馬瑞 沈鵬 劉一帆 高勃 吳江

新型鈦種植體涂層構(gòu)建及體外生物安全性評價

馬瑞 沈鵬 劉一帆 高勃 吳江

目的構(gòu)建一種新型鈦種植體涂層，檢測其表面形貌及體外生物安全性。方法采用明膠作為交聯(lián)劑，以本課題組前期制備的包裹SDF-1和rhBMP-2的雙層載藥納米微球為基礎(chǔ)，通過振蕩滲涂交聯(lián)法將微球交聯(lián)至微弧氧化涂層的微孔中，在鈦種植體表面構(gòu)建出新型功能性涂層，觀察其表面形貌。通過細(xì)胞毒性試驗、口腔黏膜刺激試驗及溶血試驗對新型鈦種植體涂層體外生物安全性進(jìn)行初步檢測。結(jié)果掃描電鏡結(jié)果顯示新型功能性涂層形貌良好。細(xì)胞毒性試驗結(jié)果顯示該涂層100%浸提液細(xì)胞毒性為1 級，溶血率為4.6%，口腔黏膜刺激試驗結(jié)果顯示該涂層對黏膜無刺激作用。結(jié)論通過振蕩滲涂交聯(lián)法構(gòu)建的新型鈦種植體表面涂層具有良好的表面形貌及生物安全性。

鈦種植體; 載藥微球; 涂層; 生物安全性

種植體相關(guān)感染仍是導(dǎo)致種植失敗的重要原因之一[1]。感染導(dǎo)致的骨吸收，種植體松動甚至脫落都是臨床的難題。如何尋求有效的方法抑制骨缺損區(qū)域的骨吸收，促進(jìn)骨再生是當(dāng)下研究的熱點[2]。

基于緩釋微球技術(shù)的種植體表面涂層的構(gòu)建為其治療注入了新理念,Wu等[3]在微弧氧化的純鈦表面構(gòu)建了載鹵代呋喃酮/聚乳酸緩釋微球的新型抗菌涂層具有持久的抗菌性能和良好的成骨細(xì)胞相容性；Liu等[4-6]將羥基磷酸鈣等涂層作為成骨藥物BMP-2的載藥系統(tǒng)，體外實驗證實涂層具有成骨誘導(dǎo)性且有較長時效性。

本課題組前期成功制備了包裹SDF-1和rhBMP-2的雙層載藥微球，形態(tài)良好，體外釋藥較好[7]。本實驗以新型殼聚糖雙層緩釋納米微球為基礎(chǔ)，采用振蕩滲涂交聯(lián)法在微弧氧化鈦種植體表面構(gòu)建出具有良好表面形貌的新型功能性涂層，并對其體外生物安全性進(jìn)行初步評估。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及設(shè)備

冷凍干燥的包載BMP-2/SDF-1的雙層載藥納米微球[(自制，粒徑為542.33±14.38 nm)]；β-甘油磷酸二鈉鹽五水(β-GP)、乙酸鈣[CA(上海源葉生物科技有限公司)]；純鈦板(TA2，寶鈦集團(tuán)有限公司)；明膠(A型，Sigma-Aldrich公司)；戊二醛(天津協(xié)和試劑公司)；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑(包括DMEM培養(yǎng)基、雙抗、胰蛋白酶、PBS緩沖液等，Hyclone)；CCK-8試劑盒(日本同仁)；旋渦振蕩器(Vortex-5，北京恒奧德儀器儀表有限公司)；超聲波清洗器(TI-H160，Elma，德國)；微量電子天平(BS-110S，德國)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡(S-4800，日立，日本)；超聲細(xì)胞粉碎儀(JY92-IIN，寧波新芝生物科技有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(Thermo,美國)；流式細(xì)胞儀(FC-500，美國)。

1.2 新型鈦種植體涂層的構(gòu)建

1.2.1 試件制備 TA2商業(yè)純鈦板通過線切割制備成直徑14.5 mm、厚度2 mm及直徑5 mm、厚度1 mm的圓片，經(jīng)碳化硅砂紙逐級打磨至1200 目，依次經(jīng)丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗各10 min。以純鈦圓片為陽極，不銹鋼為陰極，含有β-GP和CA的水溶液為電解液，電壓300 V,占空比8%，頻率600 Hz，采用脈沖直流電源微弧氧化處理5 min后立即用去離子水沖洗，吹干。

