胡德龍

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)學(xué)園藝系，江蘇 句容 212400)

茄子花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因SmGT的克隆與生物信息學(xué)分析

胡德龍

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)學(xué)園藝系，江蘇 句容 212400)

葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(SmGT)是植物花青素合成途徑中的一種關(guān)鍵酶，在植物果實顏色調(diào)控方面具有重要的作用。試驗以紫色茄子三月茄為材料，設(shè)計一對特異性引物，克隆SmGT基因的ORF(開放閱讀框)，獲得長度為1 413 bp的全長序列。序列分析表明，SmGT肽鏈含有470個氨基酸，分子量為52.75 ku，等電點為4.98，是一種參與生物體代謝途徑的親水性多肽。結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)分析均表明，SmGT含有典型的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，是一種糖基轉(zhuǎn)移酶。蛋白質(zhì)相似性分析表明，SmGT蛋白與馬鈴薯、野生番茄、辣椒和矮牽牛的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶相似性分別為93%、93%、91%和 87%。SmGT基因的克隆對于研究茄子花青素的生物合成途徑以及分子機理具有重要意義。

茄子； 糖基轉(zhuǎn)移酶；SmGT基因； 花青素； 生物信息學(xué)分析

茄子(SolanummelongenaL.)屬被子植物門，一年生草本植物，原產(chǎn)于東南亞熱帶地區(qū)，遍布世界各地，在亞洲廣泛種植，我國種植面積也非常大。茄子果實為漿果，形狀各異，有長、圓、橢圓之分。果皮顏色也多種多樣，有紫色、白色、綠色等。茄子果皮的顏色呈現(xiàn)主要與其花青素含量密切相關(guān)[1]?；ㄇ嗨厥菦Q定植物顏色的一種重要物質(zhì)，目前植物中存在的花青素主要有：天竺葵素、矢車菊素、巧藥素、飛燕草素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素。游離的花青素在植物體內(nèi)很不穩(wěn)定，通常會在葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)的作用下形成穩(wěn)定的花色素苷。花青素(anthocyanidin)廣泛存在于茄子、馬鈴薯、番茄、枇杷、枸杞、桑葚、山楂、葡萄等植物中，近年來，人們對花青素在美容養(yǎng)顏、食品保健、抗炎癥、調(diào)節(jié)血脂中的作用關(guān)注度越來越高[2]。植物體內(nèi)的酶類、過氧化物、pH值、溫度、金屬離子等均會影響到花青素的穩(wěn)定性，其中pH值對花青素的穩(wěn)定性影響最大。花青素在溶液介質(zhì)中可以發(fā)生逆向反應(yīng)，是以互變的形式平衡存在的；當(dāng)pH值發(fā)生變化時，花青素不同形式之間就會轉(zhuǎn)換，從而導(dǎo)致所表現(xiàn)出來的色澤和顏色強度發(fā)生變化[3]。不同果皮顏色茄子的花青素含量不同，其中紫色茄子含量最高，白色茄子含有少量甚至根本沒有花青素的存在。

目前，關(guān)于花青素合成途徑主要集中在前體合成方面的研究，然而對花青素合成途徑中花青素修飾方面的研究較少。本研究以紫色茄子三月茄為試驗材料，設(shè)計特異性引物[4]，克隆SmGT(葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)基因的cDNA全長序列，對其進行核苷酸序列分析、蛋白信號肽預(yù)測、結(jié)構(gòu)域預(yù)測、蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析、進化樹構(gòu)建以及蛋白相似性比對等生物信息學(xué)分析。本研究將為今后研究SmGT基因的功能、探究茄子花青素生物合成調(diào)控機制以及進一步揭示不同茄子品種間果皮顏色差異的形成機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用三月茄為試驗材料，該品種株型緊湊，分枝多，紫白花，果實長卵圓形，紫紅色，具有早熟、耐寒、早春坐果率高、肉質(zhì)細(xì)嫩、品質(zhì)好、適應(yīng)性廣等特性。在溫室中用盆缽直播，30 d后取幼嫩葉片進行總RNA的提取。

TaqDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP等購自大連寶生物公司(TaKaRa)。引物合成和測序均由上海生工完成。

