宋藝君，楊史軍，王湘，張東星，李京濤，蔡大勇，王玥琦

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

丹皮酚在肝癌前病變模型大鼠體內(nèi)的組織分布研究△

宋藝君1*，楊史軍3，王湘2，張東星2，李京濤1，蔡大勇3，王玥琦2

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的建立用超高效液相色譜(UPLC)測(cè)定肝癌前病變模型大鼠組織中丹皮酚的分析方法，研究丹皮酚在大鼠體內(nèi)的組織分布特征。方法采用UPLC測(cè)定大鼠組織中丹皮酚的濃度。結(jié)果丹皮酚在對(duì)照組大鼠各組織中的分布順序依次為腎>胃>小腸>腦>肝>脾>心>肺，在模型組大鼠各組織中的分布順序依次為肝>腎>脾>腸>胃>心>腦>肺，且其在模型組各組織的AUCall均大于在對(duì)照組各組織的AUCall。結(jié)論相對(duì)于對(duì)照組，丹皮酚在模型動(dòng)物組織內(nèi)含量增高。

丹皮酚；肝癌前病變；組織分布

丹皮酚是毛茛科植物牡丹的根皮、蘿摩科植物徐長(zhǎng)卿的干燥根和根莖的主要有效成分[1]，又是毛莨科植物芍藥的根的有效成分。研究表明丹皮酚具有抗腫瘤、抗菌、增強(qiáng)免疫力、降壓、促進(jìn)微循環(huán)等藥理作用[2]。

肝癌前病變是指在慢性肝病中出現(xiàn)的肝細(xì)胞不典型增生、腺瘤樣增生、肝細(xì)胞再生結(jié)節(jié)、肝細(xì)胞小管狀化生和卵圓細(xì)胞增生，其發(fā)展為肝癌的幾率高，尤其是肝硬化病灶中出現(xiàn)的異型增生病灶或結(jié)節(jié)、異型增生的細(xì)胞[3]。肝癌前病變是肝細(xì)胞癌變進(jìn)展中啟動(dòng)、促進(jìn)和演變過程的中間階段，它是阻斷癌變的理想靶點(diǎn)。因而阻止或延緩肝癌前病變的發(fā)生發(fā)展，對(duì)于預(yù)防肝臟癌癥的發(fā)生，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本文在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上[4]，建立肝癌前病變大鼠模型，研究丹皮酚在肝癌前病變模型大鼠體內(nèi)的組織分布規(guī)律，進(jìn)一步探索丹皮酚在模型大鼠體內(nèi)的靶器官、主要消除途徑等，為其臨床用藥提供指導(dǎo)。

1 材料與儀器

1.1動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(220±20)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2008-0013。

1.2 藥物與試劑

丹皮酚原料藥(廣西億康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：101021)；丹皮酚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：0708-9704)；二-乙基亞硝胺(DEN)(Sigma公司，批號(hào)：1000928405)；甲醇(色譜級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司)；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

Acquity超高效液相色譜儀、PDA 檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；AL104-IC電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；QL901渦旋混合器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；H-1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

2 方法

2.1 分組與造模

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠70只，按照體重均衡隨機(jī)分為2組，對(duì)照組(d000)和模型組(d112)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，模型組腹腔注射DEN 50 mg·kg-1復(fù)制模型，每周2次，連續(xù)16周，對(duì)照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液。

2.2 丹皮酚混懸液制備

取一定量丹皮酚，加入0.5% CMCNa溶液，超聲使其溶解得到38.88 mg·mL-1的丹皮酚混懸液。

2.3 給藥與取樣

大鼠于造模16周時(shí)，禁食不禁水12 h后，按照194.4 mg·kg-1(前期試驗(yàn)篩選的劑量)的劑量灌胃丹皮酚混懸液，于給藥后0.5、2、10、20、45、90、120 min將大鼠立即解剖并采集肝、心、脾、肺、腎、腦、胃、小腸組織，用0.9%氯化鈉溶液洗去表面浮血，濾紙吸干水分后，各組織精密稱重。將各組織加入2倍量0.9%氯化鈉溶液，用電動(dòng)勻漿機(jī)制備勻漿，-20 ℃冷凍保存，備用。

2.4 肝臟組織大體形態(tài)觀察

在16周末對(duì)所有大鼠取材，做肝臟大體標(biāo)本肉眼觀察，并拍照存檔。

2.5 組織分布研究

2.5.1 色譜條件 Waters Acquity C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(70∶30)；流速：0.3 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：2.1 μL。

