熊尚凌 邢峻梁 范東洋 袁洋洋 朱四東 林旦璆 楊季芳 陳吉?jiǎng)?/p>

(浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 寧波 315100)

鋸緣青蟹(Scylla serrata)呼腸孤病毒5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白互作分析*

熊尚凌 邢峻梁 范東洋 袁洋洋 朱四東 林旦璆 楊季芳 陳吉?jiǎng)偄?/p>

(浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 寧波 315100)

采用酵母雙雜交系統(tǒng),對(duì)青蟹呼腸孤病毒(Scylla serratareovirus)5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP3,VP6,VP9,VP11,VP12)間的雙向互作進(jìn)行了分析。將 5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)應(yīng)的 ORF分別亞克隆至誘餌載體pGBKT7和獵物載體pGADT7,成功構(gòu)建了10個(gè)酵母雙雜交重組載體。將重組誘餌載體或重組捕獲載體轉(zhuǎn)化至酵母菌Y2H Gold中進(jìn)行自激活檢測,結(jié)果顯示5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白均不能激活酵母菌報(bào)告基因HIS3的表達(dá),表明5個(gè)病毒蛋白均不具有自激活活性。通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),從5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白25個(gè)可能性互作對(duì)中,共篩選出2個(gè)雙向互作對(duì)(VP11&VP6,VP11&VP12)和3個(gè)自身互作對(duì)(VP3&VP3,VP11&VP11,VP12&VP12)。本研究是有關(guān)SsRV結(jié)構(gòu)蛋白互作的首次報(bào)道。

鋸緣青蟹;呼腸孤病毒;酵母雙雜交;互作

青蟹呼腸孤病毒(mud crab reovirus,MCRV)首次報(bào)道于廣東青蟹養(yǎng)殖區(qū)(Wenget al,2007),其后在浙江青蟹養(yǎng)殖區(qū)發(fā)現(xiàn)類似病毒,并將其命名為鋸緣青蟹呼腸孤病毒(Scylla serratareovirus,SsRV)(陳吉?jiǎng)偟?2008;Chenet al,2011)。根據(jù)病毒粒子形態(tài)和基因組序列同源性,判定MCRV和SsRV為不同地區(qū)分離株(Chenet al,2012;Denget al,2012)。SsRV基因組為12節(jié)段雙鏈(ds)RNA(S1—S12),可能編碼13種病毒蛋白(p160,p100,p96,p50,p25,p61,p67,p46,p32,p40,p35,p23 和p29)(Chenet al,2012)。SDS-PAGE結(jié)合Modi TOF/TOF質(zhì)譜分析表明,p160,p96,p67,p40,p29和p23六個(gè)蛋白為SsRV病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白(Yuanet al,2016)。在上述13種病毒蛋白中,只有p160和p40的功能較為清楚。p160蛋白為病毒的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp),p35蛋白具有病毒孔蛋白樣功能,在病毒復(fù)制的后期發(fā)揮重要作用(Chenet al,2012;Zhanget al,2015;Yuanet al,2017)。

MCRV的三維結(jié)構(gòu)已被初步解析(Huanget al,2012)。該病毒衣殼由T=13外層衣殼和T=2內(nèi)層衣殼兩層衣殼組成,其結(jié)構(gòu)特征與RDV、SA1114F和BTV相似。在MCRV完整病毒顆粒的三維結(jié)構(gòu)中,外衣殼蛋白包含表面小突起的同源三聚體蛋白260個(gè)、衣殼表面六鄰體中央蛋白120個(gè);內(nèi)層衣殼具有一種蛋白的兩種構(gòu)象體A和B各60個(gè),以及5次軸頂點(diǎn)下方的可能由 RNA聚合酶和其它蛋白形成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。然而目前僅根據(jù)上述研究結(jié)果還無法確定青蟹呼腸孤病毒衣殼蛋白的具體組成,更不清楚這些病毒蛋白間的相互作用關(guān)系及其對(duì)病毒結(jié)構(gòu)和生物學(xué)發(fā)生功能的影響。呼腸孤病毒衣殼蛋白之間通常存在某種相互作用,以維系病毒蛋白的層次結(jié)構(gòu)并維持病毒形態(tài)的穩(wěn)定性(Miyazakiet al,2005)?；诖?本研究通過酵母雙雜交技術(shù)對(duì)SsRV 5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白間的相互作用進(jìn)行分析,研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示SsRV病毒結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及主要試劑