1.2.2 涂層構(gòu)建 精確稱取60 mg冷凍干燥的雙層納米載藥微球置于1 ml、0.1%的明膠溶液，超聲細(xì)胞粉碎儀乳化處理1 h；微量移液器吸取0.15 ml上述懸濁液滴至微弧氧化的試件表面，漩渦震蕩儀上震蕩1 h后4 ℃干燥，其后浸泡于2.5%的戊二醛溶液30 min，無水乙醇、去離子水清洗試件，4 ℃干燥。

1.3 材料浸提液制備

按照0.2 g/ml的材料質(zhì)量與浸提介質(zhì)比例，將涂層試件、微弧氧化試件完全浸泡于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2恒溫箱孵育72 h。分別收集、過濾除菌。

1.4 細(xì)胞毒性試驗[8]

全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)至第3代采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞鑒定。鑒定結(jié)果如圖 1，參照GB/T 16886.5-2003，采用第3代對數(shù)生長期BMSC，配制成2.0×104/ml細(xì)胞懸液，每孔0.2 ml接種于96 孔板，細(xì)胞貼壁后分別置換為等量的不同濃度涂層試件及微弧氧化試件浸提液，設(shè)置陰性對照組(含10%FBS的DMEM)，100%浸提液組，50%浸提液組，10%浸提液組，1%浸提液組，陽性對照組(含0.64%苯酚的培養(yǎng)液)，每組設(shè)置6 個副孔，37 ℃孵箱連續(xù)培養(yǎng)，分別于第1、3、5天每孔加入20 μl CCK-8液，繼續(xù)孵育2 h后，酶標(biāo)儀于450 nm波長下測得吸光度值(A值)。計算各組的細(xì)胞相對增殖率。細(xì)胞相對增殖率=(實驗組A值/陰性對照組A值)×100%。根據(jù)毒性評價標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換為毒性分級。

圖 1 流式細(xì)胞鑒定結(jié)果

1.5 口腔黏膜刺激試驗[9]

1.5.1 試驗動物 健康成年新西蘭兔10 只，雙頰黏膜無病變，4～6 kg(第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心)。

1.5.2 試驗方法 高速渦輪手機(jī)于直徑5 mm、厚度1 mm涂層試件及微弧氧化試件中間打2 個直徑約0.5 mm圓孔，以備固定。牙膠片制備成同規(guī)格作為陰性對照組。參照YY/T 0279-1995采用將試件縫固在兔頰黏膜的方法進(jìn)行試驗。涂層試件與牙膠片紐扣式縫合固定于一側(cè)頰黏膜(間隔3 mm以上)，采用同樣的方法將微弧氧化試件縫合于兔子另一側(cè)頰黏膜，間隔3 mm以上未作任何處理處作為空白對照。

1.6 溶血試驗[10-11]

1.6.1 試驗動物 一只健康成年新西蘭兔(第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心)。

1.6.2 試驗方法 參照YY/T 0127.1-1993和GB/T 16886.4-2003抽取兔耳血進(jìn)行試驗。涂層試件預(yù)先鈷60滅菌處理。陰性對照組為10 ml 0.9%生理鹽水組，陽性對照組為10 ml蒸餾水組，實驗組為10 ml試件的生理鹽水浸提液(按試件質(zhì)量與生理鹽水0.2 g/ml加入涂層試件，涂層試件需完全浸沒于生理鹽水中)，每組設(shè)置3 個平行對照。溶血率lt;5%為該材料無溶血性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 新型鈦種植體涂層表面形貌

試件噴金，場發(fā)射掃描電鏡觀察。結(jié)果如下：圖 2顯示微弧氧化后的試件表面呈現(xiàn)多孔狀結(jié)構(gòu)，孔徑較均一，在1～10 μm之間，狀如火山口狀。圖 3顯示新型涂層試件表面形貌，低倍鏡下可見納米微球良好地分布于各個微孔中，孔隙覆蓋率極高；高倍鏡下可見微球與微球之間，微球與微孔壁間通過明膠緊密相連。