1.2 茄子葉片總RNA的提取及質(zhì)量檢測

將樣品加入液氮研磨好后迅速轉(zhuǎn)移到加好溶液的10 mL離心管，離心管內(nèi)含3 mL硼砂-SDS提取液(SDS 2%，硼砂0.0125 mol·L-1，PVP-40 2%，pH 值8.5)、0.25 mL β-巰基乙醇、2 mL Tris-飽和苯酚和1.5 mL氯仿異戊醇混合液(V∶V為24∶1)，渦旋振蕩3 min，冰上放置5 min，于4 ℃，9 600 r·min-1離心20 min。吸取上清至一新離心管，加等體積的異丙醇，-20 ℃下沉淀1～2 h，4 ℃ 9 600 r·min-1離心20 min。倒掉液體，加入3 mL CTAB提取液(1.4 mol·L-1NaCl，0.1 mol·L-1Tris-HCl，pH值8.0，20 mmol·L-1EDTA，2% CTAB，2% PVP，1% β-巰基乙醇，DEPC處理)，用移液槍將沉淀吹到溶解，65 ℃水浴15 min。加等體積氯仿充分混勻，冰浴靜置10 min，于4 ℃，9 600 r·min-1離心20 min，將上清轉(zhuǎn)移至一新的10 mL離心管內(nèi)。加入1/3體積的8 mol·L-1氯化鋰，混勻，-70 ℃冰浴，30 min或-20 ℃處理1～2 h，于4 ℃，9 600 r·min-1離心20 min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌2～3次，9 600 r·min-1離心5 min。吸取乙醇，收集RNA沉淀，抽干后加入50 μL DEPC水溶解。用紫外分光光度計分別測量D260和D280，以雙蒸水為對照，用D260/D280的比值來估算總RNA的純度。通過凝膠電泳系統(tǒng)拍照觀察總RNA的完整性。

1.3 cDNA第一條鏈的合成

將2 μL oligo (dT)，1～5 μg總RNA，2 μL 10 mmol·L-1dNTP混合物，加入到經(jīng)過處理的無RNA酶的離心管中，用滅菌蒸餾水補至14 μL。將離心管置于70 ℃水浴加熱5 min后迅速于冰上冷卻2 min，簡短離心后加入4 μL 5×First-Strand buffer，1 μL 0.1 mol·L-1DTT(二硫蘇糖醇)。加1 μL(200 U)反轉(zhuǎn)錄酶并輕輕混勻。于42 ℃溫浴50 min，95 ℃加熱5 min終止反應(yīng)。將所得樣品置于-20 ℃冰箱長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SmGT基因引物設(shè)計及cDNA全長的克隆

參考李翔等[4]，用Premier 5.0軟件設(shè)計一對特異引物JZ-F(5′-ATGGTGAAGGCTCATATTAT-3′)和JZ-F(5′-TCAATAACCTTTGGCAACTTCATC A-3′)，以cDNA 為模板，參考反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書，擴增茄子SmGT基因cDNA 全長序列。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 40 s，61 ℃ 50 s，72 ℃ 70 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min，程序結(jié)束后將PCR產(chǎn)物進行電泳檢測驗證，隨后將符合預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物送大連寶生物公司進行測序。

1.5 SmGT基因生物信息學(xué)分析

1.5.1 基本理化性質(zhì)及親疏水性

用Protparam工具預(yù)測氨基酸多肽鏈的氨基酸組成、等電點、相對分子量、分子式等；用ProtScale工具分析多肽鏈的親疏水性。

1.5.2 信號肽及跨膜區(qū)

使用SignalP 4.0在線預(yù)測信號肽：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/。使用TMpred預(yù)測跨膜：http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html。

1.5.3 亞細(xì)胞定位預(yù)測

利用MultiLoc2在線預(yù)測亞細(xì)胞定位: http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc2。

1.5.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用InterPro進行結(jié)構(gòu)域分析：http://www.ebi.ac.uk/interpro/。用GOR4工具，對編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測：http://npsa-pbil.ibcp.fr:80/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html。用SWISS-MODEL預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)：http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html。

1.5.5 蛋白序列同源比對及進化樹分析

用Protein BLAST進行蛋白質(zhì)的同源性比對分析：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。用Clustal Omega構(gòu)建系統(tǒng)進化樹：http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/。

