許先猛，董文賓*

（1.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710021；2.運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院有機(jī)食品工程系，山西 運(yùn)城 044000）

豬皮膠原多肽螯合鈣增加大鼠骨密度

許先猛1,2，董文賓1,*

（1.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710021；2.運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院有機(jī)食品工程系，山西 運(yùn)城 044000）

以實驗室制備的豬皮膠原多肽（collagen polypeptide，CP）和葡萄糖酸鈣為原料，采用液體反應(yīng)法合成膠原多肽螯合鈣（calcium-binding CP，CP-Ca），并評價CP-Ca增加SD大鼠骨密度（bone mineral density，BMD）作用。將120 只斷乳雌性4 周齡SD大鼠隨機(jī)分為10 組：1）對照組（灌胃去離子水）；2）低、中、高劑量CP-Ca組（139.28、278.55、557.10 mg/（100 g·d））；3）低、中、高劑量CaCO3組（25、50、100 mg/（100 g·d））；4）低、中、高劑量CP+CaCO3組（139.28 mg/（100 g·d）CP+25 mg/（100 g·d）CaCO3、278.55 mg/（100 g·d）CP+50 mg/（100 g·d）CaCO3、557.10 mg/（100 g·d）CP+100 mg/（100 g·d）CaCO3）。所有實驗大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，自由飲用去離子水。實驗過程中，每周測定大鼠的體質(zhì)量和身長，灌胃第4周做3 d鈣代謝實驗。測定大鼠血清鈣（S-Ca）、血清磷（S-P）濃度、堿性磷酸酶（alkaline phosphatese，ALP）活力、大鼠BMD和骨鈣含量，并對大鼠股骨進(jìn)行掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）分析。結(jié)果顯示，中、高劑量CP-Ca組和高劑量CP+CaCO3組可以顯著促進(jìn)大鼠體質(zhì)量增加和發(fā)育（p＜0.05），CP-Ca效果更為明顯。CP-Ca組和CP+CaCO3組的ALP活力顯著低于對照組（p＜0.05），而中、高劑量CP-Ca組和中、高劑量CP+CaCO3組BMD顯著高于對照組（p＜0.05），且高劑量CP-Ca組高于對應(yīng)劑量CP+CaCO3組，各劑量CP-Ca組和CP+CaCO3組鈣表觀吸收率分別高于對應(yīng)CaCO3組，CP-Ca具有促進(jìn)大鼠骨生長、發(fā)育、骨鈣沉積的作用。SEM結(jié)果顯示，CP-Ca和CP+CaCO3能夠預(yù)防和改善大鼠因長期鈣攝入不足引起的骨質(zhì)疏松癥。CP-Ca溶解性高、解離性好，富含鈣元素及多肽，具有預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、增加骨質(zhì)密度的作用。

豬皮明膠；多肽螯合鈣；SD大鼠；骨密度

人和動物體內(nèi)所有組織和體液中都存在著大量的礦物質(zhì)，礦物質(zhì)是人和動物體必不可少的組成部分并且參與所有的生理活動[1]。其中，鈣是體內(nèi)含量最多的礦物質(zhì)元素之一，參與多種體內(nèi)生命活動[2-3]，鈣元素的缺乏會引發(fā)一系列疾病，例如骨質(zhì)疏松等[4-5]。目前，世界上約有2億 人患有骨質(zhì)疏松癥，中國約有近9 000萬患者，患病人口多，發(fā)病率高[6]。骨質(zhì)疏松容易使骨脆性增加，易發(fā)生骨折，對人體健康危害性較大。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國人群鈣攝入量偏低[7]。我國市場流通鈣制劑約2 700 種，但普遍存在生物利用度低的現(xiàn)象[8]。研究表明，骨質(zhì)中膠原含量高達(dá)80%，骨膠原與鈣元素合理的補(bǔ)充和配比對骨質(zhì)疏松等骨質(zhì)疾病有著很好的預(yù)防作用[9-12]。近年來，膠原、多肽以及多肽生物鈣制劑受到越來越多的學(xué)者關(guān)注，并證實了多肽與鈣螯合后可以有效提高其生物利用度[13-14]。Bao Xiaolan等[15]研究了多肽分子質(zhì)量與鈣螯合的關(guān)系，李彥春等[16]證明了多肽鈣制劑補(bǔ)鈣效果明顯優(yōu)于普通補(bǔ)鈣制劑，菅景穎[17]、張根生[18]等證明了多肽鈣制劑能夠預(yù)防大鼠骨質(zhì)疏松癥。

