馬麗蘋，焦昆鵬，羅 磊，向進(jìn)樂(lè)，黨筱筱，朱文學(xué),*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2.河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471023）

改性蘋果果膠性質(zhì)及抗氧化活性

馬麗蘋1,2，焦昆鵬1,2，羅 磊1,2，向進(jìn)樂(lè)1,2，黨筱筱1，朱文學(xué)1,2,*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2.河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471023）

以蘋果果膠為原料，采用酸堿修飾和高壓蒸汽法2 種方法分別制備酸堿改性和熱改性蘋果果膠，并在分析蘋果果膠改性前后理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了其體外抗氧化活性。結(jié)果表明：酸堿改性和熱改性后的蘋果果膠與未改性果膠相比：半乳糖醛酸含量由（683.92±4.51）mg/g分別增加到（910.61±1.08）mg/g和（780.19±5.68）mg/g，酯化度由（77.26±1.20）%分別降低到（35.48±1.90）%和（33.67±1.28）%。改性后果膠分子質(zhì)量降低，多酚和蛋白質(zhì)含量均較低（分別小于3 mg/g和7 mg/g）。改性前后蘋果果膠的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率、羥自由基清除率、2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率均隨果膠質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，而且酸堿改性更有助于其抗氧化活性的提高，這可能與其半乳糖醛酸含量增加有關(guān)。

改性；蘋果果膠；果膠性質(zhì)；抗氧化活性

果膠是一種天然的酸性多糖物質(zhì)，主要存在于高等植物的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)層，具有黏合細(xì)胞的作用[1]。天然果膠是由a-D-(1-4)-半乳糖醛酸重復(fù)片段組成的平滑區(qū)和帶有大量中性糖側(cè)鏈的a-D-(1-4)-半乳糖醛酸和a-L-(1-2)-鼠李糖交替連接的毛發(fā)區(qū)組成[2]。果膠具有良好的增稠性、穩(wěn)定性、凝膠性、吸附性和成膜性等特性，因此可作為一種高檔的天然食品添加劑和保健品，廣泛用于食品、醫(yī)藥保健品和日化等行業(yè)[3]。

蘋果果膠是僅次于柑橘果膠的第二大商品果膠來(lái)源，有研究表明其具有降血脂[4]、清除機(jī)體內(nèi)放射性元素[5]、抗肥胖[6]和一定的抗腫瘤作用[7-8]。但是蘋果果膠分子質(zhì)量大、水溶性差的特點(diǎn)有可能會(huì)阻礙或者限制其功能的發(fā)揮。而果膠改性可以使果膠生成較短、分支較少的糖鏈，以降低其分子質(zhì)量和酯化度，增加其水溶性，并提高其半乳糖醛酸含量，從而更好地發(fā)揮其生物活性和功能[9-14]。然而，改性果膠的研究主要集中在柑橘果膠方面[15-21]，對(duì)蘋果果膠改性以及改性果膠的生物活性方面的研究報(bào)道較少。目前，果膠改性方法有化學(xué)改性法（如堿法脫酯、酰胺化脫酯）、生物改性法（如酶法改性）和物理改性法（如高溫、高壓處理），其中堿法脫酯和高溫高壓改性的工藝簡(jiǎn)便易操作、安全性高且成本低，易于工業(yè)化推廣[22]。因此，本研究采用酸堿修飾和高溫蒸汽處理2 種方法對(duì)蘋果果膠進(jìn)行改性，并在分析改性果膠理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究其抗氧化活性，本研究不僅能拓寬蘋果果膠的應(yīng)用范圍，還為今后利用蘋果果膠開發(fā)保健食品和藥品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果果膠 上海凱洋生物工程有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、半乳糖醛酸、間羥聯(lián)苯 美國(guó)Sigma公司；2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）、四唑氮藍(lán)（nitro-blue tetrazolium，NBT）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）阿拉丁（上海）試劑公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 成都西亞試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 上海吉生物科技發(fā)展有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；UV1800型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；精密電子天平 上海菁海儀器系統(tǒng)有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；FA1004型電子天平 上海上平儀器公司；Vertex70/80型傅里葉變換紅外光譜儀 日本SANYO公司；600型高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；DAWN8型多角度激光光散射儀、OpticlabrEX型示差折光儀美國(guó)Wyatt公司；L-2400型紫外檢測(cè)儀 日本日立公司；QUANTA200掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司；FE20-K plus型酸度計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果果膠的改性

酸堿改性果膠制備[23]：稱取3 g蘋果果膠于250 mL錐形瓶中，加入200 mL、55 ℃蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為15 mg/mL的溶液。待果膠全部溶解后，緩慢加入3 mol/L的NaOH溶液至pH值變化到10.0，在55 ℃水浴中維持45 min不變，冷卻至室溫，再加3 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.0后維持一段時(shí)間不變，在室溫下靜置過(guò)夜。然后加入3 倍體積的95%乙醇攪拌產(chǎn)生大量的白色絮狀沉淀，50 ℃烘干得到酸堿改性蘋果果膠，酸堿改性果膠得率按式（1）計(jì)算。