大腸桿菌菌株E.coliDH5α購自北京全式金生物有限公司;酵母雙雜交試劑盒購自Clontech公司;攜帶SsRV S3,S6,S9,S11或S12的重組質(zhì)粒PMD-S3、PMD-S6、PMD-S9、PMD-S11和PMD-S12由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存;鮭魚精 DNA購自索萊寶生物科技有限公司;Minimal SD Base、SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu-Trp、SD/-Leu-Trp-Ade-His、Aureobasidin A、X-α-gal、PCR 相關(guān)試劑、EcoR I、Xhol I、SalI、BamH I均購自TaKaRa公司;DNA純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒SanPrep購自上海生物工程有限公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 獵物載體及誘餌載體的構(gòu)建及鑒定 由于SsRV和MCRV為同一病毒不同地區(qū)分離株,為了達(dá)到SsRV和MCRV病毒蛋白描述上的統(tǒng)一,本文采用MCRV 病毒蛋白命名方式(VPx,x對(duì)應(yīng)基因組中節(jié)段序號(hào))對(duì)SsRV蛋白進(jìn)行命名。根據(jù)SsRV的VP3(p96),VP6(p67),VP9(p40),VP11(p23),VP12(p29)蛋白對(duì)應(yīng)的基因序列并結(jié)合獵物載體 pGADT7和誘餌載體pGBKT7多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)6對(duì)特異引物(表1),分別以重組載體 PMD-S3、PMD-S6、PMD-S9、PMD-S11和PMD-S12為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳回收純化后,經(jīng)雙酶切后,分別克隆于獵物載體pGADT7和誘餌載體 pGBDT7,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,并利用氨芐青霉素或卡那霉素抗性篩選陽性克隆,挑選陽性克隆小量抽提質(zhì)粒,利用PCR和雙酶切進(jìn)行鑒定后,送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序。

表1 擴(kuò)增SsRV 5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白各節(jié)段引物序列Tab.1 Oligonucleotides used for PCR amplification of SsRV five structural proteins

1.2.2 獵物蛋白及誘餌蛋白自激活檢測 將含有目的基因的重組載體pGBKT7-VPx,簡稱BD-VPx (x代表3,6,9,11,12)分別與pGADT7共轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞Y2H Gold,以及將pGADT7-VPx,簡稱AD-VPx (3,6,9,11,12)分別與pGBKT7共轉(zhuǎn)Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞,進(jìn)行目的蛋白的自激活檢測。實(shí)驗(yàn)設(shè) pGBKT7-53&pGADT7-T共轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞為陽性對(duì)照組,設(shè)pGBKT7-lam&pGADT7-T共轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,以及pGBKT7&pGADT7共轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞為陰性對(duì)照組。吸取適量的共轉(zhuǎn)化酵母涂布于SD/-Trp-Leu (DDO)平板,30℃恒溫倒置培養(yǎng)3—5d,待菌落長出后,挑取單菌落同時(shí)接種到二缺板(SD/-Trp-Leu + X-α-Gal +Aureobasidin A,DDO/X/A)和四缺板(SD/-Trp-Leu-Ade-His + X-α-Gal + Aureobasidin A,QDO/X/A), 30℃培養(yǎng) 3—5d,觀菌落生長及菌落顏色變化情況。若轉(zhuǎn)化酵母菌在DDO/X/A和QDO/X/A平板上均能生長,且菌落顏色為藍(lán)色,則說明目的蛋白具有自激活活性;若轉(zhuǎn)化酵母菌在DDO/X/A板上生長且菌落不變藍(lán),而在QDO/X/A 板上不能生長,則說明該蛋白不具有自激活能力,可用于后續(xù)蛋白互作實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 SsRV 5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白之間的互作 對(duì)5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白25種互作對(duì)(雙向蛋白間互作對(duì)20個(gè),自身互作對(duì) 5個(gè))兩兩共轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)細(xì)胞,通過觀察轉(zhuǎn)化酵母菌在DDO、DDO/X/A和QDO/X/A平板上的生長及菌落顏色變化情況,分析5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白之間以及蛋白自身的互作情況。每組互作對(duì)均設(shè)pGBKT7-53 &pGADT7-T共轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞為陽性對(duì)照組,設(shè)pGBKT7-lam &pGADT7-T共轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,以及pGBKT7 &pGADT7共轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞為陰性對(duì)照組。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 陽性克隆菌株P(guān)CR檢測結(jié)果

