豐帆 辛海濤 吳玉祿 刁曉鷗 竇晨云

不同粗化處理對超細晶純鈦表面性能的影響

豐帆 辛海濤 吳玉祿 刁曉鷗 竇晨云

目的研究不同粗化處理對超細晶純鈦表面性能及成骨細胞黏附和增殖的影響。方法將超細晶純鈦棒切割為直徑7 mm、厚度2 mm的試件，按不同噴砂壓力(0.2～0.8 MPa)分組，對其表面進行噴砂酸蝕處理，對照組為普通純鈦。通過表面形貌、粗糙度、親水性研究材料的表面性能，然后將大鼠胚胎成骨細胞(MC3T3-E1)接種到各組鈦片表面，觀察細胞初期黏附形態(tài)，測定其增殖密度。結(jié)果超細晶純鈦粗化處理后，表面呈現(xiàn)出由噴砂和酸蝕所形成的大小不同的彈坑狀雙層結(jié)構(gòu)。隨著噴砂壓力增大，超細晶純鈦表面坑孔直徑和粗糙度逐漸增大，但二者均小于普通純鈦對照組(Plt;0.05)。超細晶純鈦親水性也隨噴砂壓力變化而改變，當噴砂壓力為0.6 MPa時表現(xiàn)出最佳表面親水性能。接種細胞后，實驗組細胞初期黏附形態(tài)優(yōu)于對照組，當噴砂壓力為0.6 MPa時細胞增殖密度最大。結(jié)論對超細晶純鈦噴砂酸蝕處理，噴砂壓力為0.6 MPa時，材料表面形貌優(yōu)于普通純鈦，粗糙度適宜，親水性良好，更有利于細胞黏附和增殖。

噴砂酸蝕； 超細晶純鈦； 細胞黏附； MC3T3-E1

目前臨床使用的種植體多采用純鈦材料因其具有優(yōu)異的生物相容性。但純鈦機械強度較低，臨床使用中會出現(xiàn)種植體折斷和破壞，影響種植義齒的成功率和使用壽命。有研究報道采用等通道擠壓技術(shù)使純鈦發(fā)生劇烈塑性變形，使其晶粒得到細化從而達到提高純鈦材料機械性能的目的[1-2]。本課題組前期實驗證明純鈦經(jīng)等通道擠壓后其晶粒由微米級細化至納米級，硬度和屈服強度明顯提高，生物安全性和生物相容性試驗也表明，超細晶純鈦具有良好的安全性，能促進細胞黏附和增殖，適合作為口腔種植材料[3-4]。

為了增大種植體與牙槽骨的接觸面積，促進骨結(jié)合，臨床中所使用的種植體均要進行表面處理[5]。盡管種植體表面粗化處理的方法較多[6-8]，但噴砂酸蝕法是目前臨床常用的種植體表面處理方法，該方法所形成的坑與微孔結(jié)構(gòu)大大提高了材料的表面粗糙度[9]，增加了種植體骨結(jié)合[10]。雖然普通純鈦表面噴砂酸蝕處理的研究報道很多，但有關(guān)超細晶純鈦表面噴砂酸蝕的研究報道還較少，噴砂酸蝕條件的不同對超細晶純鈦表面性能及生物相容性的影響還未見報道。為了將超細晶純鈦材料應(yīng)用于口腔種植領(lǐng)域，還需要對其表面進行噴砂酸蝕處理，研究該粗化處理方法處理超細晶純鈦的可行性，并篩選出最適宜的噴砂酸蝕處理參數(shù)。

本實驗將探究在不同噴砂壓力下，超細晶純鈦表面形貌、粗糙度、親水性的改變以及對其表面黏附細胞的形態(tài)、數(shù)量的影響，并分析在相同噴砂條件下與普通純鈦的差異，為其在口腔種植領(lǐng)域的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和設(shè)備

