李志成，閆偉，宋雯，韓京龍，張輝*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.吉林三龍環(huán)?？萍加邢薰?，吉林 琿春 133300)

一種人參連作障礙土壤改良技術(shù)的評(píng)價(jià)研究△

李志成1，閆偉1，宋雯1，韓京龍2，張輝1*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.吉林三龍環(huán)保科技有限公司，吉林 琿春 133300)

目的通過(guò)性狀和高效液相色譜指紋圖譜對(duì)連作園參和新林地園參進(jìn)行人參皂苷含量的比較，從而判斷連作園參種植過(guò)程中使用的土壤改良技術(shù)是否具有抗人參連作障礙的作用。方法采用有機(jī)試劑萃取法提取連作園參和新林地園參的人參總皂苷，再通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定兩種人參的皂苷含量，最后使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版對(duì)連作園參和新林地園參樣品進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)分析計(jì)算得到上述樣品的相似度。結(jié)果連作園參中所含人參皂苷Rb1、Rg1、Re含量要高于新林地園參，指紋圖譜顯示2種園參與10種連作園參的高效液相色譜圖的相似度具有一定差異性，連作園參沒(méi)出現(xiàn)更嚴(yán)重的燒須、紅皮現(xiàn)象。結(jié)論連作園參的質(zhì)量要優(yōu)于新林地園參，證明該土壤改良技術(shù)具有一定的抗人參連作障礙的作用。

連作園參；土壤改良技術(shù)；指紋圖譜；質(zhì)量

1 引言

1.1 人參

人參PanaxginsengC.A.Mey.，具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、生津止渴、安神益智的功效[1]。人參中的人參皂苷是其主要活性成分，具有調(diào)節(jié)人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)、增強(qiáng)心腦血管功能、延緩衰老、抗腫瘤等作用[2]。人參中含有的人參皂苷可以分為三類(lèi)：(1)原人參二醇(PPD)類(lèi)，主要包括人參皂苷Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd，Rg3，Rh2。(2)原人參三醇(PPT)類(lèi)，包括人參皂苷Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1。(3)齊墩果酸(OA)類(lèi)：人參皂苷R0。據(jù)辛穎[3]、Wang[4]等人的研究發(fā)現(xiàn)：人參皂苷Rg3可以控制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，殺死黑素瘤細(xì)胞，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、增殖的作用。楊逸[5]等人發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1可以降低小鼠免疫性的肝損傷，確定其具有的護(hù)肝作用。Zeng[6]等人發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2具有一定抗腫瘤的作用。同時(shí)，人參皂苷在抗衰老[7]、延緩骨骼肌萎縮[8]方面也發(fā)揮著重要的作用。

野山參在嚴(yán)格的生態(tài)因子下，人參皂苷含量高于林下參、園參，臨床有效性強(qiáng)。但野生資源有限，價(jià)格高昂，已不具備批量應(yīng)用價(jià)值。

1.2 連作園參和新林地園參

園參為人工毀林種植人參，除在外形上與野山參有所不同外，其有效成分也低于野山參。新林地園參在種植一茬以后，栽培地土壤理化性狀劣變、化感物質(zhì)累積、農(nóng)殘及重金屬增加、養(yǎng)分失衡、根際微生態(tài)系統(tǒng)失調(diào)和土傳病害增加等是導(dǎo)致人參連作障礙的重要因子，其中病蟲(chóng)害是產(chǎn)生連作障礙的關(guān)鍵因素之一。人參栽培過(guò)程中所受的病蟲(chóng)害種類(lèi)較多，已報(bào)道的病害有40多種，種植過(guò)人參的地20年內(nèi)不得重復(fù)栽參，否則會(huì)出現(xiàn)燒須、爛根等問(wèn)題[9]。人參種植中的連作障礙是園參種植業(yè)的重要影響因素[10]。

連作園參通過(guò)微生物微生態(tài)環(huán)境、植物修復(fù)的綜合技術(shù)體系改善土壤理化性質(zhì)實(shí)現(xiàn)了土壤物理結(jié)構(gòu)調(diào)整、土壤營(yíng)養(yǎng)增加、微生物群落優(yōu)化、化感物質(zhì)降解的目標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)中使用的連作園參是通過(guò)使用人參連作技術(shù)改良的園參與新林地園參中人參皂苷含量是否具有差異，來(lái)判斷該人參連作技術(shù)是否具有一定的抗人參連作障礙的作用和質(zhì)量的優(yōu)勢(shì)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