明膠生產(chǎn)的原料來源豐富，包括豬皮（46%）、牛皮（29.4%）以及豬和牛骨（23.1%）等[19]。我國豬皮年產(chǎn)豬皮產(chǎn)量超過5 400 kt[20]，其中一部分用于食品級明膠的生產(chǎn)。本課題組以食品級豬皮明膠為原料，經(jīng)復(fù)合酶酶解后采用超濾方法制備分子質(zhì)量小于5 ku的膠原多肽（collagen polypeptide，CP），多肽與葡萄糖酸鈣螯合制得膠原多肽螯合鈣（calcium-binding CP，CP-Ca）；以斷乳SD大鼠為模型，研究分別攝入CP-Ca或CP與CaCO3混合物時大鼠體內(nèi)鈣吸收率以及大鼠骨密度（bone mineral density，BMD）的變化，探索CP-Ca在大鼠體內(nèi)的吸收機(jī)制，研究CP-Ca增加大鼠BMD的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

斷乳雌性4 周齡SD大鼠，體質(zhì)量70 g左右，由中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（軍）2012-0007。

食品級豬皮明膠購于山東淄博寶恩生物科技有限公司。

葡萄糖酸鈣 浙江康普達(dá)生物科技有限公司；CP、CP-Ca 陜西科技大學(xué)功能食品開發(fā)實驗室；CaCO3美國SMI公司；血清鈣（S-Ca）檢測試劑盒、血清磷（S-P）檢測試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatese，ALP）活力檢測試劑盒 南京建成生物工程生物研究所；HCl、NaOH、95%乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AAS Zeenit 700原子吸收分光光度計 德國Analytik Jena公司；S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本Hitachi公司；754型紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜分析儀 德國Bruker公司；D/max2200PC-X射線衍射儀 日本Rigaku公司；QDR 4500雙能X射線吸收儀 美國Hologic公司；微量移液器 芬蘭Dragonmed公司；真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；BS-224型電子天平 德國Sartorius公司；HH-Z2恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 豬皮CP粉末制備

[20]的方法，采用復(fù)合酶水解制備CP。處理后的酶解液采用超濾系統(tǒng)制備分子質(zhì)量小于5 ku的多肽溶液，濃縮后凍干，制備多肽粉末。

1.3.2 CP-Ca制備

參考文獻(xiàn)[21]的方法，采用液體反應(yīng)法合成CP-Ca，經(jīng)測定鈣含量為7.18%。

1.3.3 動物實驗

選取4 周齡大SD雌性大鼠120 只，飼養(yǎng)溫度（20±1）℃，相對濕度（60±5）%，燈光維持12 h/12 h光暗交替周期。飼養(yǎng)過程中小鼠自由進(jìn)食基礎(chǔ)飼料和自由飲用去離子水。基礎(chǔ)飼料配制依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》配方[22]：10.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）酪蛋白、15.0%黃豆粉、54.0%小麥面粉、4.0%花生油、10.0%紫花苜蓿纖維素、5.0%鹽混合物、1.0%維生素混合物、0.2%氯化膽堿、0.2% DL-蛋氨酸、11.0%淀粉等。調(diào)整基礎(chǔ)飼料鈣含量為150 mg/100 g，高壓熟化，備用。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，120只SD雌性大鼠隨機(jī)分為10 組，即對照組：灌胃去離子水；CP-Ca低、中、高劑量組：分別灌胃139.28、278.55、557.10 mg/（100 g·d）CP-Ca；CaCO3低、中、高劑量組：分別灌胃25、50、100 mg/（100 g·d）CaCO3；CP+CaCO3低、中、高劑量組：各組灌胃CP-Ca、CaCO3劑量分別為139.28、25 mg/（100 g·d），278.55、50 mg/（100 g·d），557.10、100 mg/（100 g·d）。攝入劑量計算基于成人每日鈣的建議攝入量（800～1 200 mg/60 kg）的5、10、20 倍。