商業(yè)純鈦(CP Ti)(99.5%，2 級)、超細晶純鈦(UFG Ti)(西北工業(yè)大學制備)，噴砂機(Renfert公司，德國)，金相研磨拋光機(MTI；Unipol-830)，掃描電子顯微鏡(S-4800， Hitachi 公司，日本)，三維形貌掃描儀(NANOVEA,美國)，激光共聚焦顯微鏡(FV10i，Olympus 公司，日本)； DZF-6050 電熱真空干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)， EASY DROP K100 型接觸角測試儀(KRUSS 公司，德國)，CO2孵箱(Heraeus 公司，德國)。

1.2 試件的制備

將2 種材料制成直徑7 mm、厚度2 mm的圓盤狀試件,每種材料的試件隨機分為4 組，每組10 片。試件用600～2000 目的SiC砂紙逐級拋光。拋光后的試件用110 μm的Al2O3顆粒在距離試件1 cm處對其表面垂直噴砂30 s，UFG Ti-SLA 0.2組和CP Ti-SLA 0.2組的噴砂氣壓為0.2 MPa，UFG Ti-SLA 0.4組和CP Ti-SLA 0.4組的噴砂氣壓為0.4 MPa，UFG Ti-SLA 0.6組和CP Ti-SLA 0.6組的噴砂氣壓為0.6 MPa，UFG Ti-SLA 0.8組和CP Ti-SLA 0.8組的噴砂氣壓為0.8 MPa。噴砂后用混合酸(37%鹽酸、98%硫酸和去離子水以2∶1∶1比例配置)在80 ℃的條件下對試件進行酸蝕，酸蝕時間5 min。依次用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲波震蕩清洗3 次，每次5 min。在40 ℃條件下用烘干機干燥。高溫高壓消毒備用。

1.3 表面性能檢測

對8 組處理過的鈦片進行檢測：①表面形貌觀察：采用掃描電鏡(SEM)觀察材料的表面微觀形貌；②表面粗糙度測量：采用三維形貌掃描儀對試件表面進行掃描后測量每組鈦片的表面粗糙度；③水接觸角測量：用接觸角測量儀測量每組鈦片的水接觸角。

1.4 細胞黏附實驗

將鈦片置于48 孔板內(nèi)，每孔1 片，每組2 片，共16 片。取生長良好的細胞以105cell/ml的密度接種至試件表面，每孔0.5 ml培養(yǎng)液，細胞接種后的24 h每組分別取出2 枚鈦片,PBS漂洗鈦片表面細胞2 次，每次8～10 min，2.5%戊二醛固定，4 ℃過夜，吸出固定劑，用PBS浸洗2 次，每次8～10 min，酒精梯度脫水，干燥，噴金，掃描電鏡觀察細胞黏附形態(tài)。

1.5 細胞增殖實驗

將鈦片置于48 孔板內(nèi)，每孔1 片，每組3 片，共24 片。取生長良好的細胞以105cell/ml的密度接種至試件表面，每孔0.5 ml培養(yǎng)液，細胞接種后1、3、5 d每組各取出1 枚鈦片，PBS漂洗鈦片表面細胞2 次，每次8～10 min，4 ℃條件下2.5%戊二醛固定30 min，吸出固定劑，用PBS浸洗2 次，每次8～10 min，加入0.1% Triton-100處理5 min以增加細胞膜通透性，DAPI染液避光染色10 min，激光共聚焦顯微鏡觀察，每個鈦片隨機選取5 個視野進行細胞計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。若數(shù)據(jù)正態(tài)分布且方差齊性，則每種材料各樣本均數(shù)間的比較采用LSD-L檢驗,相同處理條件下2 種材料間樣本均數(shù)的比較采用t檢驗；若數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布或方差不齊，則采用Kruskal-WillsH檢驗進行組間比較；檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 材料表面性能

2.1.1 掃描電鏡觀察 UFG Ti-SLA組表面噴砂坑大小約為3～5 μm，且隨著噴砂壓力增大噴砂坑逐漸清晰，在噴砂形成的大孔周圍可見酸蝕形成的小孔，雙層結(jié)構(gòu)明顯。CP Ti-SLA組表面噴砂坑大小約為8～10 μm，噴砂坑清晰，但酸蝕形成的小孔不如超細晶純鈦清晰，雙層結(jié)構(gòu)不明顯(圖 1)。

