姚克昌，劉月月，游國進(jìn)，李淑蕓，夏 靜，何 肖，李雯雯，杜莉靜，韓新鋒，黃 勇

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

西南部分地區(qū)Ⅰ群禽腺病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查及致病性研究

姚克昌，劉月月，游國進(jìn)，李淑蕓，夏 靜，何 肖，李雯雯，杜莉靜，韓新鋒，黃 勇*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

2015—2016年，西南地區(qū)多個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)發(fā)生疑似禽腺病毒感染病例。實(shí)驗(yàn)從發(fā)病雞場(chǎng)采集肝組織，利用雞胚腎細(xì)胞(CEK)進(jìn)行病毒分離，共分離出16株Ⅰ群禽腺病毒(FAdV)。通過對(duì)hexon基因L1環(huán)臨近的保守序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)16株FAdV分屬4個(gè)血清型，其中13株為FAdV-4型，F(xiàn)AdV-8a，F(xiàn)AdV-8b和FAdV-2型各占1株。選取不同血清型的4個(gè)代表毒株CH/SCDY/1604(FAdV-4)、CH/GZXF/1512(FAdV-2)、CH/CQBS/1504 (FAdV-8a)、CH/CQBS/1512(FAdV-8b)進(jìn)行雞的致病性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，感染CH/SCDY/1604(FAdV-4)的死亡率達(dá)80%，CH/CQBS/1504(FAdV-8a)感染組死亡率為20%，而CH/GZXF/1512(FAdV-2)和CH/CQBS/1512(FAdV-8b)組的雞只有發(fā)病沒有死亡。FAdV-4是西南地區(qū)流行的主要血清型且其致病性極高，其致病性主要表現(xiàn)為心包積液綜合征(HPS)。試驗(yàn)結(jié)果可為西南地區(qū)Ⅰ群禽腺病毒感染的防治提供參考。

Ⅰ群禽腺病毒；心包積水綜合征；流行病學(xué)調(diào)查；致病性

禽腺病毒(fowl aviadenoviruses，F(xiàn)AdVs)是無囊膜的雙鏈DNA分子，屬于腺病毒科，禽腺病毒屬[1-3]。根據(jù)當(dāng)前病毒分類系統(tǒng)，禽腺病毒可分為3個(gè)亞群，即Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ群。Ⅰ群禽腺病毒根據(jù)限制性內(nèi)切酶酶切分析可分為5個(gè)型即FAdV-A～FAdV-E，根據(jù)血清交叉中和實(shí)驗(yàn)可分為12個(gè)血清型即FAdV-1～FAdV-8a，F(xiàn)AdV-8b～FAdV-11。Ⅱ群禽腺病毒包括火雞血性腸炎病毒(HEV)、大理石脾病毒和雞大脾病毒。Ⅲ群禽腺病毒產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(EDSV)[4-7]。Ⅰ群禽腺病毒主要引起包涵體肝炎(inclusion body hepatitis，IBH)、心包積液綜合征(the hydropericardium syndrome，HPS)和肌胃糜爛(gizzard erosions，GE)[8-11]。Ⅰ群禽腺病毒12個(gè)血清型都能引起雞包涵體肝炎，典型的包涵體肝炎多發(fā)于3～10周齡肉雞，以6周齡以前的雞最常見，死亡率在10%左右，主要表現(xiàn)在肝臟壞死、肝細(xì)胞內(nèi)含有嗜酸性和嗜堿性包涵體[12-13]；大多數(shù)雞的心包積液綜合征的暴發(fā)是由FAdV-4型引起，其特征病變是心包充滿透明的或淡黃色的液體，并伴有腎炎、肝炎，死亡率在30%～80%；引起肌胃糜爛的血清型有FAdV-1、FAdV-8，目前只有在白來航雞上有較多報(bào)道[14-15]。近幾年，世界各地都報(bào)道包涵體肝炎和心包積液綜合征發(fā)生，給許多國家造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，如美國[16]、印度[17]、南非[18]、加拿大[19]、韓國[10]、新西蘭[20]、匈牙利[21]、波蘭[22]、日本[23]、歐洲[24]等，在中國也有發(fā)生[9, 11, 25]。最近1～2年，疑似Ⅰ群禽腺病毒感染在西南地區(qū)部分養(yǎng)雞場(chǎng)中發(fā)生，并且有很高的死亡率，給西南地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究從西南地區(qū)發(fā)病雞群中采集病料進(jìn)行Ⅰ群禽腺病毒的分離、遺傳進(jìn)化分析和致病性測(cè)定，為西南地區(qū)該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、雞胚及試驗(yàn)動(dòng)物

E.coliDH5a，購自寶生物工程(大連)有限公司；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；1日齡商品代白羽肉雞，購自四川省成都市溫江正大集團(tuán)，飼養(yǎng)至所需日齡。

