王夢亮，張艷艷，2，賈巖，2，崔晉龍*，王俊宏

(1.山西大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)研究所，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006)

·基礎(chǔ)研究·

鎖陽與寄主白刺的ITS2條形碼特征及遺傳關(guān)系△

王夢亮1，張艷艷1，2，賈巖1，2，崔晉龍1*，王俊宏1

(1.山西大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)研究所，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006)

目的采用ITS2條形碼對寄生植物鎖陽-白刺進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，并分析它們之間及它們近緣種的親緣關(guān)系。方法通過改良的CTAB法提取基因組DNA，通用引物擴(kuò)增rDNA-ITS2的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，經(jīng)DNAstar軟件校對拼接，預(yù)測植物的ITS2二級結(jié)構(gòu)圖；利用MEGA 6.06軟件計算種內(nèi)、屬間Kimura-2-parameter遺傳距離；通過中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)比對和鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，分析屬間、種間和種內(nèi)遺傳關(guān)系。結(jié)果鎖陽和白刺的ITS2序列長度分別為229 bp和232 bp，GC含量分別為48%和63%。鎖陽和白刺的種內(nèi)遺傳距離分別為0～0.004 4和0～0.022；鎖陽和白刺的屬間遺傳距離為2.234 0～2.443 3。結(jié)論ITS2條形碼可以很好地鑒定、區(qū)分鎖陽、白刺及它們的近緣種之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

寄生植物；ITS2；鎖陽；白刺；親緣關(guān)系；沙生藥

生長于沙漠地帶的植物鎖陽CynomoriumsongaricumRupr.，常寄生在蒺藜科白刺屬(NitrariaL.)植物的根部[1]，是我國少數(shù)來源于沙漠的寄生植物藥之一，是歷版《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)收錄的常用中藥[2]，也是中國蒙古族等少數(shù)民族使用悠久的民間藥物[3]，《中國藥典》記載其功能和主治為“補(bǔ)腎陽，益精血，潤腸通便。用于腎陽不足，經(jīng)血虧虛，腰膝萎軟，陽痿滑精，腸燥便秘”。其寄主多為蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺屬(NitrariaL.)的唐古特白刺N(yùn).tangutorumBobr.等植物，是我國重要的防風(fēng)固沙植物，也具有藥用價值，其果實常用來治療脾胃虛弱、消化不良、神經(jīng)衰弱等。由于果實具有抗氧化、降血脂的作用，因此還有延緩衰老、防治動脈硬化的功效[4-5]。

DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)是利用準(zhǔn)確的、有足夠變異的、擴(kuò)增后相對較短的DNA片段，在種內(nèi)具有特異性而在種間具有多樣性特征的生物身份識別系統(tǒng)。它可以針對物種進(jìn)行快速自動鑒定，是近幾年生物分類鑒定的研究熱點[6]。為了確定我國藥用植物DNA條形碼應(yīng)用的有效性，2010年Chen等[7]對7個候選DNA條形碼(psbA-trnH，matK，rbcL，rpoCl，ycf5，ITS2，ITS)進(jìn)行研究，最后得出結(jié)論，來自核DNA的ITS2(internal transcribed spacer 2，ITS2)是中藥材鑒定研究中最適合的DNA條形碼，首次提出把ITS2作為藥用植物鑒定標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼。其課題組的Yao等[8]研究并提出ITS2可作為植物物種鑒定的通用條形碼。結(jié)合Koetschan等建立的ITS2數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)站預(yù)測ITS2二級結(jié)構(gòu)[9]，人們可以直觀地進(jìn)行物種的鑒定和遺傳關(guān)系的分析。本研究從我國鎖陽主產(chǎn)地騰格里沙漠邊緣地帶的阿拉善左旗采集鎖陽-白刺寄生體，著重采用ITS2對雙方進(jìn)行種屬鑒定，并對它們近緣種遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，為采集地基原藥材及其寄主的質(zhì)量、藥材監(jiān)管及臨床用藥安全等提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Nano Drop 2000(Thermo Scientific，美國)。

1.2 材料

鎖陽-白刺植物材料于2016年6月采集于阿拉善左旗錫林高勒，山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所崔晉龍博士對鎖陽和白刺2個物種14個采集地的植物進(jìn)行鑒定，標(biāo)本存放于山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所。另外，本研究還選用GenBank數(shù)據(jù)庫中的8個鎖陽和白刺近緣種數(shù)據(jù)作為本實驗的參考比較數(shù)據(jù)。實驗材料信息見表1。

2 方法

2.1 DNA提取

取新鮮樣品鎖陽莖及白刺葉各20～25 mg，液氮研磨，研磨后的樣品采用改良的CTAB法提取樣品基因組DNA[10]，用Nano Drop 2000檢測DNA濃度，放-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR擴(kuò)增及測序