1.3.4 大鼠體質(zhì)量、身長測定

大鼠禁食12 h后測量體質(zhì)量，每周測一次并記錄。同時測量大鼠身長（大鼠兩耳中間位置至大鼠尾根的自然長度）。

1.3.5 大鼠鈣代謝表觀吸收率測定

大鼠連續(xù)灌胃4 周后進(jìn)行3 d鈣代謝實驗，分別記錄3 d進(jìn)食和收集72 h糞便，每天測定糞便中鈣含量[23]，按下式計算鈣的表觀吸收率。

式中：m攝入鈣/mg＝飼料中鈣含量/%×飼料質(zhì)量/mg；m糞鈣/mg＝糞便中鈣含量/%×糞便排出量/mg。

1.3.6 血清中鈣、磷含量及ALP活力測定

飼養(yǎng)結(jié)束后，大鼠禁食24 h，眼球取血后4 ℃、2 000 r/min離心20 min提取血清。S-Ca、S-P含量和ALP活力通過標(biāo)準(zhǔn)比色方法進(jìn)行測定，按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3.7 大鼠BMD和骨鈣含量測定

大鼠灌胃3 個月后處死，剝離出左、右側(cè)股骨，于105 ℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量，采用雙能X射線吸收儀測量右側(cè)股骨中點(diǎn)及遠(yuǎn)心端BMD；采用原子吸收分光光度法測定股骨鈣含量[23]。

1.3.8 大鼠股骨觀察

將處理后大鼠左股骨固定于SEM樣盤，噴金鍍膜，施加電壓，聚焦清晰后獲取放大100 倍圖像，觀察股骨表面的變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件處理，實驗結(jié)果以 ±s表示，經(jīng)單因素方差分析（One way-ANOVA）進(jìn)行組間差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 CP-Ca對大鼠體質(zhì)量和身長的影響

表1 CP-Ca對大鼠體質(zhì)量和身長的影響Table 1 Body weight and body length of SD rats from each group

所有組別大鼠初始體質(zhì)量和初始身長比較接近，在相同的環(huán)境下給予相同的基礎(chǔ)飼料，自由攝入去離子水。由表1可知，各組大鼠的體質(zhì)量和身長均有不同程度的增長。所有實驗組別大鼠體質(zhì)量都高于對照組，并且CP-Ca中、高劑量組和CP+CaCO3高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著高于空白組（p＜0.05）。鈣攝入量是否合理，尤其是攝入合理的鈣磷比可以有效促進(jìn)大鼠體質(zhì)量的增加和骨骼發(fā)育[24]。而各組之間大鼠身長無顯著性差異。

2.2 CP-Ca對大鼠S-Ca、S-P濃度和ALP活力影響

表2 CP-Ca對大鼠S-Ca、S-P濃度和ALP活力的影響Table 2 Effect of CP-Ca on serum calcium, phosphorus contents and ALP activity of SD rats from each group

由表2可見，各組S-Ca和S-P濃度無顯著差異。ALP是成骨細(xì)胞分化成熟的一種標(biāo)志性酶，能夠準(zhǔn)確反映成骨細(xì)胞分化和成熟[25]。饒華等[26]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠服用0.5、1.5 g/kg杜仲葉總提取物具有治療骨質(zhì)疏松的作用，且大鼠ALP活力分別降低26.7%、49.6%。本實驗各組ALP活力都顯著低于對照組（p＜0.05），高劑量CP-Ca、CP+CaCO3和CaCO3分別使大鼠ALP活力降低48.7%、40.9%、46.5%，因此CP-Ca、CP+CaCO3和CaCO3均可以起到促進(jìn)大鼠骨生長和發(fā)育的作用。