1.1.2 主要試劑

pMD19-T、premix LATaq、限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上公布的FAdV-I 12個(gè)血清型的hexon基因L1環(huán)臨近的保守序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性PCR反應(yīng)引物(F1: 5′-CAARTTCAGRCAGACGGT-3′和F2: 5′-TAGTGATGMCGSGACATCAT-3′)，擴(kuò)增片段的預(yù)計(jì)大小為897 bp。所設(shè)計(jì)的引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理

2015—2016年從四川、云南、重慶和貴州等西南地區(qū)的有疑似Ⅰ群禽腺病毒感染和致病雞場(chǎng)中采集雞肝臟組織52份，按1∶5的比例(m/V)加入滅菌PBS，磨碎制備組織懸液，6 000 r·min-1離心5 min，取上清液備用。

1.2.2 病料的PCR檢測(cè)

采用苯酚/氯仿法提取樣本中的DNA，然后通過PCR對(duì)樣本中的Ⅰ群禽腺病毒特異性核酸進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)總體系如下：DNA模板4 μL，10×ExTaqPCR MasterMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后；72 ℃延伸10 min。取6 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于電泳檢測(cè)，于凝膠成像儀下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序

參照DNA膠回收試劑盒(TIANgel Midi purifieation Kit)的使用說明對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后連接到pMD19-T載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞上，挑取陽性克隆接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)10～12 h，收取菌液，按照E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I(200t)說明書提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。將經(jīng)過雙酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。然后，通過NCBI的BLAST功能于基因庫中的所有序列進(jìn)行分析比對(duì)，再從國際基因庫中選取下載不同國家或地區(qū)各個(gè)血清型的具有代表性的毒株序列，共16個(gè)序列(參考毒株的基本信息見表1)，通過DNAstar軟件中MegAlign程序中的clustal W法進(jìn)行鑒定和同源性分析，并用MEGA6.0軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.2.4 病毒分離

SPF雞胚孵化至17～19日齡，按照常規(guī)方法制備雞胚腎細(xì)胞(CEK)。將PCR反應(yīng)鑒定為Ⅰ群腺病毒核酸陽性的病料上清液用0.22 μL濾膜過濾除菌，取0.2 mL接種于CEK單層6孔細(xì)胞上，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中吸附45 min，吸附完畢后將上清棄掉，加入維持液(含2%胎牛血清)，同時(shí)設(shè)未接種的對(duì)照孔。37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次。在接毒后48～72 h收毒。通過PCR對(duì)收取的細(xì)胞液進(jìn)行Ⅰ群腺病毒核酸的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果為陰性的細(xì)胞培養(yǎng)物再盲傳一代，如果盲傳一代后Ⅰ群腺病毒核酸檢測(cè)檢測(cè)仍然為陰性，則丟棄。分離出的病毒-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Ⅰ群禽腺病毒的定量

選取不同血清型的4個(gè)分離株CH/SCDY/1604(FAdV-4)、CH/GZXF/1512(FAdV-2)、CH/CQBS/1504(FAdV-8a)和CH/CQBS/1512(FAdV-8b)的細(xì)胞液[以后簡稱CH/SCDY/1604(4)、CH/GZXF/1512(2)、CH/CQBS/1504(8a)和CH/CQBS/1512(8b)]，按照10倍遞進(jìn)稀釋至10-1～10-8。取10-3～10-8稀釋度的病毒液，按照每孔0.2 mL接種于CEK單層24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度4個(gè)重復(fù)。于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中吸附45 min，吸附完畢后將上清棄掉，加入維持液(含2%胎牛血清)，同時(shí)設(shè)未接種的對(duì)照孔。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次，觀察5 d，按照Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.2.6 Ⅰ群禽腺病毒對(duì)雞的致病性試驗(yàn)

選取100只1周齡的商品肉雞，飼養(yǎng)至28日齡。采集泄殖腔拭子，采用1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行禽腺病毒的檢測(cè)，均為陰性。將雞隨機(jī)分成5個(gè)組(A、B、C、D、E)，每組20只。A、B、C、D的雞分別依次通過皮下接種CH/SCDY/1604(4)、CH/GZXF/1512(2)、CH/CQBS/1504(8a)和CH/CQBS/1512(8b) 4個(gè)毒株，每只雞接種的劑量都為104TCID50。對(duì)照組皮下接種0.2 mL PBS。每個(gè)組隔離飼養(yǎng)14 d，每天觀察兩次，記錄臨床癥狀得分(0分表示正常，1分表示輕度沉郁；2分表示嚴(yán)重沉郁；3分表示麻痹，虛脫；4分表示死亡)。收集死亡雞的心臟、肝臟、腎臟放于10%的福爾馬林溶液中。14 d后所有未死亡的雞進(jìn)行安樂死，采集有疑似病變的組織，放于10%的福爾馬林溶液中。按照常規(guī)方法制備組織切片，觀察病理變化。

