馮曉珂 董巖 李治冶 吳煒 趙銥民
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨和富血小板血漿的體內(nèi)成骨實(shí)驗(yàn)
馮曉珂 董巖 李治冶 吳煒 趙銥民
目的研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)和富血小板血漿(PRP)復(fù)合物中加入脫細(xì)胞軟骨碎塊(DCM)后的成骨能力。方法全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)兔BMSCs;采集兔新鮮動脈血制備PRP;剪取新鮮兔耳碎化后用化學(xué)法脫細(xì)胞制備DCM,將BMSCs與PRP和DCM混合后注射到裸鼠皮下,8 周后取材觀察成骨情況。結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)顯示本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的BMSCs有較強(qiáng)的成骨、成脂分化能力,軟骨碎塊脫細(xì)胞效果理想,8 周裸鼠體內(nèi)結(jié)果取材蘇木精-伊紅染色(HE)和改良Massons染色顯示類骨質(zhì)和骨質(zhì)較多,甲苯胺藍(lán)(TB)染色顯示剩余軟骨成分較少。結(jié)論BMSCs-PRP-DCM復(fù)合物誘導(dǎo)軟骨內(nèi)成骨。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs); 富血小板血漿(PRP); 脫細(xì)胞軟骨碎塊(DCM); 軟骨內(nèi)成骨
現(xiàn)有組織工程骨的支架材料主要是人工合成的骨替代品如羥基磷灰石等,而這類支架材料在體內(nèi)移植手術(shù)中都要開放的手術(shù),無法微創(chuàng)。此外這些支架材料本身無活性,很難完全融合于自體骨。由于支架材料的存在,限制了細(xì)胞的移動和相互間作用,不能快速的血管化和骨化,阻礙了骨或軟骨再生[1]。Ma等[2]利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在裸鼠體內(nèi)成功構(gòu)建了可注射的組織工程骨。但是,注射物中僅含有干細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)等,而不含有效的生長因子。富含自體細(xì)胞因子和生長因子的富血小板血漿(platelet rich plasma, PRP),作為一種新型的生物材料已經(jīng)被應(yīng)用于臨床中[3]。PRP可以促進(jìn)骨形成,尤其是加快移植骨愈合速度,其制備方法簡單,便于微創(chuàng)操作。脫細(xì)胞軟骨碎塊(decellularized cartilage matrix, DCM)脫細(xì)胞去除了免疫原性,剩余基質(zhì)可以提供一個三維空間,同時模擬軟骨內(nèi)成骨時的軟骨導(dǎo)板,并逐漸被骨組織替代[4],同時碎化了的DCM也可以被注射。本實(shí)驗(yàn)通過BMSCs-PRP-DCM復(fù)合物注射到裸鼠體內(nèi)后,觀察其異位成骨情況,來探討注射成骨方法的可行性和PRP 能不能提高BMSCs的成骨能力。
1.1 材料與設(shè)備
DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、抗壞血酸、核酸酶(Sigma,美國); 枸椽酸鈉(分析純, 汕頭光華化學(xué)廠);雙抗(Amresco,美國);1%十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS),1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),乙醚,4%多聚甲醛國定液,Thermo Forma CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱( Thermo,Scientifi,美國);體視顯微鏡(Nikon, 日本);顯微鏡電腦分析系統(tǒng)(Nikon CX J30, 日本),酶標(biāo)儀(Beckman,美國)。
1.2 BMSCs細(xì)胞的獲取及誘導(dǎo)分化
BMSCs的獲?。? 月齡新西蘭白兔,陸眠寧麻藥注射處死,取股骨及脛骨髁部,全骨髓法培養(yǎng)BMSCs。取第2代BMSCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),倒置顯微鏡下拍照。
成骨誘導(dǎo):取第3代BMSCs,當(dāng)細(xì)胞生長融合約90%后,培養(yǎng)液換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(15%FBS,1%雙抗,50 μg/ml 左旋抗壞血酸,10-7mol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。3 周后茜素紅染色,光鏡觀察,拍照。
成脂誘導(dǎo):取第3代BMSCs,當(dāng)細(xì)胞生長融合約90%后,成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液[15%FBS,1%雙抗,0.5 mmol/L 異丁基甲基黃嘌呤(IBMX),10 μmol/L 胰島素(0.01 mg/ml),1 μmol/L 地塞米松,200 μmol/L 吲哚美辛]誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d;成脂誘導(dǎo)維持液(15%FBS,1%雙抗,0.01 mg/ml 胰島素)維持培養(yǎng)2 d。油紅O染色,鏡下觀察,拍照。
1.3 PRP的制備
