朱林，蒲婧哲，張亞中,，程旺興，金斌

·藥物與臨床·

PCR-RFLP法對蛇膽川貝散中川貝母的鑒別研究

朱林1，蒲婧哲2，張亞中1,2，程旺興1，金斌2

目的：研究聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法(PCR-RFLP法)對蛇膽川貝散(膠囊)中川貝母鑒定的可行性。方法本實驗選取8個廠家的蛇膽川貝散(膠囊)作為研究對象，對模板DNA的預(yù)處理方法進行考察，通過PCR-RFLP法對提取的DNA進行擴增和酶切。結(jié)果自提樣本中只有川貝母自提樣本的PCR產(chǎn)物可被酶切，8個廠家成藥樣本的PCR產(chǎn)物均不能被Sma I酶切。結(jié)論PCR-RFLP法對蛇膽川貝散(膠囊)中川貝母的鑒別具有很高的靈敏度和準確度，對市場上成藥中川貝母的真?zhèn)舞b別提供了較好的依據(jù)。

蛇膽川貝散； 川貝母； PCR-RFLP法； 鑒別； 可行性

蛇膽川貝散(膠囊)處方均由蛇膽汁和川貝母二味藥材組成，制法為川貝母粉碎成細粉，與蛇膽汁按6∶1的比例混勻，干燥，粉碎。具有祛風(fēng)止咳，除痰散結(jié)的功效，適用于風(fēng)熱咳嗽，痰多氣喘，胸悶，咳痰不爽或久咳不止等癥[1]。由于川貝母市場價格較高，且貝母屬的一些貝母與川貝母形態(tài)相似、價格較低，因此市售川貝母替代使用現(xiàn)象嚴重[2]，常見替代品有以下幾種：浙貝母、湖北貝母、伊犁貝母、新疆貝母、平貝母等。目前，川貝母常用的鑒別方法以性狀鑒別和色譜鑒別為主，但由于貝母屬的一些貝母與川貝母化學(xué)成分較為相似，因此常用的鑒別方法都存在一定的局限性[3-13]。尤其當(dāng)川貝母以原料藥投入至成藥中，鑒別難度加大。近年來，學(xué)者們對聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法(以下簡稱PCR-RFLP法)的研究突飛猛進，并廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，提供了一種新的分析方法[14-18]?！吨袊幍洹?010年版一部增補本中新增了川貝母PCR-RFLP法鑒別，該方法從DNA角度對貝母進行分析鑒別，具有靈敏度高和準確度高的特點[19]。但目前本方法僅限于藥材鑒定，本研究將此方法應(yīng)用到蛇膽川貝散(膠囊)的成藥當(dāng)中，以考察成藥中川貝母的真?zhèn)吻闆r。本次研究選取8個廠家的四十余批蛇膽川貝散(膠囊)作為實驗樣本，同時模擬生產(chǎn)工藝，自提樣本。通過此方法的研究，首次將PCR-RFLP法應(yīng)用到成藥中，為完善成藥中的川貝母真?zhèn)舞b定方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 PCR儀(ABI)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，分析天平(MettlerAB135-S)，純水儀(Millipore公司)，全自動凝膠成像系統(tǒng)(Syngene Gene Genius)，球磨儀(M400，Retsch)。

1.2 試劑 新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP320)(天根生化科技(北京)有限公司)，川貝母-R、川貝母- F引物(華大基因)，TaKaRa EX Taq酶(RR01AM；TaKaRa)，Sma I限制性內(nèi)切酶(1085A；TaKaRa)，核酸染料Genegreen(天根)，瓊脂糖(西班牙Biowest公司)。

2 方法

2.1 樣本

2.1.1 實驗中所用成藥來源 本實驗所用的樣本，來自于8個廠家生產(chǎn)的蛇膽川貝散(膠囊)成藥。陽性對照選取川貝母中的暗紫貝母(批號121000-201007)。見表1。