式中：m1為酸堿改性果膠的干質(zhì)量/g；m0為蘋果果膠的質(zhì)量/g。

熱改性果膠制備[24]：稱取3 g蘋果果膠溶于100 mL、55 ℃蒸餾水中，配制成30 mg/mL的溶液，完全溶解后，調(diào)節(jié)pH值至4.0，置于蒸汽滅菌鍋中，在123.2 ℃高溫條件下維持30 min，取出冷卻至室溫，50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原液體積的1/3，向濃縮液中加入3 倍體積無(wú)水乙醇攪拌產(chǎn)生白色沉淀，50 ℃烘干得到熱改性蘋果果膠，熱改性果膠得率按式（2）計(jì)算。

式中：m2為熱改性果膠的干質(zhì)量/g；m0為蘋果果膠的質(zhì)量/g。

1.3.2 半乳糖醛酸含量的測(cè)定

采用Blumenkrantz等[25]的間羥聯(lián)苯法測(cè)定果膠樣品中半乳糖醛酸含量。分別吸取60 μg/mL半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.05、0.10、0.15、0.20 mL和0.25 mL于6 個(gè)10 mL離心管中，并標(biāo)號(hào)為0、1、2、3、4和5。用蒸餾水補(bǔ)加各管至0.25 mL。冰水浴中預(yù)冷后，加入0.012 5 mol/L四硼酸鈉-硫酸溶液1.5 mL，并振蕩混勻，沸水浴加熱5 min后冰浴至室溫，加入1.5 mg/mL間羥聯(lián)苯25 μL并搖勻。以0號(hào)管為空白對(duì)照，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以反應(yīng)體系中半乳糖醛酸的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y＝0.218 8x-0.001 1，R2＝0.995 8。配制適當(dāng)質(zhì)量濃度的樣品果膠溶液，按上述操作測(cè)定520 nm波長(zhǎng)處吸光度，將吸光度代入線性回歸方程計(jì)算半乳糖醛酸質(zhì)量濃度，再計(jì)算其含量。

1.3.3 酯化度的測(cè)定

稱取0.05 g果膠溶于50 mL蒸餾水中，使其充分溶解。加入3 滴酚酞，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行標(biāo)定，出現(xiàn)粉紅色并維持1 min不變色時(shí)記錄所消耗的氫氧化鈉溶液體積（V1），即為初始滴定度。再加入3 mol/L的氫氧化鈉溶液2.5 mL，并振蕩搖勻，5 min后加入3 mol/L的鹽酸2.5 mL；并振蕩至粉紅色消失。然后再加入2 滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至再次呈粉紅色并維持1 min不變色，記錄這次氫氧化鈉溶液的消耗體積（V2）。酯化度按式（3）進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

取100 μg/mL BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6 mL和0.8 mL分別加入到編號(hào)為0、1、2、3、4、5的10 mL刻度試管中，用蒸餾水將各管補(bǔ)至1.0 mL。再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，混勻后靜置5 min，以0號(hào)管為空白對(duì)照，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以反應(yīng)體系中BSA質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y＝0.259 2x-0.001 2，R2＝0.995 6。將3 種果膠配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的溶液，按上述操作，測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處吸光度。將吸光度代入BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程中計(jì)算得蛋白質(zhì)量濃度，進(jìn)一步計(jì)算其含量。1.3.5 多酚含量的測(cè)定

準(zhǔn)確移取0.1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL和1.2 mL分別加入到10 mL的容量瓶中，再分別加入6 mL的蒸餾水與0.5 mL的福林-酚試劑，搖勻，1 min后再分別加入1.5 mL 0.2 g/L碳酸鈉溶液，定容至10 mL后置于室溫下反應(yīng)30 min，于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y＝0.135 5x-0.004 3。將3 種果膠配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度溶液，按上述操作，測(cè)定765 nm波長(zhǎng)處吸光度。將吸光度代入線性回歸方程中計(jì)算得多酚質(zhì)量濃度（以沒(méi)食子酸當(dāng)量計(jì)），進(jìn)一步計(jì)算得樣品中多酚含量。

1.3.6 分子質(zhì)量的測(cè)定

分子質(zhì)量和分子質(zhì)量的分布采用使用高效體積排阻色譜聯(lián)用多角度激光散射（high performance size exclusion chromatography multiangle laser light scattering，H P SEC-MALLS）法測(cè)定，實(shí)驗(yàn)條件：TOSOH TSKG4000PWXL凝膠柱（300 mm×7.8 mm，10 μm）；果膠溶液2 mg/mL；進(jìn)樣量100 μL；洗脫液為含有0.2 mg/mL疊氮鈉的0.1 mol/L硝酸鈉溶液（pH 7.0）；洗脫速率0.5 mL/min。由Astra 4.73.04軟件分析得出重均分子質(zhì)量（mW）、數(shù)均分子質(zhì)量（mn）和多分散性指數(shù)（mW/mn）。