表2 實(shí)驗(yàn)試劑

2.1.3 實(shí)驗(yàn)藥材 園參，四年根，產(chǎn)地：吉林省汪清縣羅子溝鎮(zhèn)(吉林三龍環(huán)?？萍加邢薰?地塊1、地塊2。

連作園參，四年根，產(chǎn)地：吉林省汪清縣羅子溝鎮(zhèn)(吉林三龍環(huán)保科技有限公司)地塊3～地塊12。

2.1.4 結(jié)果分析軟件 中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版功能：通過(guò)導(dǎo)入相關(guān)液相色譜圖，使用設(shè)參照譜、多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配、生成對(duì)照等功能對(duì)需要的色譜圖進(jìn)行比對(duì)分析?？梢缘玫竭@一批色譜圖的相似度等信息。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1 連作園參和新林地園參的總皂苷提取 選取園參2種(樣方地1、樣方地2)，連作園參10種(樣方地3～樣方地12)去蘆頭，洗凈曬干，將12種樣品分別打成細(xì)粉，編號(hào)園參1號(hào)、園參2號(hào)、連作園參1號(hào)～連作園參10號(hào)。

信小娟等[11]將人參細(xì)粉用甲醇溶解后采用超聲提取、索氏提取法和微波提取法進(jìn)行收率的比較，最后計(jì)算得出超聲提取法的收率是9.36%為最高；王中立等[12]提出用正丁醇反復(fù)萃取對(duì)分離人參中的脂類(lèi)和多糖類(lèi)成分結(jié)果較好；殷紅梅等人[13]用氨試液萃取人參醇提取液對(duì)分離人參中的大部分多糖和鞣質(zhì)效果較好。故制定方案如下：

精密稱(chēng)取園參1號(hào)樣品粉末3 g，選擇加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，棄去乙酸乙酯液；水液用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液；用氨試液洗滌2次，每次20 mL；再用正丁醇飽和水洗滌2次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，即可得園參1號(hào)供試品。

園參2號(hào)、連作園參1號(hào)～連作園參10號(hào)樣品的處理方法同上。

最終得到園參1號(hào)、2號(hào)樣品，連作園參1號(hào)～連作園參10號(hào)供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定1 mg的人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品，加1 mL甲醇溶解，得到Rb1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、S-PPD、S-Rg3、S-Rh2的配制方法同上。將上述11個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液均精密移取100 μL混勻后制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.3 高效液相色譜法測(cè)定 根據(jù)占曉波等人[14]的色譜條件：Inertsil ODS-SP-C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%的磷酸溶液為流動(dòng)相B，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。

結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件，最終確定色譜條件為：Agilent extend C18色譜柱(4.6×150 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.5%的磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表3中的指示進(jìn)行梯度洗脫；柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，流速為0.5 mL·min-1。

表3 流動(dòng)相洗脫表

將2.2.1下的12個(gè)供試品溶液和混標(biāo)溶液過(guò)0.45 μm濾膜后轉(zhuǎn)移至液相進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣量為5 μL。即可得到園參1號(hào)、園參2號(hào)、連作園參1號(hào)～連作園參10號(hào)樣品溶液和混標(biāo)溶液的高效液相色譜圖。(見(jiàn)圖1～圖3)

圖1 園參的高效液相色譜圖

圖2 連作園參的高效液相色譜圖

圖3 人參皂苷混標(biāo)高效液相色譜圖

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、2、4、8、16、30 μL分 別 注 入 HPLC中，按 照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。結(jié)果以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到Rg1、Rb1、Re回歸方程和線(xiàn)性范圍，結(jié)果見(jiàn)表 2，各成分在各自濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

成分回歸方程r線(xiàn)性范圍/μg人參皂苷Rg1y=291327x-4882 60 99990 534～35 35人參皂苷Rb1y=209401x+146910 99980 562～30 54人參皂苷Rey=208695x+509430 99990 725～43 50