2.3 CP-Ca對大鼠BMD、骨鈣含量和鈣表觀吸收率的影響

表3 CP-Ca對大鼠BMD、骨鈣含量和鈣表觀吸收率的影響Table 3 Effect of CP-Ca on BMD, bone calcium content and apparent calcium absorption rate of rats

由表3可知，各實驗組BMD和骨鈣含量都高于對照組，對照組的鈣攝入量不足導(dǎo)致大鼠BMD和骨鈣含量偏低。CP-Ca中、高劑量組和CP+CaCO3中、高劑量組BMD顯著高于對照組（p＜0.05），且高于對應(yīng)CaCO3組，CP-Ca高劑量組高于對應(yīng)劑量CP+CaCO3組，因多肽以及多肽生物鈣具備提高鈣元素在大鼠體內(nèi)生物利用度的作用[13-14]。CaCO3高劑量組BMD顯著高于對照組（p＜0.05），CaCO3一般情況下與飲食共同攝入吸收率較好，如飲食中蛋白質(zhì)的攝入量升高10 g相應(yīng)的鈣吸收率升高0.007 6[28-29]。CP-Ca高劑量組和CP+CaCO3高劑量組骨鈣含量顯著高于對照組（p＜0.05），在鈣攝入量充足且吸收率較高的情況下，可以形成有效的骨鈣沉積。結(jié)果顯示，對照組鈣表觀吸收率顯著高于實驗組，這主要是由于當(dāng)大鼠機(jī)體處于嚴(yán)重缺鈣的情況下，大鼠鈣生物利用度會大大增高[30]。各劑量CP-Ca組和CP+CaCO3組鈣表觀吸收率分別高于對應(yīng)CaCO3組，這主要是由于多肽鈣攝入體內(nèi)后以Ca2+形式存在，容易被大鼠吸收，同時含有一定量CP能夠有效促進(jìn)鈣吸收[11,31]。

2.4 大鼠股骨SEM觀察結(jié)果

由圖1可見，CP-Ca高劑量組、CaCO3高劑量組和CP+CaCO3高劑量組大鼠股骨表面有較為明顯的蜂窩狀，這是由于成骨細(xì)胞表現(xiàn)活躍的結(jié)果[16]，且CP-Ca高劑量組大鼠股骨表面蜂窩狀較CaCO3高劑量組和CP+CaCO3高劑量組更為規(guī)則和明顯。在對照組中，大鼠股骨表面無蜂窩狀，但不規(guī)則的分布一些大小不一的小孔，這是因為對照組大鼠長期處與鈣攝入不足的條件下，一定程度上出現(xiàn)了骨質(zhì)疏松癥而體現(xiàn)出來的現(xiàn)象。結(jié)果證實，CP-Ca和CP+CaCO3具有預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，增加BMD的作用。

圖1 大鼠股骨SEM圖Fig. 1 SEM of femur in rats

3 結(jié) 論

本實驗采用復(fù)合酶水解豬皮明膠制備CP，以多肽和葡萄糖酸鈣為原料采用液體反應(yīng)法合成CP-Ca，經(jīng)測定，鈣含量為7.18%。鈣是人體內(nèi)非常重要的營養(yǎng)素，對人體的生命活動起著至關(guān)重要的作用。CP-Ca因其溶解性和解離性好、小肽具備促進(jìn)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)等作用，鈣在人體內(nèi)吸收率較普通鈣制劑高。通過大鼠實驗對制備的CP-Ca增加BMD和補(bǔ)鈣功能進(jìn)行評價，所有實驗大鼠喂以基礎(chǔ)飼料，自由飲用去離子水，對照組灌胃去離子水，實驗組分別灌胃低、中、高3 個劑量CP-Ca、CaCO3、CP+CaCO3。實驗測定了大鼠的體質(zhì)量、身長、S-Ca鈣及S-P濃度、ALP活力、BMD、骨鈣含量、鈣表觀吸收率，并對大鼠股骨進(jìn)行SEM觀察分析。結(jié)果表明，CP-Ca、CP+CaCO3具備促進(jìn)大鼠體質(zhì)量和骨骼生長的作用，能夠促進(jìn)骨生長和發(fā)育。CP-Ca被大鼠攝入體內(nèi)后，Ca2+能夠有效解離，同時CP具備促進(jìn)鈣吸收的作用，CP-Ca攝入量為139.28、278.55、557.10 mg/（100 g·d）時鈣表觀吸收率較攝入相同劑量CaCO3的鈣攝入量增加3.53%、8.16%、7.57%。CP-Ca具有預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、增加BMD的作用，本課題組將對CP-Ca在動物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和病理毒理學(xué)進(jìn)行深入研究。