表1參考毒株的基本信息

Table1Information of the cited sequences

序號(hào)Number名稱CaseID血清型Serotype分離地點(diǎn)IsolatedareaGenBank登錄號(hào)Accessionnumber1CElOFAdV-1比利時(shí)BelgiumAF3399142VR827FAdV-2比利時(shí)BelgiumAF3399153SA55-08FAdV-2南非SouthAfricaHQ117900475FAdV-3北愛爾蘭NorthernIrelandAF5089495PK-01FAdV-4印度IndiaEU9316936SDSXFAdV-4中國山東Shandong,ChinaKT8993257VR-829FAdV-4比利時(shí)BelgiumAF3399178TR22FAdV-5日本JapanAF5089539CR119FAdV-6日本JapanAF50895410YR36FAdV-7日本JapanAF5089551158FAdV-8北愛爾蘭NorthernIrelandAF50895712764FAdV-8b加拿大CanadaJN11237313C-2BFAdV-10美國AmericaKT71788914C2BFAdV-11美國AmericaAF50895915QUFAdV-Ⅱ群中國山東Shandong,ChinaEF09350716EDSVFAdV-Ⅲ群德國GermanyY09598

2 結(jié)果與分析

2.1 Ⅰ群禽腺病毒的檢測(cè)和分離結(jié)果

2.1.1 PCR鑒定結(jié)果

本文對(duì)52份有疑似Ⅰ群禽腺病毒感染的肝臟組織進(jìn)行了PCR檢測(cè)，結(jié)果有20份樣品檢測(cè)為Ⅰ群禽腺病毒特異性核酸陽性，PCR電泳結(jié)果見圖1。

2.1.2 Ⅰ群禽腺病毒的分離結(jié)果

將20份陽性樣本接種CEK細(xì)胞上進(jìn)行病毒分離，結(jié)果分離出16株Ⅰ群禽腺病毒。各分離毒的背景資料見表2。

2.2 Ⅰ群禽腺病毒在細(xì)胞上致病性結(jié)果

Marker， DL2000; 1， 陰性; 2， 陽性; 3～22， PCR陽性結(jié)果Marker， DL2000; 1， Negative; 2， Positive; 3-22， Positive PCR product圖1 引物F1和F2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The PCR product of primer F1 and F2

Ⅰ群禽腺病毒感染CEK細(xì)胞后24 h左右開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)細(xì)胞變圓、聚集、折光性增強(qiáng)(圖2-a)。對(duì)照組細(xì)胞一切正常，只有一些衰老的碎片(圖2-b)。

2.3分離株的核酸序列分析結(jié)果

2.3.1 同源性分析結(jié)果

利用DNAStar軟件Clustalw法，將測(cè)序所得到的hexon基因L1環(huán)基因序列與GenBank上發(fā)表的禽腺病毒不同血清型的參考株進(jìn)行比較，比較的結(jié)果表明：16株分離株按照核酸序列同源性可歸屬為4個(gè)血清型即FAdV-2、FAdV-4、FAdV-8a和FAdV-8b，大部分毒株(13株)屬于血清4型，且與Ⅰ群禽腺病毒血清型4型參考株的最高同源性為97.4%～99.8%；血清2、8a和8b各有1株，即CH/CQBS/1504(8a)，CH/CQBS/1512(8b)和CH/GZXF/1512(2)；16株分離株與Ⅱ群禽腺病毒火雞出血性腸炎病毒(HEV)和Ⅲ群禽腺病毒雞減蛋綜合征病毒(EDSV)同源性比較低，具體結(jié)果見表3。

表2西南部分地區(qū)Ⅰ群禽腺病毒感染病料背景

Table2History of fowl adenovirus infection cases in chickens in southwestern China

毒株名稱CaseID分離日期Isolateddate品種Productiontype分離地點(diǎn)Isolatedarea日齡Age/d臨床表現(xiàn)IBHHPS血清型Serotypes登錄號(hào)AccessionnumberCH/GZXF/15112015-11肉雞Broilerchicken貴州Guizhou46++4MF055635CH/GZXF/15122015-12肉雞Broilerchicken貴州Guizhou51+-2MF055636CH/CQBS/15122015-12肉雞Broilerchicken重慶Chongqing43+-8bMF055637CH/SCDY/15122015-12肉雞Broilerchicken四川Sichuan32++4MF055638CH/CQBS/15042015-04肉雞Broilerchicken重慶Chongqing26+-8aMF055634CH/SCNJ/16012016-01蛋雞Layerchicken四川Sichuan118++4MF055639CH/SCYB/16012016-01蛋雞Layerchicken四川Sichuan135++4MF055640CH/YNSL/16022016-02肉雞Broilerchicken云南Yunnan56++4MF055641CH/SCDY/16042016-04蛋雞Layerchicken四川Sichuan126++4MF055647CH/YNSL/16052016-05肉雞Broilerchicken云南Yunnan30++4MF055648CH/SCYA/16052016-05肉雞Broilerchicken四川Sichuan21++4MF055650CH/SCZJ/16052016-05肉雞Broilerchicken四川Sichuan35++4MF055662CH/SCCD/16052016-05肉雞Broilerchicken四川Sichuan28++4MF055649CH/SCDY/16062016-06肉雞Broilerchicken四川Sichuan37++4MF055634CH/CQBS/16012016-09肉雞Broilerchicken重慶Chongqing21++4MF055654CH/CQBS/16092016-09肉雞Broilerchicken重慶Chongqing28++4MF055655

1IBH = 包涵體肝炎; HPS = 心包積水綜合癥; “+”表示有相應(yīng)的臨床表現(xiàn); “-”表示無相應(yīng)的臨床表現(xiàn)；死亡率(%)=根據(jù)提交的診斷日期記錄死亡率。

IBH = inclusion body hepatitis; HPS = hydropericardium; “+”means having positive clinical sign; “-”means having negative clinical sign; Mortality was recorded based on the date submitted for diagnosis.

