王 敏，劉媛媛，周 帆，姜婷婷，鄭 旭，張 靖，時翠平，邢繼紅，董金皋

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001)

灰葡萄孢(Botrytiscinerea)是一種死體營養(yǎng)型植物病原真菌，其寄主范圍廣泛，可引起蔬菜、水果等200多種植物的灰霉病，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。目前，灰霉病預(yù)防以化學(xué)藥劑為主，但其連續(xù)使用，易使病菌產(chǎn)生抗藥性，且危害人畜安全，對環(huán)境造成壓力，嚴(yán)重破壞生態(tài)平衡[4-5]。因此，尋找一種快速抑制病原菌、特異性強(qiáng)、對環(huán)境友好的新型生物殺菌劑迫在眉睫[6]。犬尿氨酸單加氧酶(Kynurenine 3-monooxygenase，KMO)是NADPH依賴的黃素蛋白羥化酶，位于犬尿氨酸途徑的中心。KMO催化犬尿氨酸在它的酚環(huán)第3位羥基化，生成3-羥基犬尿氨酸(3-HK)[7-9]。犬尿氨酸途徑主要存在于色氨酸分解代謝，廣泛存在于真核生物和原核生物中。犬尿氨酸代謝產(chǎn)生一些生物活性中間體，帶有不同生理行為，參與各種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)理，包括阿爾茨海默病、帕金森癥和亨廷頓疾病[10-11]。近年來，在一些微生物中也發(fā)現(xiàn)了類似的犬尿氨酸途徑，如熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和哈氏噬纖維菌(Cytophagahutchinsonii)[12-14]、綠膿單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[15]、金羊毛鏈霉菌(Streptomyceschrysomallus)[16]，犬尿氨酸途徑在安曲霉素生物合成中起重要作用[17]。由此，筆者推測灰葡萄孢中也存在犬尿氨酸途徑[18]。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期研究中，克隆了灰葡萄孢BcKMO基因，明確了BcKMO正調(diào)控灰葡萄孢的生長、發(fā)育，負(fù)調(diào)控灰葡萄孢的致病力[19]；確定了BcKMO通過調(diào)控灰葡萄孢的胞壁降解酶活性、毒素活性、產(chǎn)酸能力及致病相關(guān)基因的表達(dá)而影響病菌的致病力[20]。但是BcKMO基因編碼產(chǎn)物的功能及其與病菌致病力調(diào)控之間的關(guān)系尚未明確。因此，本試驗(yàn)對灰葡萄孢BcKMO基因進(jìn)行原核表達(dá)分析，獲得純化的BcKMO蛋白，為下一步的酶活力測定及其互作蛋白的篩選奠定基礎(chǔ)，并為闡明單加氧酶及其所在的犬尿氨酸途徑與病菌致病力之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

灰葡萄孢野生型菌株BC22由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α和BL21、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；pMD19-T載體、pGEX4T-1載體購自Pharmacia Biotech公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)BcKMO基因序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計兩端帶有NotⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物yhKMO-F(5′-ATAAGAATGCGG CCGCATGCCGTCCTTGTTGATC-3′)和yhKMO-R(5′-TCCCCCGGGAATGTCTGCACCATCCTCTAAAG-3′)。其中下劃線的部分分別是NotⅠ和SmaⅠ的酶切位點(diǎn)。

1.2.2BcKMO基因的克隆 以灰葡萄孢野生型菌株BC22為試材，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用高保真Taq酶擴(kuò)增BcKMO基因。PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 2 μL、yhKMO-F(10 μmol/L) 0.5 μL、yhKMO-R(10 μmol/L) 0.5 μL、LATaq酶0.5 μL、10×LA PCR Buffer Ⅱ 2.5 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL、ddH2O 18 μL，共25 μL。經(jīng)PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶回收后與載體pMD19連接，連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆測序正確后進(jìn)行質(zhì)粒pMD19-T-BcKMO的提取。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 用NotⅠ和SmaⅠ分別對pMD19-T-BcKMO和pGEX4T-1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收目的片段后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR、酶切驗(yàn)證及測序驗(yàn)證后，確定原核表達(dá)載體pGEX4T-1-BcKMO-GST構(gòu)建成功。將pGEX4T-1-BcKMO-GST和pGEX4T-1分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，確定陽性克隆進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.4 不同濃度的IPTG誘導(dǎo)對BcKMO蛋白表達(dá)的影響 將轉(zhuǎn)化了pGEX4T-1-BcKMO-GST和pGEX4T-1的大腸桿菌BL21分別在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，37 ℃轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)至OD600約為0.7，分別加入不同濃度的IPTG至終濃度為0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mmol/L，28 ℃誘導(dǎo)14 h，收集菌體，棄上清，用pH值8.8 Tris-HCl和5×SDS-PAGE Loading Buffer重懸沉淀，沸水浴10 min，離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE，檢測目的蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)而確定最適IPTG誘導(dǎo)濃度。