重組載體目的基因VPx的PCR及雙酶切鑒定如圖1所示。從圖中可以看出,擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物中均出現(xiàn)與5個(gè)目的片段預(yù)期分子量相符的條帶,說明目的基因被成功引入獵物載體 pGADT7和誘餌載體pGBDT7。

圖1 重組獵物載體及誘餌載體雙酶切及PCR鑒定Fig.1 Digestion and PCR identification of recombined prey vectors and bait vectors

2.2 獵物蛋白及誘餌蛋白毒性檢測

含重組載體 AD-VP3、AD-VP6、AD-VP9、AD-VP11或AD-VP12的陽性克隆,以及含BD-VP3、BD-VP6、BD-VP9、BD-VP11或BD-VP12的陽性克隆在培養(yǎng)基中,經(jīng)30℃振蕩培養(yǎng) 24 h后,測得菌液OD600均大于0.8,表明獵物蛋白及誘餌蛋白對(duì)酵母細(xì)胞均無毒性作用,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 結(jié)構(gòu)蛋白自激活檢測

將重組載體BD-VPx和載體pGADT7,以及將載體pGBKT7和重組載體AD-VPx兩兩共轉(zhuǎn)酵母菌,通過判斷His3、Ade2、MEL1報(bào)告基因是否表達(dá)來判斷目的蛋白是否具有自激活活性。如果目的蛋白具有自激活活性,將會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化酵母菌中報(bào)告基因 His3和Ade2的表達(dá),酵母菌因此能夠在缺失His和Ade的QDO/X/A培養(yǎng)基上生長,同時(shí)由于蛋白自激活導(dǎo)致MEL1基因的表達(dá)會(huì)促使菌落表面的X-α-Gal變?yōu)樗{(lán)色。反之,如果目的蛋白不具備自激活活性,DDO/X/A平板上的菌落不會(huì)變藍(lán),亦不能在QDO/X/A培養(yǎng)基上生長。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3,圖3),所有的實(shí)驗(yàn)組酵母菌均能在DDO和DDO/X/A平板上生長,且在DDO/X/A 平板上菌落顏色不變藍(lán),說明重組捕獲載體和重組誘餌載體均成功轉(zhuǎn)入酵母菌,同時(shí)也初步表明5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白無論在誘餌載體,還是在獵物載體中均無自激活活性。更加嚴(yán)格的QDO/X/A平板篩選結(jié)果表明,酵母菌均不能在QDO/X/A板上生長,進(jìn)一步說明目的蛋白沒有自激活活性。陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組與預(yù)期結(jié)果相符,即陽性組均能夠在DDO、DDO/X/A和QDO/X/A平板上生長,且菌落在DDO/X/A和QDO/X/A平板上均呈現(xiàn)藍(lán)色,而陰性對(duì)照組能夠在DDO和DDO/X/A平板上生長,但不能在QDO/X/A 平上生長,且菌落在DDO/X/A平板上不變藍(lán)。

2.4 結(jié)構(gòu)蛋白自身及之間互作分析

將5種蛋白25對(duì)互作對(duì)分別兩兩轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母 Y2H Gold,并分別涂布于 DDO、DDO/X/A和QDO/X/A平板,在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3—5d,觀察記錄轉(zhuǎn)化酵母菌生長及顏色變化。如果轉(zhuǎn)化酵母菌能在DDO和DDO/X/A平板上生長,而不能在QDO/X/A板上生長,且菌落在DDO/X/A平板上不變藍(lán),則說明目的蛋白之間或自身不存在相互作用。反之,如果轉(zhuǎn)化菌能在DDO、DDO/X/A和QDO/X/A平板上生長,且菌落在DDO/X/A和QDO/X/A平板上均呈現(xiàn)藍(lán)色,則說明蛋白存在相互作用。如圖2所示,AD-VP3&BD-VP3、AD-VP11&BD-VP11或 AD-VP12&BD-VP12兩兩共轉(zhuǎn)的酵母菌均能在DDO、DDO/X/A和QDO/X/A平板上生長,且菌落在DDO/X/A和QDO/X/A平板上均呈現(xiàn)藍(lán)色,說明VP3、VP11和VP12存在自身互作。AD-VP11&BD-VP6、AD-VP11&BD-VP12、BD-VP11&AD-VP6或 BD-VP11&AD-VP12兩兩共轉(zhuǎn)的酵母菌均能在DDO、DDO/X/A和QDO/X/A平板上生長,且菌落在DDO/X/A和QDO/X/A平板上均呈現(xiàn)藍(lán)色,說明VP11&VP6、VP11&VP12存在雙向互作(圖3)。此外,陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組與預(yù)期結(jié)果相符(圖2,圖3),說明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