圖 2 微弧氧化涂層掃描電鏡圖

圖 3 新型涂層掃描電鏡圖

2.2 細(xì)胞毒性試驗

流式細(xì)胞鑒定結(jié)果如圖 1，第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD90呈陽性表達(dá),而CD45呈陰性表達(dá)，均符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征。圖 4為細(xì)胞在100%浸提液中培養(yǎng)24 h的生長情況，圖中可見細(xì)胞已完全貼壁，少許細(xì)胞變圓，大多呈梭形生長，細(xì)胞在100%濃度涂層試件浸提液中生長良好，細(xì)胞毒性實驗結(jié)果見表 1～2。參考細(xì)胞相對增殖率,該材料細(xì)胞毒性反應(yīng)分級為1 級，表明該材料基本不具有細(xì)胞毒性。

圖 4 細(xì)胞在100%涂層試件浸提液的生長情況(×100)

Fig 4 BMSCs cultured in the leaching medium of the novel fuctional coating(×100)

分 組吸光度值相對增值率毒性分級陰性對照組100%浸提液組50%浸提液組10%浸提液組0.7958±0.68240.7898±0.07150.7672±0.05420.7568±0.076099.24%96.40%95.09%1級1級1級1%浸提液組陽性對照組0.7365±0.06000.0943±0.002892.54%11.85%1級4級

Tab 2 Cytotoxicity of microarc-oxidized titanium (±s, n=6)

2.3 口腔黏膜刺激試驗

各組涂層試件與頰黏膜接觸固位良好。1 只兔子的牙膠片脫落。肉眼觀局部未見紅腫、破潰等情況。組織病理學(xué)結(jié)果：涂層試件組、微弧氧化試件組與陰性及空白組相似，基底膜完整連續(xù)，固有層未見炎細(xì)胞浸潤、血管增生等異常。組織學(xué)切片結(jié)果見圖 5。

2.4 溶血試驗

溶血試驗結(jié)果如表 3，實驗組溶血率=4.6%，該材料無溶血反應(yīng)。

圖 5 與試件相接觸的兔頰黏膜組織觀察(HE)

Fig 5 Morphology of mucous membrance at the contacted site of the test specimens(HE)

表 3 溶血試驗結(jié)果(n=3)

Tab 3 Hemolysis of the groups (n=3)

3 討 論

種植體周圍炎對種植體的長期穩(wěn)定產(chǎn)生很大的影響，引起骨吸收甚至種植失敗[12]。目前研究較多的是種植體表面改性或涂層技術(shù)，比如改變植體表面能，釋放金屬離子或抗生素[13-15]。尤其是對于種植體周圍炎出現(xiàn)炎性骨缺損時，如何抑制破骨效應(yīng)、促進(jìn)缺損骨組織內(nèi)源性再生，是提高種植體遠(yuǎn)期成功率的重要問題。

研究表明基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)在干細(xì)胞歸巢中具有關(guān)鍵作用，可以作為干細(xì)胞“歸巢”的首選誘導(dǎo)因子[16]。同時，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2能夠在骨缺損區(qū)實現(xiàn)完整的骨再生，并且具有很強(qiáng)的異位成骨的能力[17]?；谏鲜鲅芯浚覀兂晒χ苽涑霭黃DF-1和rhBMP-2的雙層載藥納米微球并對其體外生物學(xué)性能進(jìn)行了初步研究和證實。但常規(guī)種植體表面光滑，如何將載藥納米微球應(yīng)用于種植體成為難題。微弧氧化是一種常用的種植體表面處理技術(shù)，能顯著提高種植體的生物相容性和骨引導(dǎo)性，且多孔狀的涂層形貌(孔徑為1～5 μm)為與載藥微球的結(jié)合提供了可能。若能夠?qū)黃DF-1和rhBMP-2的雙層載藥納米微球黏附于微弧氧化微孔中，發(fā)揮SDF-1與BMP-2的聯(lián)合作用，則有望實現(xiàn)種植體周圍炎炎性骨缺損的修復(fù)。