圖2 Ⅰ群禽腺病毒(A)和對(duì)照組(B)感染CEK細(xì)胞的致病性結(jié)果Fig.2 Cytopathogenic effect by FAdV in CEK cells(A) and normal CEK cells(B)

2.3.2 核酸序列遺傳進(jìn)化

根據(jù)序列比較結(jié)果繪制遺傳進(jìn)化樹(圖3)。進(jìn)化分析表明，CH/CQBS/1504(8a)與歐洲分離株58在同一支上，CH/CQBS/1512(8b)與加拿大分離株764在同一分支上，且都屬于FAdV-E；CH/GZXF/1512(2)和南非分離株SA55-08及歐洲分離株VR-827在同一分支上屬于FAdV-D；有13株和中國山東分離株SDSX，印度分離株P(guān)K-01以及歐洲分離株VR-829在同一分支上，屬于FAdV-C；所有序列與Ⅱ群禽腺病毒DUADV-1 QU株和Ⅲ群禽腺病毒EDSV不在同一個(gè)大的分支上。

2.3 臨床癥狀和剖檢病變

接種CH/SCDY/1604(4)、CH/GZXF/1512(2)、CH/CQBS/1504(8a)、CH/CQBS/1512(8b) 4個(gè)毒株的雞在2～9 d出現(xiàn)精神沉郁、臥地不起等癥狀，CH/SCDY/1604(4)和 CH/CQBS/1504(8a)在第4天和第7天出現(xiàn)死亡。圖4顯示本次實(shí)驗(yàn)中各組不同的臨床癥狀得分和死亡率。臨床得分圖顯示在第3～7天各組雞的臨床癥狀最嚴(yán)重，且CH/SCDY/1604(4)組臨床癥狀比CH/GZXF/1512(2)、CH/CQBS/1504(8a)、CH/CQBS/1512(8b)組嚴(yán)重。存活率圖顯示CH/SCDY/1604(4)和CH/CQBS/1504(8a)的死亡率為80%和20%，而CH/GZXF/1512(2)、CH/CQBS/1512(8b)和對(duì)照組都沒有死亡。剖檢結(jié)果顯示(圖5)，4組雞都有明顯的肝臟腫大，腎臟腫大、蒼白色，小腸出血，其中CH/SCDY/1604(4)組雞心包還有大量淡黃色的液體，對(duì)照組雞剖檢一切正常。

▲表示本試驗(yàn)分離株的序列，其他序列為GenBank中下載的序列▲ means the sequence from isolates in this research， other reference sequences were retrieved from GenBank圖3 分離株hexon基因L1環(huán)擴(kuò)增片段的遺傳發(fā)育樹Fig.3 Phylogentic tree based on L1 loop sequences of hexon gene

2.4 病理組織學(xué)觀察結(jié)果

(1)心臟。感染分離株CH/SCDY/1604(4)組(圖6-Ⅰ)顯示，心外膜增厚，雞心肌細(xì)胞壞死和無序排列，中度嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，圖6-Ⅳ代表對(duì)照組的雞的心肌細(xì)胞正常，心內(nèi)膜緊貼心肌細(xì)胞。

(2)肝臟。肝臟的病變主要出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變性，炎性細(xì)胞浸潤、淤血、壞死的肝細(xì)胞有散在的分布，同時(shí)可見嗜酸性或堿性包涵體；感染4個(gè)分離株的雞肝臟都出現(xiàn)不同程度的病變，其中CH/SCDY/1604(4)組病變最嚴(yán)重，對(duì)照組的雞肝臟顯示正常。

0分為正常； 1分為輕度抑郁； 2分嚴(yán)重抑郁； 3分癱瘓、虛脫； 4死亡。臨床得分為明日每個(gè)組的平均得分。誤差是標(biāo)準(zhǔn)差(*)表示實(shí)驗(yàn)組的每天臨床得分與對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.05)0， Normal; 1， Mild depression; 2， Severe depressed; 3， Paralysis/prostration; 4， Death. The mean scores per group per day are shown. The error bars indicate standard deviations. Asterisks (*) mark the days in which the clinical scores were significantly different between infected group and control group (P <0.05)圖4 接種 CH/SCDY/1604(4)、CH/GZXF/1512(2)、CH/CQBS/1504 (8a)和CH/CQBS/1512(8b) 4個(gè)毒株臨床得分(A)和存活率(B)Fig.4 Clinical scores (A) and survival rates (B) of chickens after inoculation with CH/SCDY/1604(4)， CH/GZXF/1512(2)， CH/CQBS/1504(8a) and CH/CQBS/1512(8b)