表1 樣本信息及來源

2.1.2 自提樣本 本實驗?zāi)M蛇膽川貝散(膠囊)的生產(chǎn)工藝，分別取川貝母、平貝母、浙貝母、伊貝母、湖北貝母的對照藥材與蛇膽汁按蛇膽川貝散(膠囊)組成比例(6∶1)混合，混勻后在80 ℃烘箱中烘30 min，作為自提樣本。見表2。

表2 自提樣本中貝母信息

2.2 模板DNA預(yù)處理方法考察 方法一：將自提樣本及成藥加50%乙醇超聲10 min，離心，棄去上清液，沉淀分別加水30 mL，混勻，離心3次，棄去水液，將沉淀置80℃烘箱中烘30min，取出，研細，即得。方法二：取自提樣本及成藥粉末，研細，即得。經(jīng)考察，方法一與方法二結(jié)果一致，不經(jīng)預(yù)處理結(jié)果無干擾，故樣本直接進行DNA提取。成藥經(jīng)不同預(yù)處理方法的PCR結(jié)果，見圖1。

1:DNA分子標記(DNA molecular marker)(100bp、250bp、500bp); 2: 陰性; 3～4: 陽性對照;5: Z1(方法一); 6: Z2(方法一); 7: Z3(方法一); 8: Z4(方法一); 9: Z1(方法二); 10: Z2(方法二); 11: Z3(方法二); 12: Z4(方法二);

圖1 成藥預(yù)處理方法考察PCR擴增凝膠成像圖

2.3 DNA提取 取粉末20 mg，按照新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP320)(天根生化科技(北京)有限公司)說明書進行操作，得供試品溶液，置零下20℃冰箱備用。另取川貝母陽性對照20 mg，精密稱定，同法制成陽性對照模板DNA溶液。

3 PCR反應(yīng)條件

本實驗設(shè)計了2個不同的PCR反應(yīng)體系進行條件優(yōu)化：

體系一：總體積為30 μL，反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液3 μL，dNTP(10 mmol/L)0.4 μL，二氯化鎂(25 mmol/L)2 μL，鑒別引物(30 μmol/L)各0.5 μL，DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板2 μL，滅菌超純水21.4 μL；體系二：總體積為30 μL，反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液3 μL，dNTP(10mmol/L)0.4 μL，二氯化鎂(25 mmol/L)2 μL，鑒別引物(30 μmol/L)各0.3 μL，DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板2 μL，滅菌超純水21.8 μL。對2種體系進行比較，使用反應(yīng)體系一的擴增結(jié)果較好，故本次實驗選擇體系一作為PCR反應(yīng)體系。循環(huán)次數(shù)的考察：本實驗對循環(huán)次數(shù)設(shè)計了4個不同的梯度進行比較，以優(yōu)化擴增程序，次數(shù)為25次、30次、35次、40次。結(jié)果循環(huán)次數(shù)為30次的擴增效果最佳，故本次實驗選擇30次為循環(huán)次數(shù)。退火溫度的考察：本實驗對退火溫度設(shè)計了5個不同的梯度進行比較，以優(yōu)化擴增程序，溫度為55 ℃,58 ℃,60 ℃,62 ℃,65 ℃。結(jié)果退火溫度為62 ℃的條帶最清晰，故本次實驗選擇62 ℃為退火溫度。

3.1 鑒別引物 上游：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3’；下游：5’-GCTACGTTCTTCATCGAT-3’。

3.2 酶切反應(yīng)體系 取PCR反應(yīng)液，在200 μL離心管中進行，反應(yīng)總體系為20 μL，反應(yīng)體系包括10×酶切緩沖液2 μL，PCR反應(yīng)液6 μL，Sma I(10 U/μL)0.5 μL，BSA 2 μL，滅菌超純水9.5 μL。酶切反應(yīng)參數(shù)：30℃，2 h。

3.3 瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像 使用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓150 V，約30 min，電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上檢視。