3 月齡新西蘭白兔,陸眠寧麻醉后,取兔耳緣靜脈血,按照9∶1的體積比加入3.8%的枸櫞酸鈉抗凝液。兩步離心法制備PRP: 2 300 r/min,8 min離心,分3 層,取上2 層3 300 r/min,8 min離心。
1.4 DCM的制備及檢測
3 月齡新西蘭大白兔,耳緣靜脈注射空氣處死,剪取雙耳,取耳軟骨于液氮中浸泡5 min,組織研磨儀粉碎,收集碎化的兔耳軟骨,加入1%SDS液脫細(xì)胞24 h,1%Triton X-100繼續(xù)破膜4 h,加入核酸酶處理30 min,大量PBS沖洗,凍干24 h后環(huán)氧乙烷滅菌待用。
1.4.1 體視顯微鏡觀察 體視顯微鏡下觀察脫細(xì)胞后的軟骨碎塊尺寸。
1.4.2 組織學(xué)染色觀察 DCM用4%多聚甲醛固定24 h后,石蠟包埋切片,分別進(jìn)行HE和TB染色。
1.4.3 DCM細(xì)胞毒性檢測 DCM制備的浸提液與實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞同來源的BMSCs共培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組,同前的常規(guī)培養(yǎng)液與實(shí)驗(yàn)組同來源的BMSCs共培養(yǎng)作為對照組來檢測脫細(xì)胞軟骨的毒性。
1.5 體內(nèi)成骨實(shí)驗(yàn)
1.5.1 復(fù)合物的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)組:2.25×107個BMSCs,500 μl PRP,500 μl脫細(xì)胞軟骨碎塊混合成復(fù)合物,加入50 μl凝血酶(100 U/ml ,富含100 mg/ml氯化鈣),搖勻, 40 s后,復(fù)合體凝結(jié)成凝膠樣。
對照組:500 μl PRP,500 μl脫細(xì)胞軟骨碎塊混合成復(fù)合物,加入50 μl凝血酶(100 U/ml ,富含100 mg/ml氯化鈣),搖勻, 40 s后,復(fù)合體凝結(jié)成凝膠樣。
1.5.2 裸鼠皮下實(shí)驗(yàn) 6 周齡雄性裸鼠,隨機(jī)分2 組。乙醚麻醉后,用2 ml注射器加16 G針頭分別注射至裸鼠背部皮下,無菌環(huán)境中喂養(yǎng)8 周,處死,取材。樣本在4%多聚甲醛中固定48 h,EDTA脫鈣2 周,用石蠟進(jìn)行包埋,切片,HE、改良Massons和TB染色。
1.6 統(tǒng)計學(xué)分析
所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采student-t檢驗(yàn)。Plt;0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察
原代的BMSCs呈集落樣生長,細(xì)胞呈長梭形。成骨誘導(dǎo)染色后,可見鈣化結(jié)節(jié)形成,成脂誘導(dǎo)染色后,可見脂滴形成(圖 1)。
2.2 DCM形態(tài)觀察及細(xì)胞毒性檢測
體視顯微鏡下的軟骨碎塊經(jīng)過脫細(xì)胞的處理后呈透亮狀,直徑約200 μm。HE染色顯示細(xì)胞基本被除去,剩余組織呈多孔狀TB染色顯示,脫細(xì)胞后,軟骨仍然保留了絕大部分的基質(zhì)成分。細(xì)胞毒性檢測顯示脫細(xì)胞軟骨浸提液和正常培養(yǎng)液對細(xì)胞增殖影響無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)(圖 2)。
2.3 體內(nèi)成骨實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)組8 周HE染色可見致密的間質(zhì)以及高度礦化的組織,可見較多類骨質(zhì),形成較多血管,并有明顯的血管長入脫細(xì)胞軟骨中(圖 3A)。改良Massons染色中則更加明顯的顯示了成骨膠原的增多,同時原有的軟骨膠原在逐漸減少(圖 3B)。TB染色中則顯示淡紫色的肥大化細(xì)胞增多(圖 3C)。
對照組8 周的HE染色則顯示了明顯較少的間質(zhì)和血管,原脫細(xì)胞軟骨碎塊并未在間質(zhì)的包饒連接下緊密連接,礦化組織和類骨質(zhì)更少(圖 3D),同時改良Massons染色顯示對照組的脫細(xì)胞軟骨碎塊的基質(zhì)中仍剩余較多的軟骨膠原成分(圖 3E)。TB染色中仍然可以看到較多的藍(lán)染的軟骨成分(圖 3F)。
圖 1 BMSCs 形態(tài)及鑒定(A: ×20, B~C: ×10)
Fig 1 Characterization of BMSCs(A: ×20, B-C: ×10)
圖 2 脫細(xì)胞軟骨碎塊的形態(tài)及毒性檢測(A~C: ×20)
Fig 2 Characterization and cytotoxicity of decellularized cartilage fragments(A-C: ×20)
圖 3 細(xì)胞-PRP-脫細(xì)胞軟骨碎塊復(fù)合物及對照組組織學(xué)染色
現(xiàn)有研究多采用羥基磷灰石,磷酸三鈣,聚醚醚酮等人工合成生物材料復(fù)合BMSCs實(shí)現(xiàn)骨再生[5]。人工合成生物材料因?yàn)槠渖锒栊远y以降解進(jìn)而不能很好的和移植宿主自體骨相融合。
因此發(fā)展一種碎化的,免疫排斥反應(yīng)小的又可以實(shí)現(xiàn)微創(chuàng)的骨替代材料被寄予厚望。脫細(xì)胞軟骨首先進(jìn)入人們視野是被用于成軟骨的組織工程中,因脫細(xì)胞而沒有了免疫原性使其應(yīng)用范圍擴(kuò)大。Debby等[6]利用脫細(xì)胞軟骨復(fù)合BMSCs成功構(gòu)建了組織工程骨,其中脫細(xì)胞軟骨充當(dāng)了軟骨導(dǎo)板的作用,模擬了胚胎時期成骨方式之一——軟骨內(nèi)成骨[7]。而碎化的脫細(xì)胞軟骨相當(dāng)于很多個微小的軟骨導(dǎo)板,不僅提供了三維立體的附著空間,更有利于血管的長入。PRP是利用自身的血液提取出富含高濃度血小板和各種自身生長因子的血漿,較易獲取且沒有免疫原性,在凝血酶的作用下可成為凝膠狀物質(zhì)[8],從而使整個BMSCs-PRP-DCM復(fù)合物成為可注射性的凝膠狀,保證了注射后復(fù)合物可以維持一定的形態(tài)。DCM同時復(fù)合BMSCs和PRP,延長了BMSCs壽命,促進(jìn)了復(fù)合物成骨和成血管[9]。