2.2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液 10 μL，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣 6 次，計(jì)算人參皂苷Rg1、Rb1、Re的峰面積 RSD均小于 2.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一人參供試品溶液，分別于 0、2、6、12、18、24 h進(jìn)樣，各色譜峰的峰面積RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一人參供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，各色譜峰的峰面積 RSD 均小于2.0%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的人參樣品約1 g，平行6份，精密稱(chēng)定分別加入對(duì)照品適量，按“2.2.1”下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，計(jì)算人參皂苷Rg1、Rb1、Re的平均加樣回收率分別為97.24%、98.95%、99.67%。

2.2.9 樣品的含量測(cè)定 按照“2.2.1”下方法制備12批供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下分別測(cè)定人參皂苷Rg1、Rb1、Re的含量，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 12批人參樣品3種皂苷類(lèi)成分的含量(%)

由表4可知，連作園參中人參皂苷Rg1、Rb1、Re的含量要高于新林地園參。

2.3 指紋圖譜的建立

本試驗(yàn)利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版對(duì)2種園參和10種連作園參共計(jì)12個(gè)樣品的高效液相色譜圖進(jìn)行分析比較，以探究其呈現(xiàn)的具有“指紋”意義的共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)保留峰面積、相似度等數(shù)據(jù)。指紋圖譜的建立是為了明確連作園參和新林地園參的含量差異、為連作園參的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。在2種園參樣品和10種連作園參樣品的高效液相色譜圖的基礎(chǔ)上，通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版的軟件就可以建立上述12個(gè)樣品的高效液相色譜指紋圖譜，見(jiàn)圖4。

注：S1為園參1號(hào)樣品；S2為園參2號(hào)樣品；S3至S12為連作園參1號(hào)樣品至連作園參10號(hào)樣品；R為對(duì)照譜圖。圖4 2種園參和10種連作園參的高效液相色譜圖(檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm)

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 任意選取一個(gè)樣品按照2.2.1下方法制備供試品溶液，按2.2.3下條件連續(xù)進(jìn)樣5次。計(jì)算各共有峰相對(duì)于內(nèi)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

表5 方法精密度的測(cè)試(相對(duì)保留時(shí)間)

由表5可知，相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.099%～0.743%。

表6 方法精密度的測(cè)試(相對(duì)峰面積)

由表6可知，相對(duì)峰面積的RSD值為0.410%～1.600%，綜合二者，表明方法的精密度良好。

2.3.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 按照2.2.1制備同一供試品溶液5份，按2.2.3下的液相條件進(jìn)樣。計(jì)算各共有峰相對(duì)于內(nèi)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見(jiàn)表7、表8。

表7 方法重現(xiàn)性的測(cè)試結(jié)果(相對(duì)保留時(shí)間)

由表7可知，相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.070%～0.140%。

表8 方法重現(xiàn)性的測(cè)試結(jié)果(相對(duì)峰面積)

由表8可知，相對(duì)峰面積的RSD值為1.400%～2.100%。綜合二者，說(shuō)明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取一樣品按2.2.1下方法制成供試品溶液，按2.2.3下色譜條件分別于第0、4、12、24、48h進(jìn)樣，計(jì)算各共有峰相對(duì)于內(nèi)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見(jiàn)表9、表10。

表9 樣品穩(wěn)定性的測(cè)試(相對(duì)保留時(shí)間)

由9表可知，相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.080%～0.220%。

表10 樣品穩(wěn)定性的測(cè)試(相對(duì)峰面積)

由表10可知，相對(duì)峰面積的RSD值為0.500%～2.800%。綜合二者，說(shuō)明樣品至少在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 小結(jié)與討論

3.1 連作園參和新林地園參的高效液相色譜圖分析

連作園參和新林地園參的高效液相色譜可分離出40余個(gè)成分。經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版軟件的對(duì)比，從中選取7個(gè)具有“指紋”意義和穩(wěn)定的共有峰，其中包括人參皂苷Rg1、Re、Rb1，見(jiàn)表11。

因人參皂苷Rb1峰面積較大且穩(wěn)定，故將人參皂苷Rb1色譜峰定為參照峰。計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)保留峰面積，見(jiàn)表12、表13。