Wu等[3]通過振蕩滲涂交聯(lián)法將載呋喃酮微球粒徑為(408±14) nm加載于微弧氧化涂層的微孔中(孔徑約為1～5 μm)，結(jié)果顯示復(fù)合涂層具有良好的表面形貌。本課題組前期成功制備的雙層載藥納米微球粒徑為(542.33±14.38) nm，與文獻(xiàn)[3]中載呋喃酮微球粒徑較接近，本實驗借鑒上述方法，同樣采用振蕩滲涂交聯(lián)法將雙層載藥納米微球加載于微弧氧化涂層從而構(gòu)建出一種新型功能性涂層。掃描電鏡下觀察結(jié)果顯示新型涂層表面形貌良好，微球幾乎全部位于微孔中，微孔與微孔之間的交界面微球黏附較少，微球的孔隙覆蓋率極高，由于微球通過明膠黏附于微孔中，可以有效防止種植體植入過程中微球的脫落。但其是否可以作為種植體材料還需進(jìn)行生物相容性實驗。本實驗通過體外細(xì)胞毒性試驗、口腔黏膜刺激試驗以及體外溶血試驗對該新型種植體涂層的生物安全性進(jìn)行初步評估。本文采用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗，CCK-8法較其他檢測方法如MTT、WST法操作簡便，結(jié)果更精確。細(xì)胞毒性結(jié)果顯示BMSC細(xì)胞在不同濃度新型功能性涂層浸提液中吸光度值與陰性對照組無明顯差異，新型功能性涂層組細(xì)胞毒性分級為1級，可以認(rèn)為新型功能性涂層基本無細(xì)胞毒性；口腔黏膜刺激試驗通過肉眼及組織學(xué)觀察評估新型涂層試件以及其他對照試件對口腔黏膜的刺激作用，肉眼觀察可見與各試件相接觸的黏膜局部無紅腫破潰等現(xiàn)象，組織病理學(xué)結(jié)果顯示無炎細(xì)胞浸潤及上皮異常增生現(xiàn)象，可認(rèn)為新型涂層試件對口腔黏膜無刺激性。體外溶血試驗多用于評價長期與骨或軟組織接觸的材料的體外急性溶血活性。本實驗新型功能性涂層試件溶血率為4.6%，符合醫(yī)用生物材料溶血率標(biāo)準(zhǔn)，可認(rèn)為該材料無體外溶血作用。

綜上所述，通過以上3 項實驗結(jié)果，可初步認(rèn)為該材料具有良好的生物安全性。我們將進(jìn)一步對其體外促進(jìn)成骨分化、抑制破骨細(xì)胞分化成熟及體內(nèi)成骨等生物學(xué)活性進(jìn)行深入研究，以期為促進(jìn)骨缺損修復(fù)的治療提供一種新思路。

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(收稿： 2016-10-18 修回： 2017-01-04)

Fabricationandinvitrobiologicalsafetyofanovelfunctionalcoatingonmicroarc-oxidizedtitanium

MARui1，SHENPeng2，LIUYifan1，GAOBo1，WUJiang1.

1. 710032Xi'an，StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatologyamp;NationalClinicalResearchCenterforOralDiseasesamp;ShaanxiKeyLaboratoryofStomatology,DepartmentofProsthodontics，SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,China； 2.OutpatientDepartmentofBeijingSpaceCity,AerospaceSystemsDivision,PLAStrategicSupportForce,Beijing

Objective: To fabricate and to study the surface morphology and biological safety of a novel coating on microarc-oxidized titanium.MethodsThe novel functional coating was fabricated by cross-linking the double-layer nanoparticles loading rhBMP-2 and SDF- 1 with gelatin on microarc-oxidation coating on titanium implant surface.The surface topography was observed and optimized, and the biological safety of the novel coating was primarily evaluated by cell toxicity test, oral mucosa stimulation test and hemolysis testinvitro.ResultsThe novel functional coating possesses excellent morphology. The coating showed the cytotoxicity of score 1 and no mucous membrane irritation, the hemolytic rate of the coating was 4.6%.ConclusionThe coating possesses good morphology and biological safety.

Titaniumimplant;Drug-loadedNanospheres;Coating;Biologicalsafety

國家自然科學(xué)基金(編號： 57311006)

710032 西安， 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科(馬瑞 劉一帆 高勃 吳江)； 戰(zhàn)略支援部隊航天系統(tǒng)部航天門診部(沈鵬)

吳江 029-84666469 E-mail：wujiang@fmmu.edu.cn

R783.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.004