4 結(jié)果

4.1 PCR-RFLP法實驗結(jié)果 在自提樣本中，只有川貝母的自提樣本PCR產(chǎn)物能夠被限制性內(nèi)切酶Sma I切成2個片段，大小在100～250 bp，其它貝母自提樣本，均不能被Sma I酶切。見圖2自提樣本PCR-RFLP凝膠成像結(jié)果圖；8個廠家成藥樣本的PCR產(chǎn)物均不能被Sma I酶切，見圖3成藥PCR-RFLP凝膠成像結(jié)果圖。

1-2:川貝母陽性對照;3:PBZT;4:ZBZT;5:HBZI;6:YBZT;7:青貝;8:松貝;9:太白貝母;10:瓦布貝母;11:陰性;12:DNA分子標記(100bp、250bp、500bp)

圖2 自提樣本PCR-RFLP結(jié)果圖

1-2:川貝母陽性對照;3:Z1;4:Z2;5:Z3;6:Z4;7:Z5;8:Z6;9:Z7;10:Z8;11:陰性;12:DNA分子標記(100bp、250bp、500bp)

圖3 成藥PCR-RFLP結(jié)果圖

4.2 方法檢出限考察 本研究為考察成藥中川貝母的檢出限，選取國藥集團馮了性(佛山)藥業(yè)的蛇膽川貝散為樣本，分別按照5%,25%,50%,75%,100%比例摻入川貝母陽性對照(批號121000-201007)，制備檢出限實驗樣本。檢出限樣本信息，見表3。每份取20 mg，按照上述PCR-RFLP法進行檢測，結(jié)果表明：當(dāng)成藥中含有川貝母的限度為5 %時，此方法即可適用，PCR-RFLP法檢出限結(jié)果，見圖4。

表3 檢出限樣本的信息

2-3:J1;4-5:J2;6-7:J3;8-9:J4;10-11:J5;12:DNA分子標記(100bp，250bp，500bp)

圖4 方法檢出限PCR-RFLP結(jié)果圖

5 討論

成藥中鑒定川貝母的真?zhèn)螁栴}一直是一個難點。由于蛇膽川貝散(膠囊)成分僅為川貝母與蛇膽汁，且蛇膽汁所占比例較小，故干擾較小，且川貝母為原粉入藥。這也是我們能夠把PCR-RFLP法應(yīng)用到此成藥的前提條件。

通過8個廠家的蛇膽川貝散(膠囊)和4批自提樣品，研究PCR-RFLP法對成藥中川貝母鑒別的可行性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個廠家蛇膽川貝散(膠囊)的PCR產(chǎn)物均不能被Sma I酶切，只有川貝母自提樣本有酶切條帶。廠家生產(chǎn)的蛇膽川貝散(膠囊)中存在使用貝母屬其它貝母替代川貝母投料使用的可能性。本實驗對兩種反應(yīng)體系進行了考察，對循環(huán)次數(shù)和退火溫度進行了梯度實驗，根據(jù)實驗結(jié)果最終確定本實驗的反應(yīng)體條件。

雖然PCR-RFLP法對于川貝母的藥材的鑒別已經(jīng)有不少研究[20-26]，但缺少對成藥中川貝母摻偽的鑒別，這也增加了本研究的難度。經(jīng)過實驗的探索與研究，得出了PCR-RFLP法對成藥中川貝母摻偽的鑒別有著很高的準確度和靈敏度，為PCR-RFLP法的完善和優(yōu)化作出一定的理論依據(jù)，尤其對市售蛇膽川貝散(膠囊)及其他成藥中川貝母摻偽的鑒別提供理論依據(jù)，對市售含川貝母藥品的質(zhì)量有著強有力的督促。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015:1487.

[2] 趙高瓊,任波,董小萍.川貝母研究現(xiàn)狀[J].中藥與臨床,2012,3(6):59-64.

[3] 任立波.川貝母及常見偽品的鑒別[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2012,31(16):49.