2.1.2 三維形貌 圖 2顯示各組材料表面均形成高低起伏的規(guī)則表面，當噴砂壓力為0.2 MPa時,超細晶純鈦與普通純鈦表面起伏數(shù)量相當,隨噴砂壓力增大試件表面形成的起伏逐漸增多，當噴砂壓力為0.4、0.6、0.8 MPa時普通純鈦表面起伏多于超細晶純鈦。

2.1.3 表面粗糙度 隨著噴砂壓力增大兩組材料的表面粗糙度均逐漸增大,超細晶純鈦組除0.4 MPa噴砂壓力下粗糙度與相鄰2 組間差異無統(tǒng)計學意義，其余組之間粗糙度均有差異(Plt;0.05),普通純鈦組各組之間差異均有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05),相同噴砂壓力條件下普通純鈦的表面粗糙度大于超細晶純鈦(Plt;0.05)(表 1)。

圖 1 超細晶鈦片與普通鈦片表面微觀形態(tài)(SEM，×5 000)

Fig 1 The surface micromorphology of UFG Ti and CP Ti(SEM，×5 000)

圖 2 超細晶鈦片與普通鈦片表面三維形貌

Tab 1 Surface roughness parameters of 2 groups (μm，n=6，±s)

2.1.4 親水性能 各組材料表面水接觸角測量值見表 2。超細晶純鈦與普通純鈦接觸角隨噴砂壓力增大呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢, 超細晶純鈦在噴砂壓力為0.6 MPa時、普通純鈦在噴砂壓力為0.4 MPa時接觸角最小,親水性最好,與各組間差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。

2.2 材料表面細胞活性

2.2.1 細胞初期黏附形態(tài) 各組材料表面細胞初期黏附形態(tài)見圖 3。由圖可見，細胞在噴砂坑內(nèi)生長,均伸出偽足與噴砂坑邊緣突起部分相連,呈峰峰搭橋型。超細晶純鈦表面黏附的成骨細胞在24 h時已經(jīng)完全伸張, 呈平鋪樣，細胞多邊形；普通純鈦表面成骨細胞伸展不如超細晶純鈦徹底，仍可看到細胞邊緣絲狀偽足或帶狀偽足離心生長。

2.2.2 細胞增殖密度 各組材料表面黏附細胞的細胞核染色結(jié)果見圖 4、表 3。由圖 4可知，不同噴砂壓力作用下，超細晶純鈦表面細胞黏附數(shù)量均多于普通純鈦；由表 3可知，噴砂壓力為0.6 MPa時，超細晶純鈦表面細胞增殖密度最大,與其他組差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)；噴砂壓力為0.4 MPa時，普通純鈦表面細胞增殖密度最大，與其他組之間差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。

Tab 2 The water contact angle on the surface of 2 groups (°，n=6，±s)

圖 3 材料表面MC3T3-E1細胞黏附形態(tài)(SEM， ×2 000)

Fig 3 The adhension of MC3T3-E1 cells on the surface of UFG Ti and CP Ti(SEM， ×2 000)

圖 4 材料表面MC3T3-E1細胞DAPI染色(激光共聚焦顯微鏡， ×200)

Fig 4 DAPI staining of MC3T3-E1 cells on UFG Ti and CP Ti(Laser confocal microscope, ×200)

表 3 超細晶純鈦和普通純鈦表面的細胞密度實驗

3 討 論

純鈦經(jīng)等通道擠壓后晶粒得到細化，機械強度明顯提高[11-12]。課題組前期研究也證實超細晶純鈦在彈性模量未改變的前提下，其強度和硬度明顯優(yōu)于純鈦[3]，生物安全性和生物相容性實驗也表明超細晶純鈦可以作為牙科種植體材料[4,13]。為了將超細晶純鈦應(yīng)用于臨床種植修復(fù)，還要對其表面進行處理以提高種植體骨結(jié)合。盡管種植體表面處理方法很多，如噴砂酸蝕、微弧氧化、磷灰石表面涂層等[14-15]，但噴砂酸蝕依然是臨床常用的種植體表面處理方法。為了探明噴砂酸蝕對超細晶純鈦表面性能的影響，本實驗將研究在不同噴砂壓力下，超細晶純鈦表面形貌、粗糙度、親水性的改變，觀察其表面成骨細胞黏附形態(tài)和數(shù)量，優(yōu)化出最佳噴砂酸蝕處理條件，為其在口腔種植領(lǐng)域的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