2.5.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取丹皮酚對(duì)照品12.37 mg于2 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相制成6.185 mg·mL-1的丹皮酚儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.3 樣品預(yù)處理 精密吸取25 μL組織勻漿，置于EP管內(nèi)，先加入稀鹽酸2 μL，渦旋10 s，再加入3倍體積量的乙酸乙酯萃取，渦旋30 s，并12 000 r·min-1離心8 min，取上清液置于另外一個(gè)EP管，同法再萃取1次，合并2次上清液自然揮干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相70 μL溶解，渦旋30 s，12 000 r·min-1離心8 min，取上液清55 μL置于EP管，-4 ℃冰箱放置30 min，12 000 r·min-1離心8 min，再取上清液40 μL置于進(jìn)樣瓶中，UPLC自動(dòng)進(jìn)樣。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 專屬性試驗(yàn) 大鼠各空白組織和灌胃丹皮酚后的各組織樣品，按2.5.3項(xiàng)下方法處理，分別進(jìn)樣分析得到色譜圖，直接進(jìn)樣丹皮酚對(duì)照品溶液得到色譜圖，通過3種色譜圖比較丹皮酚峰位置是否存在干擾。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 在空白組織勻漿中加入適量丹皮酚對(duì)照品溶液，分別制成質(zhì)量濃度為412.33、103.08、25.77、6.44、1.61、0.40、0.10、0.025 mg·L-1的含丹皮酚組織樣品，按2.5.3項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析(各個(gè)組織處理相同)。以丹皮酚峰面積Y對(duì)丹皮酚質(zhì)量濃度X(mg·L-1)進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程。

2.6.3 精密度試驗(yàn) 按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，分別制備質(zhì)量濃度為103.08、6.44、0.40 mg·L-1的含丹皮酚組織樣品，按2.5.3項(xiàng)下方法平行操作，進(jìn)樣分析。每個(gè)質(zhì)量濃度于日內(nèi)平行測(cè)定5份樣品，考察日內(nèi)精密度；每個(gè)質(zhì)量濃度每日各平行測(cè)定5份樣品，連續(xù)5天，考察日間精密度。

2.6.4 絕對(duì)回收率試驗(yàn) 取空白組織勻漿3份，每份30 μL(各個(gè)組織處理相同)，分別加入3個(gè)質(zhì)量濃度的丹皮酚對(duì)照品溶液10 μL，配置成含丹皮酚103.08、6.44、0.40 mg·L-1的含藥組織樣品，按2.5.3項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析記錄色譜峰面積，每個(gè)濃度平行操作5份。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算丹皮酚質(zhì)量濃度，并以丹皮酚測(cè)得量與加入量之比計(jì)算絕對(duì)回收率。

2.6.5 相對(duì)回收率試驗(yàn) 取空白組織勻漿3份，每份30 μL(各個(gè)組織處理相同)，分別加入3個(gè)質(zhì)量濃度的丹皮酚對(duì)照品溶液10 μL，配置成含丹皮酚103.08、6.44、0.40 mg·L-1的含藥組織樣品，按2.5.3項(xiàng)下方法處理，得到丹皮酚色譜峰面積A1；用水代替空白組織樣品，按照上述方法操作，進(jìn)樣測(cè)定，得到丹皮酚色譜峰面積A2，每個(gè)質(zhì)量濃度平行操作5份。按公式(1)計(jì)算相對(duì)回收率。

相對(duì)回收率(%)=A1/A2×100%

(1)

2.6.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，分別制備丹皮酚質(zhì)量濃度為103.08、6.44、0.40 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)空白組織樣品各5份，按2.5.3項(xiàng)下方法處理，室溫保存，于0、2、4、8、10 h分別進(jìn)樣分析，記錄丹皮酚峰面積，計(jì)算丹皮酚質(zhì)量濃度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 肝臟組織大體形態(tài)觀察

對(duì)照組：大鼠肝臟大小正常，質(zhì)地光滑柔軟，顏色淡紅，切面鮮紅，無顯著病變；模型組：大鼠肝臟明顯腫大，表面逐漸粗糙，質(zhì)地變硬，邊緣變鈍，顏色變淺，包膜變厚，出現(xiàn)數(shù)量不等，大小不一的黃褐色細(xì)顆粒狀結(jié)節(jié)，切面明顯見黃色脂肪變，部分肝小葉有明顯的膽汁淤積，個(gè)別肝小葉與腹腔其他臟器粘連。見圖1。