1.3.7 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

果膠樣品經(jīng)過(guò)粘臺(tái)、噴金等步驟后，在加速電壓為10 kV的條件下采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.8 DPPH自由基清除率測(cè)定

將2.0 mL新鮮配制的DPPH溶液（0.2 mmol/L，95%甲醇溶液配制）分別與2.0 mL不同質(zhì)量濃度的果膠樣品（0.062 5～4.000 0 mg/mL）充分混勻，室溫避光反應(yīng)20 min后，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為A1，以95%甲醇溶液代替上述體系中的DPPH溶液，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為A2，以蒸餾水代替上述體系中果膠樣品溶液，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為A0。DPPH自由基清除率按式（4）進(jìn)行計(jì)算。

1.3.9 ·OH清除率測(cè)定

將0.6 mL 6 mmol/L FeSO4溶液與2.0 mL果膠樣品溶液（0.062 5～4.000 0 mg/mL）分別混勻后，加入0.6 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，充分混勻后反應(yīng)10 min，再向各管加入6 mmol/L水楊酸0.6 mL，充分混合后反應(yīng)10 min，最后在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度為A1。在上述反應(yīng)體系中，以無(wú)水乙醇代替水楊酸，測(cè)定吸光度為A2，以蒸餾水代替樣品溶液，測(cè)定吸光度為A0?！H清除率按式（5）進(jìn)行計(jì)算。

1.3.10 ABTS+·清除率測(cè)定

用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4、0.2 mol/L）配制7.4 mmol/L的ABTS溶液（其中過(guò)硫酸鉀濃度為2.6 mmol/L），然后避光置于室溫下16 h，使用之前用PBS稀釋至其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A0）為（0.70±0.02）。將3 種果膠樣品用PBS配制成0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0 mg/mL和4.000 0 mg/mL的溶液，分別取0.2 mL各質(zhì)量濃度樣品溶液與2.0 mL ABTS稀釋液混合，室溫避光反應(yīng)20 min后，立即在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A1）；同時(shí)將0.2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與2 mL PBS混合，并室溫避光反應(yīng)20 min后，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A2）。按式（6）計(jì)算ABTS+·清除率。

1.3.11 O2-·清除率測(cè)定

配制16 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液，并用該緩沖液配制果膠樣品溶液（0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0 mg/mL和4.000 0 mg/mL）、468 μmol/L NADH、108 μmol/L NBT和60 μmol/L PMS。將1.0 mL樣品溶液、1.0 mL NBT和1.0 mL NADH溶液混合，混合均勻后加入1.0 mL PMS溶液，室溫下靜置5 min，測(cè)定混合液在560 nm波長(zhǎng)處的吸光度。按式（7）計(jì)算超氧陰離子自由基（）清除率。

式中：A0為緩沖液代替樣品的吸光度；A1為樣品溶液與顯色體系的吸光度；A2為樣品溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）采用SPSS 22.0軟件中Probit回歸分析求得，實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)采用±s表示，數(shù)據(jù)顯著性差異檢驗(yàn)采用單因素方差分析并用LSD法進(jìn)行多重比較，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 改性蘋果果膠的化學(xué)性質(zhì)

表1 改性前后蘋果果膠的化學(xué)性質(zhì)Table 1 Chemical properties of native and modif i ed apple pectin

采用酸堿修飾和高壓蒸汽處理2 種手段分別獲得酸堿改性蘋果果膠和熱改性蘋果果膠，3 種果膠的化學(xué)性質(zhì)見表1。酸堿改性果膠和熱改性果膠的得率分別為（68.65±1.20）%和（58.00±1.54）%；未改性果膠、酸堿改性果膠和熱改性果膠的半乳糖醛酸含量分別為（683.92±4.51）、（910.61±1.08）mg/g和（780.19±5.68）mg/g，與改性前相比，改性后果膠半乳糖醛酸含量顯著提高（p＜0.05）。改性前果膠的酯化度為（77.26±1.20）%，而改性后果膠酯化度顯著下降（p＜0.05），其中酸堿改性果膠和熱改性果膠酯化度分別為（35.48±1.90）%和（33.67±1.28）%。酸堿改性時(shí)，堿處理引起β-消除反應(yīng)，使得同聚半乳糖醛酸骨架解聚，同時(shí)也使酯化度降低；酸處理則優(yōu)先脫下側(cè)鏈上的中性糖[26]，因此，果膠經(jīng)酸堿改性后其半乳糖醛酸含量增加，酯化度下降；果膠經(jīng)高溫高壓處理，可引起β-消除反應(yīng)和脫甲酯基作用[27]，因此半乳糖醛酸含量增加，酯化度下降。尹穎等[24]在121 ℃溫度條件下處理30 min制備柑橘皮渣改性果膠，發(fā)現(xiàn)改性后果膠的半乳糖醛酸含量比處理前上升了6%～14%，酯化度比處理前下降了8%～21%，與本研究高溫高壓改性結(jié)果的趨勢(shì)一致。3 種果膠多酚含量均較低（＜3 mg/g）且差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明其抗氧化活性主要由多糖引起。而改性前后蛋白質(zhì)含量變化不顯著（P＞0.05）。