1.2.5 不同誘導(dǎo)時間對BcKMO蛋白表達(dá)的影響 利用上述得到的最適IPTG誘導(dǎo)濃度，28 ℃誘導(dǎo)pGEX4T-1-BcKMO-GST和pGEX4T-1的表達(dá)，誘導(dǎo)時間分別為4，8，12，16，20 h，收集菌體，提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE，確定誘導(dǎo)表達(dá)的最佳時間。

1.2.6 BcKMO蛋白的純化 利用上述得到的最適IPTG誘導(dǎo)濃度和最佳誘導(dǎo)時間，在28 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，棄上清，用pH值8.8 Tris-HCl重懸菌體沉淀，加入蛋白酶抑制劑，利用超聲細(xì)胞破碎儀破碎菌體，超聲功率100 W，工作10 s，間歇20 s，循環(huán)30次，離心收集上清，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用ProteinIsoTMGST Resin對收集的上清進(jìn)行目的蛋白的純化，取1 mL GST beads加入20 mL Binding Buffer (50 mmol/L Tris-HCl pH值8.0，150 mmol/L NaCl)進(jìn)行平衡，4 ℃混勻10 min，700 r/min離心5 min，棄上清，加入20 mL Binding Buffer重懸，重復(fù)洗3次，棄上清，冰上備用；將菌體上清加入上述平衡的GST beads，4 ℃混勻2 h，700 r/min離心5 min，棄上清，留沉淀；向沉淀中加入20 mL Binding Buffer(含0.1% TritonX-100)，4 ℃混勻10 min，700 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌2次，棄上清，留沉淀；向沉淀中加入500 μL洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH值8.0，10 mmol/L 谷胱甘肽)，4 ℃混勻1 h，700 r/min離心5 min，收集洗脫液，重復(fù)洗2次，分別得到洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE，檢測目的蛋白的純化情況。

1.2.7 Western Blot分析 利用Western Blot技術(shù)，對目的蛋白進(jìn)行檢測。分別將純化后的蛋白和菌體的全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，利用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，用PBST洗滌4次，按1∶1 000加入GST Tag Antibody，雜交1 h，用PBST洗滌4次，每次5 min，按1∶10 000加入goat anti-mouse HRP antibody，雜交1 h，用PBST洗滌5次，每次5 min，然后在PVDF膜上加入Western Blot發(fā)光檢測液A、B混合液1 mL，用保鮮膜封好，放在暗匣內(nèi)，在暗室進(jìn)行顯影[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BcKMO基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

提取灰葡萄孢野生型菌株BC22總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用高保真Taq酶擴(kuò)增BcKMO基因(圖1-A)?；厥誔CR擴(kuò)增產(chǎn)物，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到pMD19-T-BcKMO陽性克隆。用NotⅠ和SmaⅠ進(jìn)行酶切檢測，獲得了2條與目的片段大小一致的條帶(圖1-B)，表明BcKMO基因已連接pMD19-T載體。將pGEX4T-1載體和測序正確的pMD19-T-BcKMO載體分別進(jìn)行NotⅠ和SmaⅠ雙酶切，回收目的片段，用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過酶切驗(yàn)證獲得了與目的條帶大小一致的條帶(圖1-C)，表明原核表達(dá)載體pGEX4T-1-BcKMO-GST構(gòu)建成功。

2.2 不同濃度的IPTG誘導(dǎo)對BcKMO蛋白表達(dá)的影響

為確定IPTG誘導(dǎo)使用的最適濃度，37 ℃轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至OD600約為0.7，分別加入不同濃度的IPTG至終濃度為0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mmol/L，28 ℃誘導(dǎo)14 h，收集菌體，以未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體為對照，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化pGEX4T-1載體的菌株經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)出約26 kDa的蛋白條帶，與GST蛋白大小一致(圖2-A)，而帶有pGEX4T-1-BcKMO-GST載體的菌株誘導(dǎo)表達(dá)出約71 kDa的蛋白條帶(圖2-B)，與融合蛋白大小一致(GST蛋白為26 kDa，BcKMO蛋白45 kDa)。當(dāng)IPTG濃度為0.1 mmol/L時，融合蛋白的表達(dá)水平較低；當(dāng)IPTG濃度為0.2～1.0 mmol/L時，融合蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(圖2-B)，由此確定IPTG誘導(dǎo)使用的最適濃度為0.2 mmol/L。

A.BcKMO基因的擴(kuò)增；B.pMD19-T-BcKMO載體的酶切鑒定；C.pGEX4T-1-BcKMO-GST載體的酶切鑒定。A.PCR amplification of BcKMO；B.Identification of pMD19-T-BcKMO by restriction enzyme digestion；C.Identification of pGEX4T-1-BcKMO-GST by restriction enzyme digestion.

