平衡后8 000 r/min離心3 min，獲得上清液測(cè)定其熒光光譜，記錄激發(fā)波長(zhǎng)350 nm時(shí)發(fā)射波長(zhǎng)在445 nm處的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 CQDs及Man-CQDs表征結(jié)果

基于CQDs的熒光量子產(chǎn)率高、無(wú)毒、制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，研究者將生物分子如蛋白[11]、適配體[10]和抗生素[12]等修飾固定在CQDs表面，用于致病菌的相關(guān)研究。而將糖分子固定在CQDs表面制備糖基化碳量子點(diǎn)，用于致病菌選擇性識(shí)別的研究尚少。Huang等[13-14]將檸檬酸與甘露糖混溶后在高溫下碳化制備得到Man-CQDs，其熒光量子產(chǎn)率僅為9.8%；隨后通過(guò)包裹方式，在高溫下將甘露糖包裹在制備好的CQDs表面，熒光量子產(chǎn)率有小幅提高。但上述方法制備的Man-CQDs存在以下問(wèn)題：高溫下甘露糖極易被碳化，結(jié)構(gòu)被破壞；熒光量子產(chǎn)率不高，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度低。實(shí)驗(yàn)采用水熱法制備得到的CQDs熒光量子產(chǎn)率較高，其表面還結(jié)合有豐富的活性官能團(tuán)，如—OH、—COOH和—NH2等，可與甘露糖的衍生物共價(jià)結(jié)合，制備得到Man-CQDs，這個(gè)過(guò)程不會(huì)破壞甘露糖結(jié)構(gòu)，同時(shí)還可以改善CQDs的生物相容性。圖2A顯示實(shí)驗(yàn)制備得到粒徑范圍為2～6 nm，分布均勻，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象，水溶性好的CQDs，其紫外光譜測(cè)試結(jié)果顯示260 nm和350 nm處分別是碳核峰和表面分子的吸收峰[9]；CQDs的熒光光譜測(cè)試結(jié)果顯示，激發(fā)波長(zhǎng)(λex)為350 nm時(shí)，CQDs的最大發(fā)射波長(zhǎng)(λem)為445 nm(圖2B)。根據(jù)熒光量子產(chǎn)率計(jì)算公式(式1)計(jì)算其熒光量子產(chǎn)率相較于54%硫酸奎寧約為76%；CQDs的FTIR測(cè)試結(jié)果(圖2C)顯示，3 401 cm-1附近為羥基伸縮振動(dòng)峰，2 926 cm-1附近為氨基伸縮振動(dòng)峰，1 656 cm-1附近為羧基伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明CQDs表面有—COOH、—OH和—NH2等功能基團(tuán)，其中—COOH基團(tuán)可與修飾有氨基的甘露糖進(jìn)一步共價(jià)結(jié)合制備獲得Man-CQDs。

(1)

式中，YCQDs和YQS分別為CQDs與硫酸奎寧的熒光量子產(chǎn)率,FCQDs和FQS分別為CQDs與硫酸奎寧的積分熒光強(qiáng)度,ACQDs和AQS分別為CQDs與硫酸奎寧的吸光度值,nCQDs和nQS表示溶劑的折射率,對(duì)于CQDs溶液和硫酸奎寧溶液，兩者的折射率均為1.33。

圖2 CQDs的透射電鏡圖(A)、紫外和熒光光譜圖(B)以及紅外光譜圖(C)Fig.2 TEM image(A)，UV-Vis spectra and fluorescence spectra(B) and FTIR spectra(C)of CQDs

CQDs表面的—COOH官能團(tuán)經(jīng)EDC/NHS活化后，通過(guò)酰胺鍵將4-氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷共價(jià)結(jié)合在CQDs表面。Man-CQDs的熒光光譜(圖3A)顯示最大發(fā)射波長(zhǎng)仍為445 nm，熒光強(qiáng)度有較小的減弱；Man-CQDs的FTIR測(cè)試結(jié)果(圖3B)顯示，3 401～3 110 cm-1附近的羥基伸縮振動(dòng)峰、2 964 cm-1和1 649 cm-1附近的氨基和羧基伸縮振動(dòng)峰依然存在，1 649～1 406 cm-1附近的峰有明顯變化，顯示出苯環(huán)結(jié)構(gòu)引入，推測(cè)甘露糖已被鏈接在CQDs表面；Man-CQDs的紫外光譜(圖3C)顯示除了230 nm和290 nm有CQDs的吸收峰，在288 nm處還有A-D-mannopyanoside的吸收峰，可進(jìn)一步證實(shí)制備得到了Man-CQDs納米顆粒。