2.2 改性蘋果果膠的分子質(zhì)量及其分布

圖1 蘋果果膠（a）、酸堿改性果膠（b）和熱改性果膠（c）的HPSEC-MALLS圖Fig. 1 HPSEC-MALLS chromatograms of unmodi fi ed pectin (a),pH-modi fi ed pectin (b), and heat-modi fi ed pectin (c)

表2 蘋果果膠的分子質(zhì)量及其分布Table 2 Molecular weight distribution of native and modif i ed apple pectin

由圖1、表2可知，蘋果果膠主要由2 個(gè)片段組成（峰0為光散射大分子特征峰），其中片段1（圖1a，峰1）的mW和mn分別為7.481×104D和和5.427×104D，片段2（圖1a，峰2）的mW和mn分別為7.272×103D和5.279×103D。酸堿改性蘋果果膠亦由2 個(gè)片段組成，其中片段1（圖1b，峰1）的mW和mn分別為6.247×104D和3.951×104D，另一個(gè)片段（圖1b，峰2）的mW和mn分別為6.175×103D和4.374×103D；熱改性蘋果果膠也由兩個(gè)片段組成，其中片段1（圖1c，峰1）的mW和mn分別為4.075×104D和2.123×104D，片段2（圖1c，峰2）的mW和mn分別為3.556×103D和2.421×103D。蘋果果膠經(jīng)改性后，mW和mn均明顯下降，其中熱改性果膠的mW和mn的下降幅度最大。改性后果膠的mW/mn都高于未改性果膠，說(shuō)明蘋果果膠經(jīng)酸堿修飾或高壓蒸汽處理后，分子片段被隨機(jī)打斷，不均一片段增多，分子質(zhì)量分布變寬。

2.3 改性蘋果果膠的掃描電子顯微鏡結(jié)果

圖2 蘋果果膠（a）、酸堿改性果膠（b）和熱改性果膠（c）的掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 Scanning electron microscopic images of unmodif i ed pectin (a),pH-modif i ed pectin (b) and heat-modif i ed pectin (c)

未改性果膠表面凹凸不平，質(zhì)地緊密，且有許多大小不等的碎片散落（圖2a）。酸堿改性果膠質(zhì)地較疏松，且表面有絲狀或顆粒狀堆積（圖2b）。熱改性果膠與前兩種果膠相比，質(zhì)地更加疏松，具有空腔結(jié)構(gòu)，且呈現(xiàn)瓣膜狀皺褶，隱約可見片層結(jié)構(gòu)（圖2c）。果膠經(jīng)改性后，其分子質(zhì)量、半乳糖醛酸含量和酯化度發(fā)生了不同程度變化，引起了多糖分子間相互作用力的改變，從而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的差異。

2.4 蘋果果膠對(duì)DPPH自由基的清除率

DPPH自由基是一種合成的以氮為中心的親脂自由基，其甲醇溶液呈紫色，且在517 nm波長(zhǎng)處有特征吸收峰。當(dāng)它從氫供體（如抗氧化劑）獲得氫時(shí)生成黃色的DPPH-H，并伴隨著在517 nm波長(zhǎng)處吸光度的降低[28]，這種現(xiàn)象可以用來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化劑的自由基清除能力。

圖3 不同蘋果果膠對(duì)DPPH自由基的清除率Fig. 3 Scavenging capacity of different apple pectins against DPPH radical

由圖3可知，3 種果膠對(duì)DPPH自由基的清除作用存在著劑量依賴效應(yīng)，即隨著果膠質(zhì)量濃度的增加其DPPH自由基清除率亦不同程度增加。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度低于0.5 mg/mL時(shí)，三者清除率差異不顯著（P＞0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)1.0 mg/mL時(shí)，酸堿改性果膠的DPPH自由基清除率遠(yuǎn)高于未改性果膠和熱改性果膠（p＜0.05），而熱改性果膠的DPPH自由基清除率與未改性果膠差異不大（P＞0.05）。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，未改性果膠、酸堿改性果膠和熱改性果膠的DPPH自由基清除率分別達(dá)到（64.32±2.25）%、（82.95±1.45）%和（65.68±0.32）%，由回歸分析可知三者IC50值分別為（1.40±0.07）、（0.87±0.26）、（1.83±0.01）mg/mL。由此可見，酸堿改性果膠對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)。