(3)腎臟。腎臟的變化主要是腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重大小不等的空泡，大量的炎性細(xì)胞浸潤，腎細(xì)胞，上皮細(xì)胞壞死呈散在的分布。感染4個(gè)分離株的雞腎臟都出現(xiàn)不同程度的病變，其中CH/SCDY/1604(4)組病變最嚴(yán)重，對(duì)照組雞的腎臟只有一些散在的出血(可能是采取組織不小心劃破血管所致)。

2.5 病理組織學(xué)變化評(píng)分

病理評(píng)分圖(圖7)顯示,感染分離株CH/SCDY/1604株雞肝臟和腎臟的病變最嚴(yán)重，感染CH/CQBS/1504組的雞次之，感染CH/GZXF/1512和CH/CQBS/1512組的雞組織病理學(xué)變化最輕，通過顯著性分析顯示CH/SCDY/1604與CH/CQBS/1504與各組之間都差異顯著(P<0.05)，CH/GZXF/1512和CH/CQBS/1512兩組病理學(xué)變化不顯著(P<0.05)，與其他組組織病理學(xué)變化差異顯著(P<0.05)，所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比都差異都顯著(P<0.05)。

a、d，對(duì)照組；b，心包積液，肝臟嚴(yán)重發(fā)黃腫大；c，肝臟邊緣發(fā)黃、腫大；e，腎臟腫大；f，腎臟腫大變蒼白色a and d， The control group; b， Pericardial effusion， severe yellowing of the liver; c， Yellowing of the liver， swelling; e, Kidney enlargement; f， Kidney enlargement becomes pale圖5 感染FAdV后心臟、肝臟、腎臟的剖檢病變Fig.5 Gross lesions in liver， heart and kindey from the chicken after infected with FAdV

Ⅰ，心外膜增厚，炎性細(xì)胞增多(黑色箭頭部位)；Ⅱ，肝臟脂肪變性(紅色箭頭部位)，淤血(藍(lán)色箭頭部位)、包涵體(黃色箭頭部位)；Ⅱ，腎臟腎細(xì)胞壞死，核溶解(綠色箭頭部位);Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ分別表示正常的心臟、肝臟、腎臟組織細(xì)胞形態(tài)Ⅰ: Epicardial thickening， inflammatory cells increased(black arrow); Ⅱ: Liver steatosis(red arrow)， congestion(blue arrow)， inclusion body(yellow arrow); Ⅲ: Kidney cell necrosis， nuclear dissolution(green arrow); Ⅳ， Ⅴ， Ⅵ: The heart， liver， kidney respectively.圖6 感染FAdV后心臟、肝臟和腎臟組織病理切片(H.E×400)Fig.6 Histopathology in the heart， liver， kidney after infected with FAdV(H.E×400)

0分表示沒有損失，1～2分表示輕微的損失，3～4分表示中等的損傷，5～6表示嚴(yán)重的損傷。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。 星號(hào)(*)標(biāo)記組之間的顯著差異(P<0.05)Lesion score: 0 for no lesions， 1-2 for mild lesions， 3-4 for morderate lesions and 5-6 for severe lesions. Asterisks (*) mark significant differences between groups (P<0.05)圖7 感染FAdV的雞第5天肝臟和腎臟組織病理學(xué)評(píng)分圖(每組5只)Fig.7 Scores of histopathological lesions in liver and kidney tissues of chickens at 5 day after infected with FAdV (n=5 per group)

3 討論

最近幾年，在很多國家報(bào)道由Ⅰ群禽腺病毒引起的心包積液綜合征、包涵體肝炎和肌胃糜爛(目前只在白來航雞發(fā)現(xiàn))的發(fā)生呈上升趨勢(shì)[22, 26-27]。其中一些高致病性毒株給養(yǎng)禽業(yè)帶來了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失[11, 17, 28-29]。自2010年以來，Ⅰ群禽腺病毒的暴發(fā)在中國呈上升趨勢(shì)。2010—2014，劉東[30]從黑、吉、京、魯、蘇、豫、滬、粵9省市收集355份疑似Ⅰ群禽腺病毒感染的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，Ⅰ群禽腺病毒的感染率由30%升至70%，且主要流行的血清型為FAdV-8a/b型和FAdV-4型。李敏等[31]調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，在我國目前流行的禽腺病毒中存在兩種基因型的病毒，F(xiàn)AdV-C型的病毒主要引起禽的心包積液綜合征；而FAdV-E的病原主要引起禽的包涵體肝炎。本研究通過采集西南不同地區(qū)疑似Ⅰ群禽腺病毒感染雞的肝臟，分離出16株Ⅰ群禽腺病毒，通過遺傳進(jìn)化分析16株中1 CH/GZXF/1512株與FAdV-2型，CH/CQBS/1504株與FAdV-8a型以及CH/CQBS/1512株與FAdV-8b型分別具有很高的同源性；其余13株與FAdV-4型具有很高的同源性。本研究發(fā)現(xiàn)目前在西南地區(qū)主要流行的Ⅰ群禽腺病毒是4型。