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；A.誘導(dǎo)表達(dá)pGEX4T-1載體；1.IPTG未誘導(dǎo)；2.IPTG誘導(dǎo)GST蛋白；B.pGEX4T-1-BcKMO-GST的誘導(dǎo)表達(dá)；1.IPTG未誘導(dǎo)；2～6.IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mmol/L。M.Protein Marker；A.Expression of pGEX4T-1 with IPTG induction；1.Without IPTG；2.IPTG induces GST proteins；B.Expression of pGEX4T-1-BcKMO-GST with IPTG induction；1.Without IPTG；2-6.Expression of pGEX4T-1-BcKMO-GST with 0.1，0.2，0.4，0.8，and 1.0 mmol/L IPTG.

2.3 不同誘導(dǎo)時間對BcKMO蛋白表達(dá)的影響

使用0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)pGEX4T-1-BcKMO-GST表達(dá)，誘導(dǎo)時間分別為4，8，12，16，20 h，收集菌體，以未誘導(dǎo)的菌體作為對照，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同誘導(dǎo)時間下均可以誘導(dǎo)表達(dá)71 kDa的蛋白；當(dāng)誘導(dǎo)時間為0～12 h時，隨著誘導(dǎo)時間的延長，目的蛋白的表達(dá)水平逐漸增加；當(dāng)誘導(dǎo)時間為12～20 h時，目的蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(圖3)。由此確定，蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳時間為12 h。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.IPTG未誘導(dǎo)；2～6.IPTG誘導(dǎo)時間分別為4，8，12，16，20 h。M.Protein Marker；1.Without IPTG；2-6.Expression of BcKMO-GST with IPTG induction for 4，8，12，16，and 20 h.

2.4 BcKMO-GST蛋白的純化

利用上述得到的最佳誘導(dǎo)條件，進(jìn)行BcKMO-GST蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，并使用ProteinIsoTMGST Resin對收集的上清進(jìn)行蛋白的純化。純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，獲得了單一的蛋白條帶，大小與目的蛋白大小一致(圖4)，表明BcKMO-GST蛋白純化成功。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化的BcKMO-GST蛋白；2.純化之前的上清液。M.Protein Marker；1.Purified protein BcKMO-GST；2.Supernatant before purification.

2.5 BcKMO-GST蛋白的Western Blot分析

以GST Tag antibody為一抗，goat anti-mouse HRP antibody為二抗，對純化獲得的蛋白進(jìn)行Western Blot分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化的蛋白獲得了單一的陽性條帶，大小與目的蛋白大小(71 kDa)一致(圖5)，表明BcKMO蛋白體外誘導(dǎo)表達(dá)成功。

3 討論

外源基因在大腸桿菌體內(nèi)能否高效表達(dá)受到很多因素的影響和限制，如外源基因自身的理化性質(zhì)、大腸桿菌菌株的類別、所用表達(dá)載體種類、誘導(dǎo)物濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時間等[22]。一般誘導(dǎo)物選用IPTG[23]，低溫有利于增強(qiáng)蛋白的穩(wěn)定性和正確折疊，容易獲得可溶性的蛋白，而較高溫度則易形成包涵體[24]，不利于目的蛋白的純化，因此，本試驗(yàn)采用28 ℃長時間誘導(dǎo)，降低合成速度，使該蛋白具有充分的時間進(jìn)行折疊，使二硫鍵正確配對，使蛋白達(dá)到足夠的溶解度。本試驗(yàn)通過設(shè)置不同IPTG濃度和不同誘導(dǎo)時間進(jìn)行試驗(yàn)[25]，確定了pGEX4T-1-BcKMO-GST融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最適濃度和最佳時間。超聲破碎后使用GST親和的beads進(jìn)行目的蛋白的純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測和Western Blot分析確定BcKMO蛋白體外誘導(dǎo)表達(dá)成功。但是，蛋白純化的條件仍需進(jìn)一步優(yōu)化，進(jìn)而獲得更高含量的目的蛋白，為后續(xù)進(jìn)行該單加氧酶的酶活力測定及其互作蛋白的篩選奠定基礎(chǔ)。

文獻(xiàn)報道，犬尿氨酸單加氧酶的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)通過酶活性的初始速率測量獲得。KMO催化NADPH依賴的L-犬尿氨酸羥基化成為3-羥基犬尿氨酸，酶促反應(yīng)能通過接下來的NADPH在340 nm吸光度的降低來監(jiān)測。速率分析實(shí)施采用1 cm路徑長度石英微量吸收測定人KMO是37 ℃，釀酒酵母KMO是30 ℃[11]。GST pull-down試驗(yàn)可用于捕獲與靶蛋白相互作用的目的蛋白，從而證實(shí)2種蛋白之間的相互作用或篩選相應(yīng)的蛋白。試驗(yàn)后期擬利用Pull-down技術(shù)篩選BcKMO蛋白的互作蛋白，為闡明BcKMO及其所在的犬尿氨酸途徑與病菌致病力之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。