多糖中的羥基和羧基均可以作為氫的供體，相比較之下，羧基更容易解離氫原子，就更容易使DPPH自由基還原成DPPH-H，因此半乳糖醛酸含量高且酯化度低的酸堿改性果膠清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)。

2.5 蘋果果膠對(duì)·OH的清除活性

本實(shí)驗(yàn)利用Fe2+和H2O2混合產(chǎn)生·OH。若在反應(yīng)體系中加入水楊酸，能有效地與·OH發(fā)生反應(yīng)并生成2,3-二羥基苯甲酸，其在510 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰[29]。在反應(yīng)體系中加入果膠溶液，若其能抑制·OH的產(chǎn)生，便能與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH從而使有色產(chǎn)物的產(chǎn)量減少，利用此原理便可測(cè)定果膠清除·OH的能力。

圖 4 不同蘋果果膠對(duì)·OH的清除率Fig. 4 Scavenging capacity of different apple pectins against hydroxyl radical

由圖4可知，3 種果膠均具有·OH的清除能力，且隨著果膠質(zhì)量濃度的增加，其清除能力也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為0.062 5 mg/mL時(shí)，3 種果膠的清除能力差異顯著（p＜0.05），酸堿改性果膠的·OH清除率最高，可達(dá)到（33.90±1.32）%，且果膠質(zhì)量濃度在0～4 mg/L范圍內(nèi)，酸堿改性果膠的·OH清除能力都顯著高于未改性果膠和熱改性果膠（p＜0.05）。而熱改性果膠僅在質(zhì)量濃度低于0.5 mg/mL時(shí)，其·OH清除率大于未改性果膠，當(dāng)質(zhì)量濃度高于2.0 mg/mL時(shí)，熱改性果膠與未改性果膠的·OH清除能力差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，未改性果膠、酸堿改性果膠和熱改性果膠的·OH清除率分別達(dá)到（71.00±0.99）%、（80.63±1.32）%和（67.41±1.58）%，由回歸分析可知三者IC50值分別為（1.10±0.17）、（0.23±0.05）mg/mL和（1.5 2±0.3 9）m g/m L，V C的I C50值為（0.04±0.01）mg/mL，3 種果膠的清除能力均低于VC。3 種果膠對(duì)·OH清除能力由高到低依次為：酸堿改性果膠＞未改性果膠＞熱改性果膠。研究表明，·OH的清除機(jī)制主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：抑制·OH的產(chǎn)生和清除已經(jīng)產(chǎn)生的·OH。多糖中的羧基還能夠絡(luò)合金屬離子如Fe2+和Cu2+等，從而抑制它們與H2O2進(jìn)一步反應(yīng)生成·OH，而多糖中的羥基和羧基可作為氫供體（提供氫原子與·OH反應(yīng)）清除·OH[30-33]。因此，半乳糖醛酸含量較高的酸堿改性蘋果果膠對(duì)·OH的清除能力較強(qiáng)。

2.6 蘋果果膠對(duì)ABTS+·的清除活性

作為穩(wěn)定的以氮為中心的水溶性自由基，ABTS+·常用于評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的抗氧化活性。ABTS和過(guò)硫酸鉀反應(yīng)可以產(chǎn)生藍(lán)綠色ABTS+發(fā)色團(tuán)，多糖可以提供氫或電子滅活A(yù)BTS+發(fā)色團(tuán)，使其藍(lán)綠色消失[34-35]。因此推測(cè)供氫能力越強(qiáng)的多糖，其清除ABTS+·的能力就愈強(qiáng)。

圖5 不同蘋果果膠對(duì)ABTS＋·的清除率Fig. 5 Scavenging capacity of different apple pectins against ABTS radical

由圖5可知，所有樣品對(duì)ABTS+·的清除率隨果膠質(zhì)量濃度的增加而升高。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度低于0.25 mg/mL時(shí)，3 種果膠的ABTS+·的清除率差異不顯著（P＞0.05），當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，酸堿改性果膠的清除率顯著高于未改性果膠（p＜0.05），果膠質(zhì)量濃度增加至2.0 mg/mL時(shí)，酸堿改性果膠的清除率顯著高于未改性果膠和熱改性果膠（p＜0.05）。當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，未改性果膠、酸堿改性果膠和熱改性果膠的ABTS+·的清除率分別為（86.46±1.20）%、（88.21±0.90）%和（83.83±0.97）%，可見3 種果膠清除率差異不顯著（P＞0.05）。由回歸分析可知3 種果膠的IC50值分別是（1.01±0.15）、（0.78±0.10）mg/mL和（0.9 4±0.1 5）m g/m L，V C的I C50值為（0.015±0.003）mg/mL，遠(yuǎn)高于3 種果膠的清除能力。蘋果果膠經(jīng)酸堿改性后，其對(duì)ABTS+·的清除能力最強(qiáng)，這可能與羧基比羥基更容易解離出氫，從而更容易淬滅ABTS+發(fā)色團(tuán)有關(guān)。