3.1 噴砂壓力對超細晶純鈦表面形貌和粗糙度的影響

種植體材料的表面微觀形貌、粗糙度和親水性與細胞行為之間的關(guān)系一直是學者們研究的熱門問題[16-17]，成骨細胞對與種植體材料的反應(yīng)依賴于這些表面特征，表面性能好的種植體材料可以在其周圍形成良好的生物學環(huán)境，以利于細胞在其表面黏附、增殖和分化[18]。細胞黏附是細胞與種植體接觸的第一步，種植體表面的粗糙度和親水性會對成骨細胞黏附形態(tài)與數(shù)量產(chǎn)生影響，進而影響其進一步的分化和增殖[19]。而種植體表面粗糙度又與材料的機械性能以及噴砂處理條件密切相關(guān)[20]。本研究的三維形貌結(jié)果顯示超細晶純鈦與普通純鈦表面起伏數(shù)量隨噴砂壓力增大而增多，從而使其粗糙度也逐漸增大，但超細晶純鈦表面起伏數(shù)量及粗糙度小于相同噴砂壓力處理后的普通純鈦。微觀形貌研究顯示，超細晶純鈦與普通純鈦表面均形成雙層孔洞結(jié)構(gòu)，該雙層結(jié)構(gòu)由噴砂所形成的大坑以及酸蝕所形成的小孔組成。隨著噴砂壓力增大，2 組材料表面噴砂坑逐漸增大，但超細晶純鈦的噴砂坑明顯小于普通純鈦。這是由于超細晶純鈦的機械強度高于普通純鈦，也是形成二者粗糙度差異的主要原因。酸蝕處理后超細晶純鈦表面所形成的雙層孔洞結(jié)構(gòu)明顯，且分布均勻，表面微觀形貌特征優(yōu)于普通純鈦，其主要原因可能是超細晶純鈦晶粒比普通純鈦小，晶界相對較多，由于晶界易被酸蝕，故超細晶純鈦更容易形成酸蝕孔，從而影響其雙層結(jié)構(gòu)。但是，酸蝕條件的改變可能會對超細晶純鈦的結(jié)構(gòu)及晶界產(chǎn)生較大影響，進而改變其表面性能，因此，本實驗未改變酸蝕條件，只采用普通純鈦常用酸蝕方法對超細晶純鈦進行處理，后期還將研究酸蝕條件的改變對超細晶純鈦表面性能的影響，為超細晶純鈦的噴砂酸蝕處理提供實驗依據(jù)。

3.2 超細晶純鈦表面親水性的影響因素

種植體表面的親水性也是影響成骨細胞黏附的關(guān)鍵因素[21]。材料的親水性不但取決于材料的組成與結(jié)構(gòu)，也與材料表面微觀形貌和粗糙度相關(guān)[22]。本研究也發(fā)現(xiàn)，超細晶純鈦表面親水性能優(yōu)于普通純鈦，原因可能是由于超細晶純鈦晶界較多，酸蝕后晶界暴露，水分子易通過毛細現(xiàn)象進入酸蝕后的晶界內(nèi)，從而改善超細晶純鈦的親水性。有研究表明，粗糙度的變化會影響材料親水性能的改變，但并不是粗糙度越大，材料的親水性越好[21]。在本研究中，隨噴砂壓力增大，超細晶純鈦表面粗糙度逐漸增大，但其親水性并沒有相應(yīng)地提高，而是在噴砂壓力為0.6 MPa時親水性能最好，只有當材料表面粗糙度與親水性達到良好匹配時，才可能更有利于細胞黏附。