2.2 Man-CQDs制備條件優(yōu)化

CQDs的表面有多個(gè)可與氨基化甘露糖鍵合的活性羧基，CQDs與A-D-mannopyanoside的不同配比也會(huì)影響鍵合效果。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了4組不同的配比(2∶1、1∶1、1∶5、1∶10)，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)制備得到的Man-CQDs進(jìn)行熒光光譜測(cè)試。結(jié)果顯示，當(dāng)CQDs與A-D-mannopyanoside的配比為1∶1時(shí)，Man-CQDs的熒光值最大，故選擇此條件為制備Man-CQDs的最優(yōu)條件。

2.3Man-CQDs溶液中A-D-mannopyanoside含量的測(cè)定

Man-CQDs與致病菌的相互作用通過(guò)Man-CQDs表面接枝的甘露糖進(jìn)行，因此，Man-CQDs表面接枝的甘露糖量對(duì)Man-CQDs與致病菌的識(shí)別和結(jié)合效果有很大影響。實(shí)驗(yàn)通過(guò)用苯酚-硫酸[15]溶液處理系列濃度(0.01～ 4.5 mmol/L)的D-Mannose，測(cè)定其在490 nm處的吸光度，得到D-Mannose濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為IOA=0.148C-0.051 2,r2=0.961 7。Man-CQDs用相同的方法處理，測(cè)得其吸光度為0.368，代入線性方程，即可計(jì)算得到Man-CQDs溶液中接枝A-D-mannopyanoside的濃度為2.832 mmol/L,換算后即為0.768 mg/mL，且Man-CQDs的終濃度為1.919 mg/mL。經(jīng)計(jì)算，Man-CQDs納米顆粒中的甘露糖含量約為40%。

2.4 Man-CQDs與致病菌結(jié)合時(shí)間的優(yōu)化

Man-CQDs與致病菌的結(jié)合過(guò)程中，孵育時(shí)間是影響結(jié)合效率的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌JM109為樣本，考察了Man-CQDs與致病菌的不同孵育時(shí)間(15、30、45、60、90 min)。大腸桿菌JM109與250 μL 1 mg/mL Man-CQDs溶液孵育后，離心去除多余的Man-CQDs，將大腸桿菌JM109用PBS緩沖液重懸，測(cè)試標(biāo)記后致病菌的熒光信號(hào)。結(jié)果顯示，在60 min內(nèi)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的增加而增強(qiáng)，60 min后熒光強(qiáng)度基本保持不變。因此，選擇結(jié)合時(shí)間為60 min。

圖3 Man-CQDs的熒光光譜(A)、紅外光譜(B)與紫外光譜圖(C)Fig.3 Fluorescence spectra(A)，F(xiàn)TIR spectra(B)and UV-Vis spectra(C) of Man-CQDs

圖4 D-Mannose、Man-CQDs和細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合原理圖Fig.4 Scheme of fluorescence-based competition binding assay between D-Mannose，Man-CQDs and bacteria

2.5 Man-CQDs與3種致病菌的相互作用

Man-CQDs與致病菌的相互作用采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合方式(圖4)，首先加入D-Mannose與致病菌結(jié)合，再加入Man-CQDs競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合D-Mannose與致病菌已結(jié)合的位點(diǎn)，使D-Mannose脫離位點(diǎn)，Man-CQDs占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)。熒光光譜(圖5A)測(cè)試結(jié)果顯示，與直接結(jié)合相比，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合后的上清液熒光強(qiáng)度下降更多，說(shuō)明Man-CQDs與致病菌結(jié)合更好。相較于D-Mannose單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，Man-CQDs表面有多個(gè)甘露糖位點(diǎn)，能夠有效地使D-Mannose與致病菌表面脫離，自身占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)，能夠真實(shí)地反映Man-CQDs與致病菌結(jié)合的過(guò)程[16]，避免和盡量減少非特異性結(jié)合。待Man-CQDs、D-Mannose與致病菌結(jié)合平衡后，通過(guò)離心將Man-CQDs/致病菌復(fù)合物與游離的Man-CQDs和D-Mannose分離，沉淀用PBS重懸，測(cè)試其熒光光譜并分析(CQDs作為對(duì)照組)。測(cè)試結(jié)果顯示，CQDs與致病菌不結(jié)合；Man-CQDs選擇性識(shí)別大腸桿菌JM109和沙門(mén)氏菌S.123443，不與大腸桿菌DH5a結(jié)合，且Man-CQDs與沙門(mén)氏菌S.123443的結(jié)合能力強(qiáng)于大腸桿菌JM109(圖5B,C,D)。結(jié)果表明，Man-CQDs能夠選擇性識(shí)別大腸桿菌JM109和沙門(mén)氏菌S.123443，而不是非特異性吸附。