圖6 不同蘋果果膠對(duì)O－2·的清除率Fig. 6 Scavenging capacity of different apple pectins against superoxide anion radical

由以上結(jié)果可知，半乳糖醛酸含量提高有助于果膠抗氧化活性的增強(qiáng)，而半乳糖醛酸含量較高的熱改性果膠對(duì)自由基的清除能力卻較低，這可能與其分子質(zhì)量、單糖組成和構(gòu)象等多種因素有關(guān)，具體原因需要進(jìn)一步分析。

3 結(jié) 論

采用酸堿修飾和高壓蒸汽2 種方法對(duì)蘋果果膠進(jìn)行改性，分別得到酸堿改性果膠和熱改性果膠。與未改性果膠相比，酸堿改性和熱改性果膠的半乳糖醛酸含量提高，酯化度和分子質(zhì)量下降，多酚及蛋白質(zhì)含量差異不明顯（P＞0.05）。掃描電子顯微鏡結(jié)果表明，改性后果膠質(zhì)地更加疏松，可能與其分子質(zhì)量、酯化度和半乳糖醛酸含量改變有關(guān)。酸堿改性和熱改性果膠的·OH清除率、ABTS+·清除率和的清除率呈質(zhì)量濃度依賴效應(yīng)，當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，未改性果膠、酸堿改性果膠和熱改性果膠對(duì)DPPH自由基的清除率分別為（64.32±2.25）%、（8 2.9 5±1.4 5）%和（6 5.6 8±0.3 2）%，對(duì)·O H的清除率分別達(dá)到（71.00±0.99）%、（80.63±1.32）%和（67.41±1.58）%，對(duì)ABTS自由基的清除率分別達(dá)到（8 6.4 6±1.2 0）%、（88.21±0.90）%和（83.83±0.97）%，對(duì)的清除率分別達(dá)到（55.14±1.73）%、（66.98±1.51）%和（40.50±2.01）%。由此可見，酸堿改性更有助于果膠抗氧化活性的提高，這可能與其半乳糖醛酸含量提高有關(guān)。

[1] HOFF J E, CASTRO M D. Chemical composition of potato cell wall[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1969, 17(6):1328-1331. DOI:10.1021/jf60166a058.

[2] 彭小燕, 木泰華, 孫紅男, 等. 甜菜果膠的結(jié)構(gòu)、提取及乳化特性研究進(jìn)展[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2014, 28(6): 1070-1075. DOI:10.11869/j.issn.100-8551.2014.06.1070.

[3] 孫緒兵, 廖立敏, 付孝錦. 果膠改性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(20): 384-391. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.070.

[4] GROUDEVA J,KRATCHANOVA M G, PANCHEV I N, et al. Application of granulated apple pectin in the treatment of hyperlipoproteinaemia I. Deriving the regression equation to describe the changes[J]. European Food Reseach and Technology, 1997,204(5): 374-378. DOI:10.1007/s002170050093.

[5] NESTERENKO V B, NESTERENKO A V, BABENKO V I, et al.Reducing the137Cs-load in the organism of “Chernobyl” children with apple-pectin[J]. Swiss Medical Weekly, 2004, 134(12): 24-27.

[6] KUMAR A , CHAUHAN G S. Extraction and characterization of pectin from apple pomace and its evaluation as lipase (steapsin)inhibitor[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 82(2): 454-459.DOI:10.1016/j.carbpol.2010.05.001.

[7] WALDECKER M, KAUTENBURGER T, DAUMANN H, et al.Histone-deacetylase inhibition and butyrate formation: fecal slurry incubations with apple pectin and apple juice extracts[J]. Nutrition,2008, 24(4): 366-374. DOI:10.1016/j.nut.2007.12.013.

[8] DELPHI L, SEPEHRI H. Apple pectin: a natural source for cancer suppression in 4T1 breast cancer cells in vitro and express p53 in mouse bearing 4T1 cancer tumors, in vivo[J].Biomedicine & Pharmacotherapy, 2016, 84: 637-644. DOI:10.1016/j.biopha.2016.09.080.

[9] MARíN A P, ORTU?O J, AGUILAR M, et al. Use of chemical modif i cation to determine the binding of Cd (Ⅱ), Zn(Ⅱ) and Cr(Ⅲ)ions by orange waste[J]. Biochemical Engineering Journal, 2010,53(1): 2-6. DOI:10.1016/j.bej.2008.12.010.