利用ITS2通用引物ITS 2F、5′ATGCGATACTTGGTGTGAAT 3′、ITS 3R、5′GACGCTTCTCCAGACACAAT 3′[11-12](由上海生工生物工程股份有限公司合成)進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域PCR擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系包括2×Easy Taq PCR SuperMix(TransGen Biotech Co，China)12.5 μL，2.5 mmol·L-1引物各1 μL，模板DNA 1.5 μL，dd H2O 9 μL。

擴(kuò)增程序：94 ℃，變性5 min；94 ℃變性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s(40個循環(huán))；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度后，送上海生工生物工程公司雙向測序。

2.3 數(shù)據(jù)處理

測序后，用DNAStar對序列校對拼接，去除引物區(qū)，獲得準(zhǔn)確一致性序列。對所獲得的序列采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8 S和28 S區(qū)獲得ITS2區(qū)[13]，同時獲得ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。使用MEGA 6.06對ITS2間隔區(qū)進(jìn)行多序列比對，計算K2P種內(nèi)、種間和屬間遺傳距離，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用BLAST法和距離鑒定法對鎖陽、白刺及它們的同屬近緣種進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 ITS2對樣品的鑒定

實驗成功提取樣品基因組DNA，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果提交至GenBank網(wǎng)站，序列號見表1，與GenBank庫數(shù)據(jù)比對，確定樣品的種屬地位，所有樣品與基因庫對應(yīng)植物序列的相似性都介于97%～100%，確定為鎖陽CynomoriumsongaricumRupr.和白刺N(yùn)itrariatangutorumBobr.。具體結(jié)果見表1。

3.2 對Genbank數(shù)據(jù)庫下載序列的正確性考察

從Genbank數(shù)據(jù)庫下載的8個鎖陽和白刺同種或近緣種ITS2序列，通過MEGA 6.06軟件與ITS2網(wǎng)站(http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)分析，發(fā)現(xiàn)其序列長度與樣品的序列長度一致，均為229 bp、232 bp，GC含量相同，均為48%、63%，見表1。此外，均具有二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖，且與鎖陽、白刺的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖一致，見圖2、3。

3.3 鎖陽和白刺的ITS2序列與K2P遺傳距離分析

在本研究中，8個鎖陽樣品的ITS2序列長度均為229 bp，GC含量均約為48%，序列變異較小，僅有2個變異位點和1個信息位點，分別是第193位和217位；6個白刺樣品，序列長度均為232 bp，GC含量均約為63%，有6個變異位點和2個信息位點，序列變異較小。基于K2P模型的遺傳距離結(jié)果表明，鎖陽的種內(nèi)遺傳距離為0～0.004 4，白刺的種內(nèi)遺傳距離為0～0.022，鎖陽和白刺的種內(nèi)變異均小。鎖陽和白刺之間的屬間變異較大，屬間遺傳距離為2.234 0～2.443 3。白刺的種間遺傳距離為0.032 4～0.188。數(shù)據(jù)表明，樣品的屬間遺傳距離明顯大于鎖陽、白刺的最大種內(nèi)遺傳距離，白刺的種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離。因此，ITS2序列可以區(qū)分開藥材鎖陽和白刺以及它們的親緣種屬樣品，本研究中樣品的ITS2標(biāo)記特征信息見表1。

3.4 親緣關(guān)系分析

基于ITS2序列構(gòu)建各樣品的NJ系統(tǒng)樹(見圖1)表明，所有采集的鎖陽樣品與GenBank庫中的同種植物聚為同一個分支，種內(nèi)遺傳距離相近，變異最小，表現(xiàn)出明顯的單系性。白刺樣品與GenBank庫中報道于中國甘肅的唐古特白刺DQ267176.1聚在一起，采集于內(nèi)蒙古的白刺樣品種內(nèi)遺傳距離最近，其次是報道于甘肅的同種白刺DQ267176.1，同屬不同種2個凹葉白刺KP087772.1、KP087773.1聚為一枝，其白刺種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離。從結(jié)果可以看出，ITS2作為條形碼，不僅可以明顯區(qū)分不同屬物種，而且可以有效分析種屬之間的進(jìn)化關(guān)系。

3.5 鎖陽和白刺ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)

本研究通過ITS2網(wǎng)站對鎖陽和白刺的ITS2序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。從選取部分鎖陽種內(nèi)ITS2結(jié)構(gòu)可以看出(見圖2)，所有鎖陽的4個螺旋區(qū)在莖環(huán)數(shù)目、大小、角度、位置以及莖環(huán)發(fā)出的角度等方面基本相同。而白刺種間ITS2預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)比較中(只選取部分，見圖3)，KX813697在螺旋區(qū)Ⅲ有5個莖環(huán)，2個大3個小；在螺旋區(qū)Ⅳ有3個莖環(huán)，1個大2個??；而KP087772.1在螺旋區(qū)Ⅲ中有6個莖環(huán)，4個大2個?。辉诼菪齾^(qū)Ⅳ有3個莖環(huán)，3個都大，最后兩個莖環(huán)距離很近。由此可以看出，鎖陽和白刺以及白刺同屬各種ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)有明顯差異。