注：A.對(duì)照組；B.模型組。圖1 各組肝臟大體標(biāo)本肉眼觀察圖

3.2 分析方法驗(yàn)證

3.2.1 專屬性 在上述色譜條件下，丹皮酚的保留時(shí)間約為1.23 min，理論塔板數(shù)大于4000。結(jié)果表明，空白組織的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾丹皮酚的測(cè)定，見圖2。

注：A.空白組織樣品；B.丹皮酚對(duì)照品；C.給藥后組織樣品；1.丹皮酚。圖2 丹皮酚UPLC圖

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以丹皮酚峰面積Y對(duì)丹皮酚質(zhì)量濃度X(mg·L-1)進(jìn)行線性回歸，丹皮酚在0.025～412.33 mg·L-1線性關(guān)系良好，回歸方程見表1。

表1 丹皮酚在大鼠各組織的回歸方程及線性范圍(n=5)

3.2.3 精密度 結(jié)果表明丹皮酚各個(gè)含藥組織高、中、低質(zhì)量濃度日內(nèi)精密度，日間精密度RSD均小于10%，符合試驗(yàn)要求。

3.2.4 回收率 丹皮酚各個(gè)含藥組織低、中、高質(zhì)量濃度的回收率結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，丹皮酚各組織3種質(zhì)量濃度下的平均回收率在82%～98%，RSD≤8%，符合試驗(yàn)要求。

表2 各組織中丹皮酚回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.2.5 穩(wěn)定性 結(jié)果表明丹皮酚經(jīng)過處理后室溫放置10 h均穩(wěn)定，RSD均小于10%。

3.3 組織樣品中丹皮酚的質(zhì)量濃度

按照2.5.3項(xiàng)下方法操作，UPLC測(cè)定大鼠各組織樣品中丹皮酚的響應(yīng)值，代入相應(yīng)的回歸方程計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)組織樣品中丹皮酚的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)，丹皮酚在對(duì)照組和模型組的平均組織濃度-時(shí)間曲線見圖3。

注：A.對(duì)照組；B.模型組。圖3 丹皮酚在對(duì)照組和模型組各個(gè)組織的組織濃度-時(shí)間曲線

3.4 丹皮酚在各組大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)用WinNonlin藥動(dòng)學(xué)軟件處理，丹皮酚在大鼠體內(nèi)的組織濃度-時(shí)間過程符合非房室模型，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3，結(jié)果顯示：相對(duì)于對(duì)照組，模型組肝、心、脾、肺、腎、腦、胃、小腸的藥時(shí)曲線下面積(AUC)均增加；相對(duì)于對(duì)照組，模型組肝、心、脾、肺、腎、腦、胃、小腸的最大濃度(Cmax)均增加；相對(duì)于對(duì)照組，模型組肝、心、脾、腎、小腸、腦、胃的清除率(CL)均減少，肺的CL增加；相對(duì)于對(duì)照組，模型組肝、心、脾、肺、腎、腦、小腸的表觀分布容積(V)均減少，胃的V增加；相對(duì)于對(duì)照組，模型組肝、心、腎、胃的平均滯留時(shí)間(MRT)增加，脾、肺、腦、小腸的MRT降低。丹皮酚在對(duì)照組各個(gè)組織中的分布順序依次為腎>胃>小腸>腦>肝>脾>心>肺，在模型組各個(gè)組織中的分布順序依次為肝>腎>脾>小腸>胃>心>腦>肺。

表3 大鼠灌胃給予丹皮酚在大鼠組織的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

注：相同器官的d112與d000組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

通過大鼠肝臟的大體形態(tài)觀察，對(duì)照組大鼠肝臟光滑柔軟，顏色淡紅，無病變。模型組大鼠肝臟顏色暗紅，明顯腫大，無光澤，可見增生結(jié)節(jié)形成。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于丹皮酚組織分布的研究較少，陳群等[5]利用GC-MS測(cè)定比較了丹皮酚單用和丹皮酚與冰片合用在腦中的濃度，結(jié)果丹皮酚單用時(shí)不易透過血腦屏障，在腦中的濃度較低，合用后，由于冰片能促進(jìn)血腦屏障的開放，丹皮酚在腦中的濃度增加。丹皮酚單用時(shí)在腦中的達(dá)峰時(shí)間為10 min，與本實(shí)驗(yàn)存在一定的差異，其原因可能是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間的種族差異引起的。Li等[6]研究了丹皮酚灌胃給藥后在大鼠體內(nèi)的組織分布情況，結(jié)果顯示，丹皮酚在體內(nèi)可以快速分布和消除，肝和腎是主要的分布器官，可以透過血腦屏障。肝臟在2 min達(dá)到最大濃度，心、脾、肺、腎、腦均在20 min達(dá)到最大濃度，隨后快速消除，丹皮酚在大鼠各個(gè)組織沒有長(zhǎng)時(shí)間的積累。李清俠等[7]研究了丹皮酚在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和組織分布情況，結(jié)果顯示小鼠一次性灌胃丹皮酚(65 mg·kg-1)后，體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)呈單室模型，其主要分布在肝，其次是脾、小腸上端、腎、結(jié)腸、心、肺。