[4] 吳小婷.川貝母的真?zhèn)舞b別[J].海峽藥學(xué),2014，173(6):39-41.

[5] 倪進利.川貝母真?zhèn)蔚蔫b別[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育,2013，15(10):93-94.

[6] 張迎春,王燕華.川貝母真?zhèn)舞b別[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011,13(11):220-221.

[7] 丁麗娟.川貝母及其常見偽品鑒別[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009,32(2):83-84.

[8] 劉志梅,趙華,明延波.川貝母及其偽品小東貝母的鑒別[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2013,20(8):70-71.

[9] 楊復(fù)森,武衛(wèi)紅,王寧.基于AOTF-近紅外光譜技術(shù)的川貝母藥材即時快速鑒別研究[J].中成藥,2013,35(1):135-140.

[10] 任立波.川貝母及常見偽品的鑒別[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2012,31(16):49.

[11] BAOZHONG DUAN.Identification and Quantitative Analysis of Nucleosides and Nucleobases in Aqueous Extracts of D. Don. Using HPLC-DAD and HPLC-ESI- MS[J]. Analytical Letters, 2011, 44(15): 2491-2502.

[12] 劉薇,張文娟,程顯隆,等.中藥川貝母質(zhì)量控制方法研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2015,11(2):41-46.

[13] 王曙,徐小平,譚昌勇,等.川貝母與其它貝母的薄層色譜鑒別[J].華西藥學(xué)雜志,2002,17(3):219-221.

[14] 朱田田,晉玲,張裴斯,等.麻花秦艽ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2015,21(6):74-78.

[15] 龔美蓉,陳鳳麗,曹晨,等.實時熒光定量PCR技術(shù)及其在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014,20(22):238-241.

[16] 周雨晴,杜沛霖,傅鵬,等.青天葵ISSR-PCR體系優(yōu)化及引物篩選[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014,20(21):95-99.

[17] 周濤,吳鈺,金艷蕾,等.頭花蓼重復(fù)片段多態(tài)性分析-多聚酶鏈式反應(yīng)體系建立與正交優(yōu)化[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2010,16(6):50-53.

[18] 糜亞男,張水寒,蔡媛,等.杜仲SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2015,21(2):1-6.

[19] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(第一增補本)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010:83．

[20] 徐傳林,李會軍,李萍,等.川貝母藥材分子鑒定方法研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報,2010,41(3):226-230.

[21] WAND WZ,LI O,Ding JY,et al.Simultaneous identification of Bulbus Fritillariae cirrhosae using PCR-RFLP analysis[J].Phytomedicine,2007,14(9):628-632.

[22] 譚瑩,張麗華,李明成,等.中藥材川貝母DNA指紋鑒定研究[J].中國藥學(xué)雜志,2011,46(1):14-16.

[23] 張文娟,尚柯,魏鋒,等.聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法對太白貝母鑒別檢驗的適用性探討[J].中國現(xiàn)代中藥,2015,17(9):905-910.

[24] 羅達龍,黃林杰,黃琳.實時熒光定量PCR對川貝母的鑒別應(yīng)用[J].中國藥師,2016,19(6):1068-1070.

[25] 俞超,梁孝祺,陳金金,等.DNA條形碼技術(shù)鑒定貝母屬植物[J].中草藥,2014,45(11):1613-1619.

[26] 羅焜,馬培,姚輝,等.基于ITS2序列鑒定川貝母及其混偽品基原植物[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2012,14(1):1153-1158.

安徽省科技攻關(guān)計劃項目(1501041174)

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，安徽 合肥 230031；2.安徽省食品藥品檢驗研究院 中藥室，安徽 合肥 230051

朱林(1993-)，男，在讀研究生。

程旺興(1971-)，男，教授，博士，E-mail:chengwangxing@gmail.com。

10.14126/j.cnki.1008-7044.2017.06.038

R 282.5

A

1008-7044(2017)06-0719-04

2017-05-17)