本實(shí)驗(yàn)中動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,在有了DCM的支撐下,BMSCs更好的存活下來并經(jīng)歷肥大化和礦化最終向成骨分化。DCM保留了原有軟骨基質(zhì)中的成分,這使得DCM不僅具有了多孔狀的三維立體結(jié)構(gòu),更賦予了其一定的機(jī)械強(qiáng)度來支撐整個復(fù)合體。血管不僅出現(xiàn)在間質(zhì),更長入了DCM中間,這也是軟骨肥大化的直接證據(jù)[10],說明PRP的參與促進(jìn)了復(fù)合物的血管化。植入的DCM經(jīng)歷8 周的體內(nèi)轉(zhuǎn)化,由軟骨向骨轉(zhuǎn)化逐漸被替代,骨性膠原明顯多于軟骨性膠原[11],同時塊與塊之間相互融合,形成一個整體。BMSCs-PRP-DCM復(fù)合物實(shí)現(xiàn)了很好的血管化和骨化[12]。而對照組因缺乏BMSCs出現(xiàn)了嚴(yán)重的吸收,并且沒有明顯的成骨證據(jù),這也證明了BMSCs在成骨過程中的重要作用。
為進(jìn)一步驗(yàn)證BMSCs-PRP-DCM復(fù)合物的成骨能力,我們計劃在未來實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行極限骨缺損修復(fù)的體內(nèi)研究、成骨機(jī)制的探討、骨細(xì)胞來源探討等。
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(收稿: 2016-10-19 修回: 2016-11-17)
Boneregenerationwithbonemarrowmesenchymalstemcells,plateletrichplasmaanddecellularizedcartilagematricescomplex
FENGXiaoke,DONGYan,LIZhiye,WUWei,ZHAOYimin.
710032Xi'an,StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatologyamp;NationalClinicalResearchCenterforOralDiseasesamp;ShaanxiKeyLaboratoryofOralDiseases,DepartmentofProsthodontics,SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,China
Objective: To study the bone regeneration capacity of the complex of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) and platelet rich plasma(PRP) with decellularized cartilage matrix(DCM).MethodsBMSCs were isolated from young rabbit and cultured; PRP were prepared from the fresh blood of rabbit and the DCM were come from the fresh ears of rabbits and processed into a mixture of BMSCs-PRP-DCM. The mixture was injected subcutaneously into nude mice, 8 weeks after injection bone regeneration was examine by HE staining and Massons staining decellularization.ResultsThe BMSCs show good differentiation capacityinvitroand the cartilage fragments were well decellularized. Excellent endochondral ossification ability of the complex was observed byinvivoexperiment.ConclusionThe BMSCs-PRP-DCM complex has good capacity of endochondral ossification.
Bonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs);Plateletrichplasma(PRP);Decellularizedcartilagematrix(DCM);Endochondralossification
國家自然科學(xué)基金(編號: 81271104); 陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃(編號: 2016JM8086)
710032 西安,軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心,陜西省口腔疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科
趙銥民 029-84779195 E-mail: zhaoym@fmmu.edu.cn
R318.1
A
10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.002