[10] RAMACHANDRAN C, WILK B J, HOTCHKISS A, et al. Activation of human T-helper/inducer cell, T-Cytotoxic cell, B-cell, and natural killer (NK)-cells and induction of natural killer cell activity against K562 chronic myeloid leukemia cells with modif i ed citrus pectin[J].BMC Complementary and Alternative Medicine, 2011, 11(1): 59.DOI:10.1186/1472-6882-11-59.

[11] HUANG P H, LU H T, WANG Y T, et al. Antioxidant activity and emulsion -stabilizing effect of pectic enzyme treated pectin in soy protein isolate-stabilized oil/water emulsion[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(17): 9623-9628. DOI:10.1021/jf202020t.

[12] 張燕燕, 木泰華, 張苗. 改性甘薯果膠對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(9): 1798-1806. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.015.

[13] LECLERE L, VAN CUTSEM P, MICHIELS C. Anti-cancer activities of pH-or heat-modif i ed pectin[J]. Frontiers in Pharmcacology, 2013, 4:1-8. DOI:10.3389/fphar.2013.00128.

[14] KIM Y, KIM Y S,YOO S H, et al. Molecular structural differences between low methoxy pectins induced by pectin methyl esterase II:effects on texture, release and perception of aroma in gels of similar modulus of elasticity[J]. Food Chemistry, 2014, 145(1): 950-955.DOI:10.1016/j.foodchem.2013.09.003.

[15] NANGIA-MAKKER P, HOGAN V, HONJO Y, et al. Inhibition of human cancer cell growth and metastasis in nude mice by oral intake of modif i ed citrus pectin[J]. Journal of the National Cancer Institute,2002, 94(24): 1854-1862. DOI:10.1093/jnci/94.24.1854.

[16] YAN J, KATZ A. PectaSol-C modif i ed citrus pectin induces apoptosis and inhibition of proliferation in human and mouse androgendependent and–independent prostate cancer cells[J]. Integrative Cancer Therapies, 2010, 9(2): 197-203. DOI:10.1177/1534735410369672.

[17] 張文博, 劉長(zhǎng)忠, 高林. 改性柑橘果膠的制備、表征及抗癌活性[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 31(5): 964-969. DOI:10.1063/1.2432408.

[18] 戴少慶, 李高陽(yáng), 蘇東林, 等. 柑橘果膠的提取及其改性方法的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(16): 376-379.

[19] 蘇東林, 戴少慶, 李高陽(yáng), 等. 柑橘果膠磷酸化制備工藝優(yōu)化及其改性品質(zhì)分析[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2015, 15(8): 127-135. DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.08.019.

[20] ZHANG T, LAN Y, ZHENG Y, et al. Identif i cation of the bioactive components from pH-modif i ed citrus pectin and their inhibitory effects on galectin-3 function[J]. Food Hydrocolloids, 2016, 58: 113-119.DOI:10.1016/j.foodhyd.2016.02.020.

[21] LECLERE L, FRANSOLET M, CAMBIER P, et al. Identif i cation of a cytotoxic molecule in heat-modif i ed citrus pectin[J]. Carbohydrate Polymers, 2016, 137: 39-51. DOI:10.1016/j.carbpol.2015.10.055.

[22] 魏子淏, 楊偉, 劉夫國(guó), 等. 改性柑橘果膠研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品添加劑, 2014(3): 194-200. DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2014.03.025.

[23] PIENTA K J, NAILK H, AKHTAR A, et al. Inhibition of spontaneous metastasis in a rat prostate cancer model by oral administration of modified citrus pectin[J]. Journal of the National Cancer Institute,1995, 87(5): 348-353. DOI:10.1093/jnci/87.5.348.

[24] 尹穎, 陸勝民, 陳劍兵, 等. 柑橘皮渣制備低分子果膠及其抗癌活性的評(píng)價(jià)[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 25(3): 614-618. DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2013.03.35.

[25] BLUMENKRANTZ N, ASBOE-HANSEN G. New method for quantitative determination of uronic acids[J]. Analytical Biochemistry,1973, 54(2): 484-489. DOI:10.1016/0003-2697(73)90377-1.

[26] 葉興乾, 陳健樂(lè), 金妙仁, 等. 果膠改性方法及生物學(xué)作用機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2015, 15(7): 1-9. DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.07.001.

[27] FRAEYE I, DE ROECK A, DUVETTER T, et al. Influence of pectin properties and processing conditions on thermal pectin degradation[J]. Food Chemistry, 2007, 105(2): 555-563. DOI:10.1016/j.foodchem.2007.04.009.

[28] XU Y F, SONG S, WEI Y X, et al. Sulfated modification of the polysaccharide from Sphallerocarpus gracilis and its antioxidant activities[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2016, 87: 180-190. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2016.02.037.