表11 連作園參和新林地園參的7個(gè)共有峰

表12 園參和連作園參的7個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積

由表12可知，7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.110%～0.274%。

表13 人參和連作園參的7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表13可知，7個(gè)共有峰相對(duì)保留峰面積的RSD值在0.148%～0.591%。綜合二者，說(shuō)明這7個(gè)共有峰均為有效峰。

3.2 指紋圖譜相似度計(jì)算

指紋圖譜通過(guò)比較導(dǎo)入到軟件中的所有色譜峰的面積大小是否相似，來(lái)表述各個(gè)樣品間的相似程度。相似度是一個(gè)通過(guò)研究指紋圖譜來(lái)分析中藥質(zhì)量的穩(wěn)定性的重要參考數(shù)據(jù)。指紋圖譜的相似度計(jì)算是以一張指紋圖譜為基礎(chǔ)，通過(guò)高效液相色譜峰積分信息之間的比對(duì)[15]得出結(jié)果。結(jié)果表明，以共有峰的面積作為一個(gè)比較的方向，通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版軟件計(jì)算得到12種樣品的高效液相色譜指紋圖譜的相似度[16]，見(jiàn)表14。

表14 連作園參和新林地園參的指紋圖譜相似度比較

從表14可以看出，2批新林地園參的相似度在0.6以上，而10批連作園參的相似度在0.9以上。

4 結(jié)論與討論

本文將2種園參樣品和10種連作園參樣品的生曬參通過(guò)有機(jī)試劑萃取的方法分別提取人參總皂苷，再通過(guò)高效液相色譜儀對(duì)12批人參樣品中的人參皂苷Rg1、Rb1、Re進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明連作園參中的人參皂苷含量要高于新林地園參。將得到的12個(gè)樣品的色譜圖導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版軟件，就可以得到上述樣品的指紋圖譜。以人參皂苷Rb1為參照峰，對(duì)具有“指紋”意義的7個(gè)共有峰進(jìn)行相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)保留峰面積和相似度的計(jì)算。結(jié)果表明，2批新林地園參的相似度在0.6以上，而10批連作園參的相似度在0.9以上，說(shuō)明兩者之間的成分具有一定的差異性，結(jié)合含量測(cè)定結(jié)果，連作園參的質(zhì)量要優(yōu)于新林地園參，連作園參沒(méi)出現(xiàn)更嚴(yán)重的燒須、紅皮現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)使用土壤改良技術(shù)對(duì)土地的土壤進(jìn)行改良，不僅可以有效抵抗連作障礙，還可以提高人參藥材質(zhì)量，為人參種植產(chǎn)業(yè)的大規(guī)模發(fā)展起到了巨大的推動(dòng)作用。

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AKindofGinsengContinuousCroppingObstacleofSoilImprovementTechnologyEvaluationResearch

LIZhichen1，YANWei1，SONGWen1，HANJinglong2，ZHANGHui1*

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun，Changchun130117，China；2.JilinSanlongEnvironmentalProtectionTechnologyDevelopmentCo.LTD，Hunchun130117，China)

Objective：To evaluate a soil improving technology for ginseng continuous cropping obstacle through comparison of the character and HPLC fingerprint of continuous cropping garden and new woodland garden ginseng.MethodsThe total saponins were extracted，and the contents of saponins in ginseng were determined by HPLC.Finally，the similarity evaluation system of traditional Chinese medicine chromatographic fingerprints was used to evaluate the total saponins of ginseng，and the parameters of the samples were compared with each other，and the similarity of the samples was calculated and analyzed.ResultsThe contents of ginsenoside Rb1，Rg1and Re in continuous cropping garden ginseng were higher than that in new woodland garden ginseng deforestation，and the fingerprints showed that the similarity of high performance liquid chromatograms of 10 kinds of plants was different.There is no more serious burning beard，red skin phenomenon on continuous cropping garden ginseng.ConclusionThe quality of continuous cropping ginseng is better than that of new forestland ginseng，which proves that the soil improvement technology has certain anti continuous cropping effect.

Continuous cropping garden ginseng；soil improving technology；fingerprints；quality

吉林省特色藥材炮制規(guī)范項(xiàng)目(PZ-2016-12)

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張輝，教授;研究方向：中藥化學(xué)；Tel：(0431)80812267，E-mail：zhanghui_8080@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.022

2017-06-26)