圖2 酵母雙雜交分析結(jié)構(gòu)蛋白自身互作Fig.2 Y2H screening of self-association interaction in SsRV structural proteins

圖3 酵母雙雜交分析結(jié)構(gòu)蛋白兩兩互作Fig.3 Y2H screening of binary interaction in SsRV structural proteins

3 討論

SsRV全病毒SDS-PAGE圖譜顯示,VP3、VP6、VP12蛋白條帶最濃,其次為VP9和VP11蛋白,而VP1條帶最弱(Chenet al,2012;Yuanet al,2016)。同源分析表明,優(yōu)勢蛋白VP6與LNV病毒外衣殼蛋白VP4蛋白的同源性為25%,與 MRV-2病毒吸附蛋白sigma1的同源性為25%。糖基化位點(diǎn)預(yù)測顯示,VP6蛋白含有呼腸孤病毒外衣殼蛋白普遍所具有的糖基化位點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道,外衣殼蛋白上的糖基化位點(diǎn)有助于病毒與細(xì)胞表面的吸附與侵入(Shawet al,1996)?；谏鲜龇治?推斷該蛋白為病毒的外衣殼蛋白(Chenet al,2012)。酵母雙雜交結(jié)果顯示VP6蛋白能夠與VP11蛋白互作。VP11蛋白除了能與VP6蛋白互作外,還能與VP12蛋白互作。免疫電鏡結(jié)果表明,VP12蛋白定位于病毒粒子表面,是病毒的外衣殼蛋白(Xuet al,2015)。對(duì)于 SsRV結(jié)構(gòu)蛋白 VP9,SVPProt蛋白功能預(yù)測將該蛋白歸類于分子內(nèi)轉(zhuǎn)移酶家族,該家族成員具有激酶活性,也具有二磷酸和核苷酸的轉(zhuǎn)移活性。此外,VP9蛋白部分序列RNA結(jié)合蛋白及甲基化轉(zhuǎn)移酶存在同源性,以此推斷該蛋白可能為病毒的甲基轉(zhuǎn)移酶,參與了SsRV mRNA的5'端加帽(Chenet al,2012;張昭等,2014)。然而,MCRV全病毒的 SDS-PAGE電泳圖譜中未發(fā)現(xiàn) VP9蛋白(Denget al,2012),究其原因可能是VP9作為病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的組成成分,由于其在MCRV病毒粒子中的含量較低而被遺漏。酵母雙雜交未發(fā)現(xiàn) VP9存在自身互作,也未發(fā)現(xiàn)該蛋白與其它結(jié)構(gòu)蛋白存在相互作用。對(duì)于SsRV VP3蛋白,SVMProt蛋白功能預(yù)測將該蛋白歸類于催化形成碳-碳鍵的酶家族。當(dāng)對(duì)其它呼腸孤病毒蛋白進(jìn)行 SVMProt預(yù)測時(shí),發(fā)現(xiàn)唯有BTV內(nèi)衣殼蛋白VP3屬于催化形成碳-碳鍵的酶家族,因此我們推測VP3蛋白可能是SsRV內(nèi)衣殼蛋白組成成分(Chenet al,2012)。酵母雙雜交結(jié)果顯示,VP3蛋白存在自身互作,這為內(nèi)衣殼蛋白的多聚體的形成提供了可能。綜合上述分析,筆者推測:VP6、VP11和VP12均為SsRV的外衣殼組成成分,而VP3和VP9分別為SsRV內(nèi)衣殼和病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的組成成分。

