趙孟孟，馮麗麗，馮松林，馬紅芳，張二芹，王文佳，邢 星，張 雅，馮嘉萍，張桂紅

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；3. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州 450002；4.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 制藥工程學(xué)院，河南 鄭州 450046；5.廣西欽州保稅港區(qū)出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西 欽州 535008)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus， PRRSV)屬于套式病毒目(Nidovirales)、動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)、動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)成員[1-3]，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，同屬的還有馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)、鼠乳酸脫氫酶病毒(LDV)、猴出血熱病毒(SHFV)。其基因組長(zhǎng)度為15 kb，包含有10個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frame， ORFs)。從5′端到3′端依次為ORFla、ORFlab和ORF2～ORF7，每個(gè)ORF和其相鄰的ORF部分重疊。在其5′端和3′端分別有1個(gè)非編碼區(qū)，在5′端非編碼區(qū)前有1個(gè)“帽子”結(jié)構(gòu)，3′端非編碼區(qū)后有多聚腺苷酸尾巴[4-6]。ORF2～ORF7編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，其中ORF2～ORF5編碼病毒的糖基化蛋白，ORF6編碼膜基質(zhì)蛋白，ORF7編碼核衣殼蛋白。ORF1占病毒基因組的80%，編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural protein，Nsp)，參與病毒的復(fù)制。 ORF1a可繼續(xù)水解為Nsp1a、Nsp1b、Nsp2～Nsp6、Nsp7a、Nsp7b、Nsp8，ORFlab水解為Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12。

Nsp9基因位于ORFlb中，編碼RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase， RdRp)。RNA依賴(lài)的RNA聚合酶在所有正鏈RNA病毒中均編碼，進(jìn)而形成轉(zhuǎn)錄復(fù)制混合物的亞單位結(jié)構(gòu)[7]。前人研究報(bào)道，Nsp9基因與宿主蛋白視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白、膜聯(lián)蛋白A2、DEAD-box RNA解旋酶相互作用促進(jìn)病毒復(fù)制[8-10]，并且針對(duì)Nsp9基因的siRNA以及化合物可抑制病毒復(fù)制[11-16]，Nsp9基因相對(duì)其他病毒蛋白高度保守[17-18]，但強(qiáng)、弱毒株之間存在約12個(gè)氨基酸的突變，這些氨基酸的突變是否與病毒毒力和復(fù)制能力相關(guān)尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，Nsp9基因可以促進(jìn)PRRSV的復(fù)制[19]，但是強(qiáng)、弱毒株在促進(jìn)PRRSV復(fù)制方面是否存在差異未進(jìn)行研究。為此，本研究通過(guò)在Marc-145細(xì)胞上過(guò)表達(dá)PRRSV強(qiáng)、弱毒株XH-GD和CH-1R的Nsp9基因，探索強(qiáng)、弱毒株Nsp9基因?qū)Σ《镜膹?fù)制是否存在差異，為揭示強(qiáng)、弱毒株之間的致病機(jī)制差異奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞和培養(yǎng)基 Marc-145細(xì)胞由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)細(xì)胞所用DMEM購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，雙抗購(gòu)自Hyclone公司。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒、病毒 大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌種購(gòu)自天根生物科技有限公司(北京)；pIRES2-EGFP載體和PRRSV弱毒株CH-1R、強(qiáng)毒株XH-GD由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存(其中，PRRSV強(qiáng)毒株XH-GD為農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離到的強(qiáng)毒株，致病力強(qiáng)，其N(xiāo)sp2存在30個(gè)氨基酸的缺失；弱毒株CH-1R為商品化的疫苗毒株)。