2.6Man-CQDs與致病菌結(jié)合常數(shù)的計(jì)算

致病菌與糖非共價(jià)結(jié)合的機(jī)理研究，對(duì)致病菌的定量檢測(cè)和抑制粘附細(xì)胞均有重要意義，結(jié)合常數(shù)不僅是判定致病菌與糖作用強(qiáng)弱的參數(shù)，還是兩者結(jié)合方式和結(jié)合效果研究的基礎(chǔ)[17]。表達(dá)Ⅰ型菌毛的細(xì)菌如沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和肺炎鏈球菌等能與甘露糖及其衍生物識(shí)別結(jié)合，其結(jié)合主要是與細(xì)菌菌毛/鞭毛末端的凝集素(蛋白)進(jìn)行糖-蛋白識(shí)別[18-19]。Cecioni等[20]提出致病菌的每個(gè)菌毛/鞭毛末端只有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)合方式為1∶1結(jié)合，因此可采用Scatchard方程計(jì)算得到甘露糖與致病菌的結(jié)合常數(shù)，以此評(píng)價(jià)兩者的親和作用強(qiáng)弱。假設(shè)致病菌菌毛/鞭毛有m個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域有n個(gè)同等強(qiáng)度的結(jié)合位點(diǎn)，且相互獨(dú)立，可以結(jié)合n個(gè)Man-CQDs，則有Scatchard[21]方程：

μ/Cf=Ka(n-μ)；μ=(Ct-Cf)/Cm

(2)

式中n、Ct、Cf、Ka、μ分別是結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、加入Man-CQDs濃度、游離Man-CQDs濃度、結(jié)合常數(shù)和致病菌每個(gè)區(qū)域上結(jié)合Man-CQDs數(shù)量。Cf根據(jù)Man-CQDs濃度與其熒光強(qiáng)度的線性方程(IF=3 564C+41.09,r2=0.999 4)計(jì)算得到；根據(jù)細(xì)菌結(jié)合的Man-CQDs濃度與細(xì)菌濃度的比值，可計(jì)算得μ，由于致病菌為非均相溶液，濃度無(wú)法以摩爾濃度表示，通常以與致病菌結(jié)合最大的Man-CQDs濃度Cm替代?；谏鲜龇匠?，以μ/Cf對(duì)μ線性回歸后可求出結(jié)合常數(shù)Ka。

圖5 D-Mannose、Man-CQDs和細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合后上清液的熒光光譜圖(A)以及細(xì)菌與Man-CQDs結(jié)合后的熒光光譜(B～D)Fig.5 Fluorescence spectra of the supernatant based on competition binding assay between D-Mannose，Man-CQDs (A)and bacteria，and fluorescence spectra of bacteria labeled Man-CQDs(B-D)B：E.coli JM109；C：typhimurium S.123443;D：E.coli DH5a

表1 Man-CQDs與細(xì)菌的結(jié)合常數(shù)Table 1 Binding constant of Man-CQDs and bacteria

3種致病菌與系列濃度(0.023 4～0.291 6 mmol/L)的Man-CQDs溶液結(jié)合后，其上清液的熒光光譜測(cè)試結(jié)果顯示，隨著Man-CQDs濃度的增加，上清液的熒光強(qiáng)度減弱，說(shuō)明與致病菌結(jié)合的Man-CQDs也隨之增加。當(dāng)Cf=1.06×10-4mol/L時(shí)，μ由迅速增加到逐漸平穩(wěn)，說(shuō)明Man-CQDs與致病菌結(jié)合達(dá)到最大，對(duì)應(yīng)結(jié)合最大的濃度為1.94×10-4mol/L。然而大腸桿菌DH5a與Man-CQDs結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，隨著Man-CQDs濃度增加，上清液的熒光強(qiáng)度也隨之增加，并超出測(cè)試范圍，說(shuō)明其未與Man-CQDs結(jié)合，與文獻(xiàn)[22]中甘露糖與大腸桿菌DH5a不結(jié)合是一致的。根據(jù)μ/Cf對(duì)μ線性回歸計(jì)算得到沙門(mén)氏菌與Man-CQDs的Ka=1.17×105L/mol，大腸桿菌JM109與Man-CQDs的Ka=2.39×103L/mol(表1)，與文獻(xiàn)[17]中報(bào)道的糖與致病菌的結(jié)合常數(shù)同一數(shù)量級(jí)，Man-CQDs與這兩種致病菌有較強(qiáng)的親和作用，前者的Ka明顯比后者強(qiáng)，可能是兩者非共價(jià)結(jié)合的作用方式不同[17]所致。