呼腸孤病毒衣殼蛋白通過自身互作形成多聚體(Liuet al,2007)。然而,酵母雙雜交結(jié)果表明,作為潛在外衣殼蛋白的 VP6并不存在自身互作。病毒外衣殼蛋白與內(nèi)衣殼蛋白間往往通過相互作用來維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,然而酵母雙雜交并未檢測到潛在內(nèi)衣殼蛋白 VP3與外衣殼蛋白之間的互作。筆者認(rèn)為導(dǎo)致上述結(jié)果的可能原因是由于酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性。在酵母細(xì)胞中,通過驗(yàn)證報(bào)告基因的表達(dá)情況能夠精確驗(yàn)證蛋白之間微弱的相互作用關(guān)系,且其互作是在活細(xì)胞中進(jìn)行能夠在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況,此外目的基因在酵母細(xì)胞中的產(chǎn)物積累效應(yīng),能夠顯著提高檢測的靈敏性,對(duì)于微弱的或暫時(shí)性的相互作用也能夠呈現(xiàn)出表觀的效果(Rajagopala,2015)。雖然該技術(shù)在蛋白互作研究方面具有上述諸多優(yōu)點(diǎn),但其仍具有一定的局限性,首先是誘餌蛋白與獵物蛋白的相互作用發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi),對(duì)于一些不能入核的蛋白無法檢測,其次是酵母中表達(dá)的蛋白質(zhì)只能進(jìn)行有限的翻譯后修飾,對(duì)于一些需要多種翻譯后修飾的蛋白質(zhì)作用有限(Rajagopala,2015)。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)還需要通過 GST-pull down,Far-western和雙分子熒光互補(bǔ)等其他蛋白互作技術(shù),對(duì)SsRV結(jié)構(gòu)蛋白互作進(jìn)一步分析。

4 結(jié)論

本研究采用Clontech公司的Matchmaker系統(tǒng)對(duì)SsRV 5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的互作進(jìn)行了分析。利用Matchmaker系統(tǒng)攜帶的三個(gè)啟動(dòng)子,四個(gè)報(bào)告基因(His3,Ade2,MEL1和AUR1-C2),以及顯色反應(yīng)的篩選,有效地減少了假陽性的發(fā)生。另外,通過兩個(gè)方向的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了蛋白之間的相互作用,結(jié)果真實(shí)可靠。VP3,VP6,VP9,VP11和VP12五個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自身及之間的相互作用,與維系SsRV病毒形態(tài)發(fā)生、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有密切關(guān)系。研究結(jié)果為進(jìn)一步探討該病毒對(duì)宿主的感染和致病機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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MAPPING INTERACTIONS OFSCYLLA SERRATAREOVIRUS IN FIVE STRUCTURAL PROTEINS

XIONG Shang-Ling, XING Jun-Liang, FAN Dong-Yang, YUAN Yang-Yang, ZHU Si-Dong,LIN Dan-Qiu, YANG Ji-Fang, CHEN Ji-Gang
(College of Biological and Environmental Sciences,Zhejiang Wanli University,Ningbo315100,China)

Each pair-wise combination among five structural proteins ofScylla serratareovirus (SsRV)was analyzed systematically for possible interactions.Potential binary protein interactions among individual structural proteins of SsRV were screened by yeast two-hybrid (Y2H).All the five structural genes (VP3,VP6,VP9,VP11 and VP12)were tested pair-wise against each other in duplicate.None of the proteins was found to autoactivate the HIS3 reporter gene when expressed in the yeast.Of 25 combinations among the five VPs that accounted for two binary and three self associations were identified to be stable and functional within the yeast.The two binary interactions comprised VP11&VP6 and VP11&VP12,while the self association comprised VP3&VP3,VP11&VP11,and VP12&VP12.None of these interactions have been documented previously for SsRV.

Scylla serrata;reovirus;yeast two-hybrid;interaction

S945.4

10.11693/hyhz20170300070

* 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目,30800856號(hào);寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目,2016A610229號(hào);寧波市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),2015C110018號(hào)。熊尚凌,講師,E-mail:hustxiong@163.com

① 通訊作者:陳吉?jiǎng)?教授,碩士生導(dǎo)師,E-mail:genomic@163.com

2017-03-24,收修改稿日期:2017-06-03