表1 實驗材料來源、ITS2序列及GenBank登錄信息

注：Pasturea：指阿拉善左旗錫林高勒蘇木三校大隊西北牧場。

注：bootstrap 1000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%。圖1 采用鄰接法對鎖陽和白刺ITS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹

圖2 鎖陽種內(nèi)ITS2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

圖3 白刺種間ITS2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

4 結(jié)論與討論

鎖陽是為數(shù)不多的、來源于沙漠地帶的寄生植物藥之一，主要寄主為唐古特白刺[1]。本研究以DNA條形碼為技術(shù)手段，對兩個物種之間以及它們各自的種內(nèi)和種間親緣關(guān)系進(jìn)行研究，既從技術(shù)上克服了形態(tài)鑒定法比較粗放的缺陷，也能夠避免對鎖陽和白刺的單獨研究而忽視寄生關(guān)系帶來的弊端。這對于兩者的研究和開發(fā)中的物種跟蹤及鑒定、寄生發(fā)生機(jī)理、基因交流、物質(zhì)交換等的研究都具有重要意義。

分子生物學(xué)鑒定方法(如RFLP技術(shù)、RAPD技術(shù)和SSR技術(shù))雖在中藥植物鑒定研究中表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢[14-15]，但是由于存在通用性低、可重復(fù)性不強(qiáng)等特點，使得該方法在藥用植物的鑒定過程中出現(xiàn)了很多弊端。DNA條形碼技術(shù)的出現(xiàn)，為快速、便捷、標(biāo)準(zhǔn)化鑒定藥用植物，創(chuàng)造了良好的條件[11]，因此，以ITS2條形碼作為中藥材標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在許多藥用植物中進(jìn)行了應(yīng)用[7-8，12]，人們強(qiáng)烈呼吁將ITS2序列列為植物類藥材核心條形碼序列[16]。此外，ITS2二級結(jié)構(gòu)的研究也具有一定的系統(tǒng)和分類價值[7，17-18]。因此，采用ITS2研究主產(chǎn)地鎖陽及其寄主的親緣關(guān)系，闡明其ITS2特征，為補(bǔ)充我國中藥材ITS2條形碼研究庫提供了科學(xué)依據(jù)。

隨著樣品量的增大，要將大量復(fù)雜類群的寄生植物準(zhǔn)確鑒定到種，如解決本研究中的鎖陽與寄主白刺樣本鑒定問題，驗證其易混品及種間差異，利用ITS2序列在物種鑒定上的準(zhǔn)確性和快速性，我們選擇了GenBank庫中5個鎖陽商品、報道于甘肅的N.tangutorum(No.DQ267179.1)、報道于新疆的2個近緣種凹葉白刺N(yùn).retusa(KP087772.1、KP087773.1)，以ITS2分子標(biāo)記特征能夠靈敏地分析它們的序列特征以及近緣種之間的關(guān)系，這對于研究鎖陽-白刺寄生雙方ITS2遺傳特征及遺傳關(guān)系，具有高效、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)勢。

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MolecularMarkerandGeneticRelationshipAnalysisofCynomoricumsongaricumandItsHostNitrariatangutorumbyITS2BarcodeSequence

WANGMengliang1，ZHANGYanyan1，2，JIAYan1，2，CUIJinlong1*，WANGJunhong1

(1.Instituteofappliedchemistry，Shanxiuniversity，Taiyuan030006，China；2.Instituteofbiotechnology，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China)

Objective：Identification and genetic relationship ofCynomoriumSongaricumand its hostNitrariatangutorumwere investigated by ITS2 molecular marker analysis.MethodsThe genome DNA of plant was extracted by modified CTAB method.Internal transcribed spacer of rDNA-ITS2 was amplified by universal premiers of ITS2，then was aligned and jointed by DNAstar.The secondary structure of ITS2 was predicted in professional web.Intraspecific and intergenic genetic distances ofC.songaricumandN.tangutorumwere detected with Kimura-2-parameter by MEGA 6.06 software.DNA barcode analysis system and neighbor-joining method were used to create polygenetic tree to analyze genetic relationships.ResultsITS2 sequences ofC.songaricumandN.tangutorumwere 229 bp and 232 bp，respectively.GC contents were 48% and 63%，respectively.Intraspecific genetic distances ofC.songaricumandN.tangutorumwere 0-0.004 4 and 0-0.022，respectively.Interspecific genetic distance ofC.songaricumandN.tangutorumwas 2.234 0-2.443 3.ConclusionITS2 barcode was an effective method for specific identification and evaluation of genetic relationship toC.songaricumandN.tangutorum.

Parasitic plant；ITS2；CynomoriumsongaricumRupr.；NitrariatangutorumBobr.；genetic relationship

國家自然科學(xué)基金(31670328，31270383)；林業(yè)公益性行業(yè)科研項目(201304326)

*

崔晉龍，博士，副教授，研究方向：珍稀藥用植物及內(nèi)生真菌資源開發(fā)；Tel：(0351)7016101，E-mail：CJL717@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.007

2017-04-06)