2 結(jié)果與分析

2.1 茄子總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成

從茄子葉片中提取RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖電泳(圖1)，顯示有28S和18S兩條清晰的條帶，且28S的亮度是18S的2倍，也沒有DNA污染，說明提取的RNA完整性比較好。經(jīng)過Backman DU800 分光光度計檢測，其D260/D280在1.9～2.0，說明RNA純度比較高，沒有蛋白等雜質(zhì)的污染。

M，DL2000; 1，RNA圖1 茄子葉片總RNA的提取

cDNA第一條鏈的合成，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟進行，反轉(zhuǎn)錄結(jié)果(圖2)顯示，有彌散狀的不同分子量大小的cDNA。說明cDNA質(zhì)量比較好，可以進行后續(xù)實驗。

M, DL2000; 1, cDNA圖2 cDNA第一條鏈的合成

2.2 SmGT基因全cDNA全長的克隆及序列

利用設(shè)計的特異性引物JZ-F和JZ-R，以上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR擴增，測序結(jié)果顯示，該基因ORF(開放閱讀框)全長為1 413 bp，A堿基數(shù)489，占34.4%；G堿基數(shù)目295，占20.9%；C堿基數(shù)目200，占14.2%；T堿基數(shù)目432，占30.6%；A+T占65.0%；G+C 占35.0%(圖3)；說明該基因A+T含量較高，與其他物種的糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因具有類似特點。

2.3 SmGT蛋白的理化性質(zhì)

用Protparam軟件在線對SmGT氨基酸序列進行分析。結(jié)果表明，這是一條含有470個氨基酸殘基的多肽鏈，其蛋白質(zhì)分子量為52.75 ku，等電點為4.98，分子式為C2384H3683N595O710S22；該蛋白質(zhì)的半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為50.53，屬于不穩(wěn)定性蛋白。

灰色底紋代表引物序列；方框代表起始密碼子和終止密碼子圖3 SmGT cDNA全長序列

2.4 SmGT蛋白的親疏水性

疏水作用是驅(qū)使蛋白質(zhì)折疊的主要動力，蛋白質(zhì)親疏水性分析是了解蛋白質(zhì)折疊的第一步，同時也為蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測提供依據(jù)，也可用于分析蛋白質(zhì)相互作用位點。用ProtScale軟件對SmGT蛋白進行分析(圖4)，總體得分為負(fù)數(shù)，推測此多肽鏈為親水性多肽鏈。

圖4 SmGT蛋白的親疏水性分析

2.5 信號肽及跨膜區(qū)

信號肽是由5～30個氨基酸組成的短肽鏈，主要作用是指引新合成的蛋白質(zhì)進行跨膜轉(zhuǎn)移，保證新合成的蛋白質(zhì)能夠準(zhǔn)確進行定位運輸。本研究利用SignalP 4.1 Server 軟件對SmGT信號肽進行預(yù)測。一般認(rèn)為平均信號肽得分大于0.5時，存在信號肽；當(dāng)小于0.5時，則不存在信號肽。而SmGT蛋白質(zhì)的氨基酸殘基平均信號肽最大得分值為0.347，因此該蛋白不存在信號肽(圖5)。

圖5 SmGT信號肽預(yù)測

跨膜區(qū)是跨越細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)序列區(qū)域，主要由疏水性氨基酸組成，是細(xì)胞膜內(nèi)蛋白質(zhì)與膜脂結(jié)合的關(guān)鍵部位。本文利用TMpred工具對SmGT進行分析，結(jié)果顯示，該蛋白由外向內(nèi)、由內(nèi)向外分別含有4個和6個跨膜區(qū)(圖6)。

圖6 SmGT蛋白跨膜模型

2.6 亞細(xì)胞定位預(yù)測

利用WoLF PSORT對SmGT蛋白進行亞細(xì)胞定位分析表明，此蛋白定位在分泌途徑、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體中的可能性分別為57%、35%、5%和4%。故SmGT蛋白很有可能參與了某些代謝途徑。

2.7 結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用InterPro軟件結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示，SmGT含有典型的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因結(jié)構(gòu)域，是一種糖基轉(zhuǎn)移酶(圖7)。