Ⅰ群禽腺病毒有12個(gè)血清型(FAdV-1～FAdV-8a和FAdV-8b～FAdV-11)不同的血清型的致病性存在很大的差異。目前在全國多個(gè)地區(qū)均有發(fā)生，該病感染1～6周齡任何品種雞，發(fā)病日程短的4～8 d逐漸恢復(fù)，一般7～10 d，也有少數(shù)持續(xù)2～3周；發(fā)病雞群死亡高峰期4～8 d，病程持續(xù)8～15 d，死亡率10%～60%不等[31]。本研究通過觀察雞的臨床癥狀、剖檢病變和組織病理學(xué)變化來確定不同血清型4個(gè)毒株CH/SCDY/1604(4)、CH/GZXF/1512(2)、CH/CQBS/1504(8a)、CH/CQBS/1512(8b)的致病性，結(jié)果顯示Ⅰ群禽腺病毒血清4型毒株CH/SCDY/1604和8a型毒株CH/CQBS/1504分別引起80%和20%的死亡率，而Ⅰ群禽腺病毒血清2型毒株CH/GZXF/1512和8b型毒株CH/CQBS/1512沒有死亡。臨床和組織病理學(xué)得分顯示Ⅰ群禽腺病毒血清4型毒株CH/SCDY/1604(4)的致病性高于毒株CH/GZXF/1512(2)、CH/CQBS/1504(8a)、CH/CQBS/1512(8b)。Ⅰ群禽腺病毒不同的血清型對(duì)雞的敏感程度的不同，引起的發(fā)病和死亡率也不相同。本研究結(jié)果與先前幾個(gè)研究一致，血清4型(FAdV-C)部分毒株能夠引起的很高的死亡率[5, 9, 32]。

對(duì)于禽腺病毒感染的預(yù)防，消滅傳染源是重中之重。腺病毒既可水平傳播，也可垂直傳播，控制腺病毒要從種雞開始。目前我國種雞場(chǎng)還未開展禽腺病毒的凈化工作，凈化技術(shù)和方案也不成熟，需要加強(qiáng)這方面的研究。腺病毒是無囊膜的病毒，具有較強(qiáng)的抵抗力，通過消毒的方法可以殺滅密閉環(huán)境中的腺病毒。傳染性法氏囊病病毒(IBDV)和雞傳染性貧血病毒(CIAV)等一些能引起免疫抑制病的病毒都能夠強(qiáng)化禽腺病毒的致病性[10, 33-34]，生產(chǎn)中也要做好這兩種病原的控制。在禽腺病毒感染流行的地區(qū)，除了以上措施外，疫苗的使用也非常有效。在一些國家，滅活的油乳疫苗對(duì)IBH和HPS有很好的保護(hù)效果[35-36]。對(duì)于腺病毒感染的治療，高免卵黃抗體具有較好的效果。我國市場(chǎng)上高免卵黃抗體的質(zhì)量參差不齊，有的攜帶有垂直傳播性病原，高免卵黃抗體最好不要用于發(fā)病種雞場(chǎng)。

本研究結(jié)果表明在中國西南地區(qū)暴發(fā)的Ⅰ群腺病毒感染由FAdV-4、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b引起，其中主要是FAdV-4。今后應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)Ⅰ群腺病毒感染的分子流行病學(xué)調(diào)查，掌握流行的Ⅰ群腺病毒的血清型、致病性和遺傳特點(diǎn)。同時(shí)應(yīng)該加強(qiáng)Ⅰ群腺病毒疫苗的研發(fā)，制定有效的生物安全措施，為生產(chǎn)上控制甚至凈化該病打下基礎(chǔ)。

[1] HARRACH B, BENK? M, BOTH G W, et al. FamilyAdenoviridae[M]//KING A M Q, ADAMS M J, CARSTENS E B,et al. Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses. Ninth report of the international committee on taxonomy of viruses. New York: Elsevier; 2011: 125-141.

[2] MCFERRAN J B, SMYTH J A. Avian adenoviruses[J].RevueScientifiqueEtTechnique, 2000,19(2):589-601.

[3] SAIF Y M, 蘇敬良, 高福, 等. 禽病學(xué)[M]. 11版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[4] HESS M. Detection and differentiation of avian adenoviruses: a review[J].AvianPathology, 2000, 29(3):195-206.

[5] ZHAO J, ZHONG Q, ZHAO Y, et al. Pathogenicity and complete genome characterization of fowl adenoviruses isolated from chickens associated with inclusion body hepatitis and hydropericardium syndrome in China[J].PLoSOne, 2015, 10(7):e0133073.

[6] 徐輝, LOHR J E. 檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合癥抗體的ELISA法在田間應(yīng)用的可行性研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1996,8(4):232-235.