[29] 李俠, 徐博, 孫江, 等. 糙米黃酮的提取及對(duì)羥自由基的清除作用[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 36(3): 347-351. DOI:10.13327/j.jjlau.2014.2141.

[30] 項(xiàng)惠丹, 許時(shí)嬰, 王璋等. 蛋白質(zhì)與還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(7): 52-57. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2008.07.005.

[31] LI B, LIU S, XING R, et al. Degradation of sulfated polysaccharides from Enteromorpha prolifera and their antioxidant activities[J].Carbohydrate Polymers, 2013, 92(2): 1991-1996. DOI:10.1016/j.carbpol.2012.11.088.

[32] SHI M J, WEI X Y, XU J, et al. Carboxymethylated degraded polysaccharides from Enteromorpha prolifera: preparation and in vitro antioxidant activity[J]. Food Chemistry, 2017, 215: 76-83.DOI:10.1016/j.foodchem.2016.07.151.

[33] ZHANG H, LI J, XIA J, et al. Antioxidant activity and physicochemical properties of an acidic polysaccharide from Morinda officinalis[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2013, 58: 7-12. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2013.03.031.

[34] LI X Y, WANG L, WANG Y, et al. Effect of drying method on physicochemical properties and antioxidant activities of Hohenbuehelia serotina polysaccharides[J]. Process Biochemistry, 2016, 51(8): 1100-1108. DOI:10.1016/j.procbio.2016.05.006.

[35] VAN DER WERF R, MARCIC C, KHALIL A, et al. ABTS radical scavenging capacity in green and roasted coffee extracts[J]. LWTFood Science and Technology, 2014, 58(1): 77-85. DOI:10.1016/j.lwt.2014.02.053.

[36] YUAN Q X, XIE Y F, WANG W, et al. Extraction optimization,characterization and antioxidant activity in vitro of polysaccharides from mulberry (Morus alba L.) leaves[J]. Carbohydrate Polymers,2015, 128: 52-62. DOI:10.1016/j.carbpol.2015.04.028.

[37] PLANO D, BAQUEDANO Y, IBá?EZ E, et al. Antioxidantprooxidant properties of a new organoselenium compound library[J]. Molecules, 2010, 15(10): 7292-7312. DOI:10.3390/molecules15107292.

[38] JIN L, GUAN X, LIU W, et al. Characterization and antioxidant activity of a polysaccharide extracted from Sarcandra glabra[J].Carbohydrate Polymers, 2012, 90(1): 524-532. DOI:10.1016/j.carbpol.2012.05.074.

Characterization and Antioxidant Activity of Modif i ed Apple Pectin

MA Liping1,2, JIAO Kunpeng1,2, LUO Lei1,2, XIANG Jinle1,2, DANG Xiaoxiao1，ZHU Wenxue1,2,*
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;2. Henan Engineering Research Center of Food Material, Luoyang 471023, China)

From commercially available apple pectin, pH-modified and heat-modified pectin were prepared through pH modif i cation and high-pressure steam treatment, respectively. The physical and chemical properties of native and modif i ed apple pectin were investigated, and further, their antioxidant activity was examined. The results showed that galacturonic acid contents of pH-modified and heat-modified pectin increased from (683.92 ± 4.51) mg/g to (910.61 ± 1.08) and(780.19 ± 5.68) mg/g, respectively, and the degree of esterif i cation was reduced from (77.26 ± 1.20)% to (35.48 ± 1.90)%and (33.67 ± 1.28)%, respectively as compared to the native one. The molecular weight of pectin reduced and the contents of polyphenol and protein were reduced (to less than 3 and 7 mg/g, respectively) after modification. The scavenging activity of all three apple pectins against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, hydroxyl, 2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt and superoxide anion free radicals was enhanced with their increasing concentration,and pH modif i cation could contribute to improving the antioxidant activity of pectin, which may be related to its increased galacturonic acid content.

modif i cation; apple pectin; pectin characterization; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201723020

TS255.4

A

1002-6630（2017）23-0121-08

馬麗蘋, 焦昆鵬, 羅磊, 等. 改性蘋果果膠性質(zhì)及抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(23): 121-128.

10.7506/spkx1002-6630-201723020. http://www.spkx.net.cn

MA Liping, JIAO Kunpeng, LUO Lei, et al. Characterization and antioxidant activity of modif i ed apple pectin[J]. Food Science,2017, 38(23): 121-128. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723020. http://www.spkx.net.cn

2016-09-16

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（16A550002）；河南科技大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（13480047）

馬麗蘋（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苁称费芯颗c開發(fā)。E-mail：maliping226@163.com

*通信作者：朱文學(xué)（1967—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称芳庸づc功能食品。E-mail：zwx@haust.edu.cn