3.3 超細晶純鈦表面性能對細胞黏附和增殖的影響

適宜的粗糙度和良好的親水性能促進細胞黏附與增殖。材料表面越粗糙，表面積越大，表面活性點多，越有利于細胞黏附[20]。但Wennerberg等[23]研究發(fā)現(xiàn)，適宜粗糙度的材料表面比光滑或過度粗糙的表面更有利于種植體與骨組織發(fā)生反應(yīng)。親水性能良好的表面更易吸附大分子蛋白，從而與細胞受體結(jié)合，促進細胞黏附[22]。本實驗也發(fā)現(xiàn)，當噴砂壓力為0.6 MPa時，超細晶純鈦表面粗糙度并不是最大，但其親水性能良好，細胞黏附數(shù)量最多，并且優(yōu)于普通純鈦。研究結(jié)果表明，超細晶純鈦表面進行噴砂酸蝕處理時，噴砂壓力應(yīng)大于普通純鈦，才能使其表面具有適宜的粗糙度和良好的親水性，以適應(yīng)成骨細胞黏附與增殖。

綜上所述， 超細晶純鈦材料具有良好的機械性能，作為種植體材料進行表面粗化處理時，當噴砂壓力為0.6 MPa，材料表面具有良好的形貌特征和適宜的粗糙度與親水性，有利于細胞黏附和增殖，可以作為噴砂酸蝕表面處理的參考依據(jù)。

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(收稿： 2016-10-30 修回： 2017-02-20)

Thesurfacecharacterizationofultrafinegrainedtitaniumafterroughnesstreatmentofdifferenttypes

FENGFan,XINHaitao,WUYulu,DIAOXiaoou,DOUChenyun.

710032Xi'an，StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatologyamp;NationalClinicalResearchCenterforOralDiseasesamp;ShaanxiKeyLaboratoryofStomatology,DepartmentofProsthodontics，SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity，China

Objective: To investigate the surface characterization ，cell adhension and proliferation of ultrafine grained titanium(UFG Ti) after different sand blasting and acid-etching(SLA).MethodsThe billets of UFG Ti and commercially pure titanium Ti(CP Ti) were incised into cylindrical specimens with 7 mm in diameter and 2 mm in height. The specimens were sand blasted at the air pressure of 0.2,0.4,0.6 and 0.8 MPa respectively(n=10) and then acid-etched. The surface morphology, roughness and surface wettability of the specimens were examined. Rat embryo osteoblasts MC3T3-E1 were cultured on the speciments for 1 d,3 d and 5 d respectively, the cell morphology and cell density were observed.ResultsThe different hierarchical porous topographies were formed on the surface of UFG and CP Ti after modified by SLA. The sizes of blasted holes on the surface and the surface roughness of both materials increased with the increase of blast pressure, but the values of UFG Ti were lower than those of CP Ti correspondingly(Plt;0.05). The surface wettability of them was also changed with the blast pressure, but the values of UFG Ti was significantly smaller than those of CP Ti(Plt;0.05). When the blast pressure was 0.6 Mpa, the UFG Ti exhibited excellent wettability, the cell density was the highest, the morphology of MC3T3-E1 cells on UFG Ti was superior to that on CP Ti.ConclusionUFG Ti exhibits proper surface morphology, roughness and excellent wettability, which is more appropriate for adhension and proliferation of MC3T3-E1 cells after modification by SLA at blast pressure of 0.6 Mpa.

Sandblastandacidetching;Ultrafinegraintitanium;Celladhension;MC3T3-E1

國家自然科學基金面上項目( 編號: 11672327) ; 陜西省社會發(fā)展科技攻關(guān)項目( 編號: 2016SF-155)

710032 西安，軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，口腔疾病國家臨床醫(yī)學研究中心，陜西省口腔醫(yī)學重點實驗室，第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院修復(fù)科

辛海濤029-84776464 E-mail: xhthmj@ fmmu．edu．cn

R783.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.006