XU H, LOHR J E. On study of application feasibility of the enzyme-linked immunosorbent assay for the detecting of antibody to egg drop syndrome virus in the field[J].ActaAgriculturaeZhejiangensis, 1996,8(4):232-235.(in Chinese with English abstract)

[7] 何永強(qiáng), 杜青云, 盛祖恬, 等. 一種非EDSV引起的鴨傳染性減蛋癥[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2001, 13(3):125-126.

HE Y Q, DU Q Y, SHENG Z T, et al. A virus different from EDSV cause duck infectious egg drop disease[J].ActaAgriculturaeZhejiangensis, 2001, 13(3):125-126.(in Chinese with English abstract)

[8] GJEVRE A G, KALDHUSDAL M, ERIKSEN G S. Gizzard erosion and ulceration syndrome in chickens and turkeys: a review of causal or predisposing factors[J].AvianPathology, 2013, 42(4):297-303.

[9] CHEN H, DOU Y, ZHENG X, et al. Hydropericardium hepatitis syndrome emerged in cherry valley ducks in China[J].TransboundaryandEmergingDiseases, 2017,64(4):1262-1267.

[10] CHOI K S, KYE S J, KIM J Y, et al. Epidemiological investigation of outbreaks of fowl adenovirus infection in commercial chickens in Korea[J].PoultryScience, 2012, 91(10):2502-2506.

[11] YE J, LIANG G, ZHANG J, et al. Outbreaks of serotype 4 fowl adenovirus with novel genotype, China[J].EmergingMicrobes&Infection, 2016 (5):e50.

[12] MATOS M, GRAFL B, LIEBHART D, et al. Selected clinical chemistry analytes correlate with the pathogenesis of inclusion body hepatitis (IBH) experimentally induced by fowl aviadenoviruses (FAdVs)[J].AvianPathology, 2016,45(5):520-529.

[13] JOUBERT H W, AITCHISON H, MAARTENS L H, et al. Molecular differentiation and pathogenicity of Aviadenoviruses isolated during an outbreak of inclusion body hepatitis in South Africa[J].JournalofSouthAfricanVeterinaryAssociation, 2014, 85(1):1058.

[14] OKUDA Y, ONO M, SHIBATA I, et al. Pathogenicity of serotype 8 fowl adenovirus isolated from gizzard erosions of slaughtered broiler chickens[J].JournalofVeterinaryMedicalScience, 2004, 66(12):1561-1566.

[15] MASE M, NAKAMURA K. Phylogenetic analysis of fowl adenoviruses isolated from chickens with gizzard erosion in Japan[J].JournalofVeterinaryMedicalScience, 2014, 76(11):1535-1538.

[16] MENDELSON C, NOTHELFER H B, MONREAL G. Identification and characterization of an avian adenovirus isolated from a ′spiking mortality syndrome’ field outbreak in broilers on the Delmarva Peninsula, USA[J].AvianPathology, 1995, 24(4):693-706.

[17] DAHIYA S, SRIVASTAVA R N, HESS M, et al. Fowl adenovirus serotype 4 associated with outbreaks of infectious hydropericardium in Haryana, India[J].AvianDiseases, 2002, 46(1):230-233.

[18] JOUBERT H W, AITCHISON H, MAARTENS L H, et al. Molecular differentiation and pathogenicity of Aviadenoviruses isolated during an outbreak of inclusion body hepatitis in South Africa[J].JournaloftheSouthAfricanVeterinaryAssociation, 2014, 85(1):1058.

[19] GOMIS S, GOODHOPE R, OJKIC D, et al. Inclusion body hepatitis as a primary disease in broilers in Saskatchewan, Canada[J].AvianDiseases, 2006, 50(4):550-555.

[20] SAIFUDDIN M, WILKS C R. Reproduction of inclusion body hepatitis in conventionally raised chickens inoculated with a New Zealand isolate of avian adenovirus[J].NewZealandVeterinaryJournal, 1990, 38(2):62-65.

[22] NICZYPORUK J S. Phylogenetic and geographic analysis of fowl adenovirus field strains isolated from poultry in Poland[J].ArchivesofVirology, 2016, 161(1):33-42.

[23] MASE M, NAKAMURA K, MINAMI F. Fowl adenoviruses isolated from chickens with inclusion body hepatitis in Japan, 2009-2010[J].JournalofVeterinaryMedicalScience, 2012, 74(8):1087-1089.

[24] SCHACHNER A, MAREK A, GRAFL B, et al. Detailed molecular analyses of the hexon loop-1 and fibers of fowl aviadenoviruses reveal new insights into the antigenic relationship and confirm that specific genotypes are involved in field outbreaks of inclusion body hepatitis[J].VeterinaryMicrobiology, 2016, 186: 13-20.

[25] 國紀(jì)壘, 刁有祥. Ⅰ群禽腺病毒山東株的分離鑒定及hexon基因的克隆與分析[C]//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2011學(xué)術(shù)年會(huì), 成都, 2011.

[26] METTIFOGO E, NUEZ L F N, SANTANDER PARRA S H, et al. Fowl adenovirus Group I as a causal agent of inclusion body hepatitis/hydropericardium syndrome (IBH/HPS) outbreak in brazilian broiler flocks[J].PesquisaVeterinriaBrasileira, 2014, 34(8):733-737.