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Calcium-Binding Collagen Polypeptide from Pigskin Gelatin Improves Bone Mineral Density in Rats

XU Xianmeng1,2, DONG Wenbin1,*
(1. College of Chemistry and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China;2. Department of Organic Food Engineering, Yuncheng Polytechnic College, Yuncheng 044000, China)

In this paper, calcium-binding collagen polypeptide (CP-Ca) was synthesized by liquid-state reaction between collagen polypeptide prepared in our laboratory from pigskin gelatin and calcium gluconate, and the effect of CP-Ca on improving bone mineral density (BMD) in rats was investigated. Totally 120 female SD rats were equally divided into 10 groups: control group (deionized water by gavage), low-, middle- and high-dosage CP-Ca groups (139.28, 278.55 and 557.10 mg/(100 g·d)), low-, middle- and high-dosage CaCO3groups (25, 50 and 100 mg/(100 g·d)), and low-,middle- and high-dosage CP + CaCO3group (139.28 mg /(100 g·d) CP + 25 mg/(100 g·d) CaCO3, 278.55 mg/(100 g·d)CP + 50 mg/(100 g·d) CaCO3, 557.10 mg/(100 g·d) CP + 100 mg/(100 g·d) CaCO3). All rats were fed on a basic diet and deionized water. The body weight and length of the rats were recorded weekly. A three-day calcium metabolism experiment was carried out in the fourth week to estimate the apparent absorptivity of calcium. Serum calcium (SCa), serum phosphorusand (S-P), and alkaline phosphatese (ALP), BMD and bone calcium content were measured. The rat femurs were analyzed by scanning electron microscope (SEM). The results showed that CP-Ca at middle and high dosages and CP + CaCO3at high dosage could signif i cantly promote body weight gain (P ＜ 0.05), and the effect of CPCa was more apparent. CP-Ca and CP + CaCO3had obviously lower ALP activity than the control group (P ＜ 0.05).CP-Ca and CP + CaCO3both at middle and high dosages significantly raised BMD compared to the control group(P ＜ 0.05), and CP-Ca was more effective at the high dosage. At all dosages tested, CP-Ca and CP + CaCO3resulted inhigher Ca bioavailability than CaCO3. CP-Ca could activate osteoblasts on the surface of bones, increase the density of bones and reduce bone calcium loss. Meanwhile, SEM revealed that CP-Ca and CP + CaCO3could prevent and improve osteoporosis caused by long-term calcium def i ciency. CP-Ca was highly soluble, exhibited good dissociation ability, and was rich in calcium and polypeptides so than it can be used in functional foods and health products to prevent osteoporosis and improve BMD.

pigskin gelatin; calcium-binding collagen polypeptide (CP-Ca); SD rats; bone mineral density (BMD)

2016-09-06

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD12B07-05）

許先猛（1984—），男，講師，博士，研究方向為功能食品開發(fā)。E-mail：xuxianmeng@sina.com

*通信作者：董文賓（1951—），男，教授，碩士，研究方向為食品安全性與新材料制備。E-mail：dongwb@sust.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201723030

TS251.92

A

1002-6630（2017）23-0191-05

許先猛, 董文賓. 豬皮膠原多肽螯合鈣增加大鼠骨密度[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(23): 191-195.

10.7506/spkx1002-6630-201723030. http://www.spkx.net.cn

XU Xianmeng, DONG Wenbin. Calcium-binding collagen polypeptide from pigskin gelatin improves bone mineral density in rats[J]. Food Science, 2017, 38(23): 191-195. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723030.http://www.spkx.net.cn