3 結(jié) 論

本文以水熱法制備得到了水溶性好、熒光量子產(chǎn)率高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的Man-CQDs，結(jié)合Scatchard線性分析，計(jì)算得到沙門(mén)氏菌、大腸桿菌JM109與Man-CQDs的結(jié)合常數(shù)。據(jù)此建立了一種新型的定量研究甘露糖與細(xì)菌選擇性識(shí)別結(jié)合的方法，該方法具有簡(jiǎn)單、直接、靈敏度高及無(wú)毒的優(yōu)點(diǎn)，為表達(dá)Ⅰ型菌毛的細(xì)菌與宿主細(xì)胞表面糖類(lèi)分子選擇性識(shí)別結(jié)合的機(jī)理研究提供了理論基礎(chǔ)。同時(shí)，也擴(kuò)展了CQDs在細(xì)菌領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，為后續(xù)細(xì)菌粘附宿主細(xì)胞機(jī)理的研究以及新型糖類(lèi)抗菌藥的研發(fā)等提供了新的技術(shù)途徑。

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Study on Interaction between Mannose and Bacteria Using Glycosylated Carbon Quantum Dots

ZHAO Bin1,2,4,CUI Fei-yun1,2,4,XU Yi2,3,4*,ZHANG Xiao-feng2,4,5,LI Ze-quan1*

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China；2.Key Disciplines Laboratory of Novel Micro-nano Devices and System Technology，Chongqing 400044，China；3.Microsystem Research Center，School of Optoelectronic Engineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China；4.International R&D Center of Micro-nano Systems and New Materials Technology，Chongqing 400044，China；5.School of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400050，China)

In this paper,citric acid was used as carbon source for preparing fluorescent carbon quantum dots(CQDs).Due to the obtained CQDs had carboxyl groups on their surfaces,Man-CQDs were synthesized by immobilizing 4-aminopheny-l-α-D-mannopyanoside on the surfaces of CQDs via covalent bond.Furthermore,the binding constants of Man-CQDs and Escherichia coliJM109/EscherichiaDH5a/SalmonellatyphimuriumS.123443 were obtained by fluorescent competition experiments.The results showed that the sizes of CQDs were approximately 26 nm,the maximum excitation wavelength for CQDs was 445 nm and the fluorescence yield was 76%in contrast to 54%quinine sulfate.Compared with the fluorescence intensity of CQDs,the prepared Man-CQDs remained unchanged in principle.By the Phenol-sulfate method,the concentration of Man-CQDs was calculated to be 2.832 mmol/L,and the content of mannose in Man-CQDs nanoparticles was approximately 40%.Based on competition binding experiments of Man-CQDs andD-mannose with bacteria,the binding constant of Man-CQDs and bacteria was calculated by Scatchard equation,namely the binding constants of Man-CQDs withEscherichiacoliJM109 andSalmonellatyphimuriumS.123443 were 2.39×103L/mol and 1.17×105L/mol,respectively.However,the reaction of Man-CQDs andEscherichiacoliDH5awas nonspecific binding.The results suggested that the proposed method was applicable for the determination of noncovalent binding constant between mannose and bacteria.Besides,it offered a valuable reference information for the research of interaction between carbohydrate and bacteria.

Man-CQDs；EscherichiacoliJM109；EscherichiacoliDH5a；SalmonellatyphimuriumS.123443；binding constant；interaction；fluorescence spectrum

2017-05-31;

2017-07-15

重慶市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)社會(huì)民生科技創(chuàng)新一般項(xiàng)目(cstc2015shms zx00014)；重慶市科學(xué)技術(shù)委員科技惠民計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2015jcsf8001)

*

徐 溢，博士，教授，研究方向：分析化學(xué)、應(yīng)用化學(xué)和微型集成生化分析系統(tǒng)，E-mail：18883724394@163.com 李澤全，博士，副教授，研究方向：熔鹽電化學(xué)、材料制備及性能、環(huán)境等，E-mail：lzq@cqu.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.11.005

O433.4

A

1004-4957(2017)11-1318-07