[27] LIM T H, KIM B Y, KIM M S, et al. Outbreak of gizzard erosion associated with fowl adenovirus infection in Korea[J].PoultryScience, 2012, 91(5):1113-1117.

[28] STEER P A, SANDY J R, O’ROURKE D, et al. Chronological analysis of gross and histological lesions induced by field strains of fowl adenovirus serotypes 1, 8b and 11 in one-day-old chickens[J].AvianPathology, 2015, 44 (2):106-113.

[29] OAKS J L, SCHRENZEL M, RIDEOUT B, et al. Isolation and epidemiology of falcon adenovirus[J].JournalofClinicalMicrobiology, 2005, 43(7):3414-3420.

[30] 劉東, 劉紅祥, 于靜, 等. Ⅰ亞群腺病毒在我國雞群的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國家禽, 2015, 37(15):70-73.

LIU D, LIU H X, YU J, et al. Epidemiological investigation of avian influenza adenovirus subgroup Ⅰ in China[J].ChinaPoultry, 2015, 37(15):70-73. (in Chinese)

[31] 李敏, 馬玉峰, 楊振. Ⅰ型禽腺病毒在我國雞群中的流行情況和防控措施[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊, 2017 (1):30-32.

LI M, MA Y F, YANG Z. Epidemic situation and control measures of avian influenza type A virus in chicken flocks in China[J].VeterinaryOrientation, 2017 (1):30-32. (in Chinese)

[32] SCHONEWILLE E, SINGH A, G?BEL T W, et al. Fowl adenovirus (FAdV) serotype 4 causes depletion of B and T cells in lymphoid organs in specific pathogen-free chickens following experimental infection[J].VeterinaryImmunology&Immunopathology, 2008, 121(1/2):130-139.

[33] KAURI S, DEKA D, DWIVEDI P, et al. Studies on the association of hydropericardium syndrome with infectious bursal disease under field conditions[J].IndianJournalofPoultryScience, 2011, 46(2):220-225.

[34] LEE J Y, KWON M S, CHU K S, et al. Outbreak of inclusion body hepatitis (IBH) and infectious bursal disease (IBD) in broilers, case[J].KoreanJournalofVeterinaryService, 2007, 30(3):321-327.

[35] SHAH M S, ASHRAF A, RAHMAN M, et al. A subunit vaccine against hydropericardium syndrome using adenovirus penton capsid protein[J].Vaccine, 2012, 30(50):7153-7156.

[36] KIM M S, LIM T H, LEE D H, et al. An inactivated oil-emulsion fowl Adenovirus serotype 4 vaccine provides broad cross-protection against various serotypes of fowl Adenovirus[J].Vaccine, 2014, 32(28):3564-3568.

(責(zé)任編輯張 韻)

PathogenicityandepidemiologicalinvestigationofoutbreaksoffowladenovirussubpopulationⅠinfectioninchickensinpartsofsouthwesternChina

YAO Kechang， LIU Yueyue， YOU Guojin， LI Shuyun， XIA Jing， HE Xiao， LI Wenwen， DU Lijing， HAN Xinfeng， HUANG Yong*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

In 2015-2016， suspected fowl adenoviruses infections were observed in many chicken farms in southwestern China. The liver samples were collected from diseased chickens and inoculated into chicken embryo kidney cells (CEK) cultures for virus isolation， and 16 fowl adenoviruses (FAdV) strains were isolated. After PCR amplificating， sequencing and comparing the conserved sequences located in the pedestal regions adjacent to the L1 loop of thehexongenes of FAdV， all of the 16 stains could be grouped into four serotypes including FAdV-4(13/16)， FAdV-8a (1/16)， FAdV-8 (1/16) and FAdV-2 (1/16). Then， the delegate strains from those four different serotypes were selected to infect chickens to observe its pathogenicity to chickens， the results showed that the mortality of chickens infected with CH/SCDY/1604(FAdV-4) and CH/CQBS/1504 (FAdV-8a) was 80% and 20%， respectively， while no death of chicken was observed in chickens infected by CH/GZXF/1512(FAdV-2)and CH/CQBS/1512(FAdV-8b). It was concluded that the FAdV-4 was the predominant serotype and was highly pathogenic to chickens， and hydropericardium syndrome (HPS) was the main clinical manifestation. This results could provide reference for the epidemiological investigation and prevention of FAdVⅠinfection in southwestern China.

fowl adenovirus; hydropericardium syndrome; epidemiological investigation; pathogenicity

姚克昌，劉月月，游國進(jìn)，等. 西南部分地區(qū)Ⅰ群禽腺病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查及致病性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(11)： 1809-1818.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.11.06

2017-05-12

姚克昌(1989—)，男，河南商丘人，碩士研究生，主要從事家禽傳染病的研究。E-mail: qingbuykc@163.com

*通信作者，黃勇，E-mail：hyong601@163.com

S852.65+7

A

1004-1524(2017)11-1809-10