圖7 SmGT蛋白保守結(jié)構(gòu)域

用GOR4工具進行二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，共有α-螺旋(Alpha helix)126處，占總二級結(jié)構(gòu)的26.8%；無規(guī)則卷曲(Random coil)247處，占總二級結(jié)構(gòu)的52.6%；延伸鏈(Extended strand)97處，占總二級結(jié)構(gòu)的20.6%(圖8)。

圖8 SmGT蛋白的二級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)的一條多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上借助非共價鍵彎曲，進一步折疊成具有不同球狀的構(gòu)象，來行使不同的功能。用SWISS-MODEL工具對SmGT蛋白進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示，SmGT是一種UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，其無規(guī)則卷曲占半數(shù)以上，這與二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果一致(圖9)。

圖9 SmGT蛋白空間構(gòu)象模擬

2.8 蛋白序列同源比對及進化樹

將已克隆的SmGT基因ORF序列翻譯成多肽鏈，借助 Protein BLAST工具分析蛋白質(zhì)的相似性。結(jié)果表明，SmGT蛋白與多種植物的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶序列具有很高的同源性，分別為：馬鈴薯 93%、野生番茄93%、辣椒91%、矮牽牛 87%、野生煙草67%、寧夏枸杞 67%、梔子 62%、滇牡丹 60%、葡萄 60%、核桃 58%、益母草 58%。隨后，用Clustal Omega構(gòu)建進化樹，結(jié)果表明，茄子SmGT與番茄、馬鈴薯、辣椒、矮牽牛為一類，親緣關(guān)系比較近；與葡萄、梔子、滇牡丹、核桃的親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)(圖10)。

圖10 不同植物SmGT蛋白的系統(tǒng)進化樹

3 討論

本研究利用Primer5.0設(shè)計一對特異性引物，從紫色三月茄品種中克隆到SmGT基因ORF全長序列。序列分析表明，該基因cDNA全長 1 413 bp，編碼470個氨基酸。亞細(xì)胞定位分析表明，SmGT蛋白定位于生物分泌途徑中的可能性最大，推測其可能參與了某種代謝途徑。結(jié)構(gòu)域分析表明，SmGT蛋白含有典型的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，屬于一種糖基轉(zhuǎn)移酶。二級結(jié)構(gòu)分析表明，SmGT蛋白無規(guī)則卷曲所占的比重最大，其次是α螺旋，最后是鏈的延伸。三級結(jié)構(gòu)分析表明，SmGT是一種UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，與結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果一致，具有糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)特征。蛋白質(zhì)同源性比對分析，SmGT蛋白與馬鈴薯、野生番茄、辣椒、矮牽牛等的糖基轉(zhuǎn)移酶同源性在87%以上，進一步說明所克隆的SmGT基因正是茄子的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因。進化樹分析表明，SmGT蛋白與番茄、馬鈴薯、辣椒、矮牽牛為一類，親緣關(guān)系比較近；與葡萄、梔子、滇牡丹、核桃的親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)。以上結(jié)果均表明，本研究所克隆的SmGT基因是一條完整的ORF，其編碼的蛋白為葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。

花青素的種類與含量是導(dǎo)致茄子呈現(xiàn)不同顏色的主要原因，其在保護血管與降低血脂、自由基清除與抗氧化性和消炎等方面都得到了廣泛應(yīng)用[5]，因此具有很好的市場前景。然而，游離的花青素在植物體內(nèi)很不穩(wěn)定，通常會在葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)的作用下形成穩(wěn)定的花色素苷。本研究從三月茄葉片中克隆了SmGT基因，并對其生物學(xué)特性、結(jié)構(gòu)域、同源性、進化關(guān)系進行了分析，為進一步研究該基因在花青素合成途徑中的作用以及分子機理奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：張 韻)

2017-09-07

江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研項目(2014kj16)

胡德龍(1982—)，男，山東泰安人，講師，博士，研究方向為分子遺傳育種，E-mail: hdlhq@163.com。

文獻著錄格式：胡德龍. 茄子花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因SmGT的克隆與生物信息學(xué)分析[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(11)：2029-2033.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171149

S641.1

A

0528-9017(2017)11-2029-05