本實(shí)驗(yàn)丹皮酚灌胃給藥0.5 min后可在各組織中檢測(cè)到，表明丹皮酚口服后迅速、廣泛地分布于各組織器官，這可能與丹皮酚的高脂溶性有關(guān)。灌胃后胃腸道濃度偏高的情形可能是給藥途徑所致。

大鼠灌胃丹皮酚后，比較丹皮酚在各個(gè)組織中不同時(shí)間點(diǎn)的分布情況，丹皮酚在對(duì)照組各個(gè)組織中的AUC分布特征為腎>胃>小腸>腦>肝>脾>心>肺，在模型組各個(gè)組織中的AUC分布特征為肝>腎>脾>小腸>胃>心>腦>肺。丹皮酚在肝、腎中AUC較高，肝、腎為血流量豐富的組織，為丹皮酚對(duì)肝炎、肝癌[8-9]具有預(yù)防保護(hù)作用提供依據(jù)，說明丹皮酚組織分布情況與其藥效密切相關(guān)；腎中AUC也高，追溯其原因可能也與丹皮酚主要以腎排泄[10]為主相關(guān)，Li等[6]在腎中發(fā)現(xiàn)丹皮酚的代謝產(chǎn)物，亦說明丹皮酚從腎臟排泄，和本文結(jié)果一致。丹皮酚進(jìn)入體內(nèi)后在肝、腎分布量較大，為進(jìn)一步研究牡丹皮歸肝、腎、心經(jīng)的中醫(yī)藥學(xué)理論提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在大腦中AUC較低，Tmax大約40 min，反映了丹皮酚不易透過血腦屏障，這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[11]。

文獻(xiàn)查閱結(jié)果顯示，中藥在生物體不同的機(jī)能狀態(tài)下，其藥理作用和體內(nèi)過程可能不同[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組各組織中丹皮酚含量高于對(duì)照組，可能是因?yàn)槟Ｐ徒M大鼠有肝硬化，伴隨肝臟各種代謝酶活性降低，因此對(duì)藥物代謝能力降低，從而導(dǎo)致各組織中丹皮酚含量升高[13]。研究丹皮酚在病理情況下體內(nèi)行為特征與在正常動(dòng)物體內(nèi)特征的差異，對(duì)其臨床用藥具有指導(dǎo)意義。

綜上所述，本研究對(duì)丹皮酚在對(duì)照組和模型組大鼠進(jìn)行了組織分布研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照組，丹皮酚在模型組具有更好的肝靶向組織分布作用。后續(xù)本研究將進(jìn)一步深化，從分子通路層面探索丹皮酚預(yù)防肝癌的機(jī)制。

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TissueDistributionStudyofPaeonol(Pae)inHepaticPrecancerousLesionModelRats

SONGYijun1*，YANGShijun3，WANGXiang2，ZHANGDongxing2，LIJingtao1，CAIDayong3，WANGYueqi2

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712046，China；2.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China；3.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100193，China)

Objective：To establish an analytical method for determination of Pae in tissues of hepatic precancerous lesion model rats by UPLC，and study the tissue distribution of Pae in rats.MethodsThe concentration of Pae in rats tissues were determined by UPLC.ResultsIn control group，kidney had the highest tissue concentration of Pae，followed by stomach，small intestine，brain，liver，spleen，heart，lung；in model group，liver had the highest tissue concentration of Pae，followed by kidney，spleen，small intestine，stomach，heart，brain，lung.And its AUCallin model group was larger than that in control group.ConclusionCompared with the control group，the content of Pae in model group increased.

Paeonol；hepatic precancerous lesion；tissue distribution

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81603612)；陜西中醫(yī)藥大學(xué)科研基金項(xiàng)目(2015PY12)

*

宋藝君，博士，講師，研究方向：中醫(yī)藥預(yù)防肝癌研究；E-mail：songyijun200506@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.014

2017-03-09)