1.1.3 主要試劑與儀器 Premix ExTaqDNA聚合酶、內(nèi)切酶XhoⅠ 和Hind Ⅲ，DL2000 Marker、SYBR?Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)購(gòu)自寶生物(大連)生物工程有限公司；凝膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司； TRIzol?試劑購(gòu)自Invitrogen公司；瓊脂糖購(gòu)自Biowest公司；溴化乙錠(EB)購(gòu)自寶泰克生物科技公司；EZNA Endo-Free Plasmid Mini Kit購(gòu)自O(shè)MEGA公司；裂解液RIPA購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；PRRSV Nsp9蛋白的單克隆抗體、PRRSV N蛋白單克隆抗體由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存， 3-磷酸甘油醛脫氫酶單克隆抗體(內(nèi)參抗體GAPDH)為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1Nsp9基因引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)PRRSVNsp9基因序列特征，應(yīng)用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)引物：上游引物(Nsp9P3-F)：5′-AGCTGTCGATTTAAACTGCTAGCCGCCAGCG-3′，劃線(xiàn)部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)。下游引物(Nsp9P4-R)：5′-ATAGGATCCCTCATGATTGGACCCTGAGTTTTTC-3′，劃線(xiàn)部分為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。PRRSV N蛋白熒光定量引物為qN-F：5′-AAACCAGTCCAGAGGCAAGG-3′，qN-R：5′-GCAAACTAAACTCCACAGTGTAA-3′，GAPDH熒光定量引物為GAPDH-F：5′-CTGCCGCCTGGAGAAACCT -3′，GAPDH-R：5′-GCTGTAGCCAAATTCATTGTCG-3′。上述引物均由上海立菲生物科技有限公司合成。

1.2.2 PRRSV RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 參照Invitrogen公司TRIzol?說(shuō)明書(shū)提取XH-GD毒株和CH-1R毒株的RNA，反轉(zhuǎn)錄參照寶生物工程(大連)有限公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：RNA 9.5 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，5×MLV Buffer 4.0 μL，dNTPs 4.0 μL，M-MLV 1.0 μL，反轉(zhuǎn)錄引物1.0 μL。42 ℃水浴1 h，冰浴2 min，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)直接進(jìn)行PCR反應(yīng)或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3Nsp9基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50 μL：Premix ExTaqDNA 聚合酶25 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，cDNA 2 μL，去離子水21 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測(cè)后回收純化。將PCR產(chǎn)物與pIRES2-EGFP空載體分別用XhoⅠ、Hind Ⅲ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物使用T4 DNA連接酶連接，分別命名為pIRes2-EGFP-Nsp9-XH-GD和pIRes2-EGFP-Nsp9-CH-1R。

1.2.4Nsp9重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并通過(guò)菌液PCR篩選出陽(yáng)性克隆并送往上海立菲生物科技有限公司測(cè)序。陽(yáng)性克隆參照OMEGA Endo-Free Plasmid Mini的說(shuō)明書(shū)抽提去內(nèi)毒素重組質(zhì)粒。用Invitrogen公司的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000按照說(shuō)明書(shū)將構(gòu)建的pIRes2-EGFP-Nsp9-XH-GD和pIRes2-EGFP-Nsp9-CH-1R真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到Marc-145細(xì)胞中。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)重組質(zhì)粒表達(dá) 將轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞樣品棄去上清，用PBS清洗細(xì)胞3次，之后用RIPA裂解液進(jìn)行裂解，每個(gè)6孔板加入100 μL，之后加入25 μL上樣緩沖液，沸水中加熱10 min，13 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，15 V的電壓轉(zhuǎn)移60 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，過(guò)夜封閉一抗(Nsp9單克隆抗體)，洗膜3次，每次5 min，之后加入用TBST緩沖液按1∶8 000稀釋的IRDye 800 CW Goat anti-mouse IgG(H+L)，37 ℃ 孵育1 h，洗膜3次，每次5 min，放入雙色激光分析系統(tǒng)Odyssey(LI-COR公司生產(chǎn))，拍照記錄。

1.2.6 Marc-145細(xì)胞接毒與樣品采集 將轉(zhuǎn)染pIRes2-EGFP-Nsp9-XH-GD和pIRes2-EGFP-Nsp9-CH-1R真核表達(dá)載體的Marc-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h之后，以MOI=1的劑量接種PRRSV XH-GD毒株，24 h之后采集樣品。

1.2.7 qPCR測(cè)定中PRRSV N蛋白的mRNA表達(dá)水平 接毒后24 h，將病變細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，取上清液250 μL置于DEPC水處理過(guò)的1.5 mL滅菌離心管中，按照Invitrogen公司TRIzol?試劑的使用說(shuō)明書(shū)操作，提取病毒總RNA。步驟同1.2.2。

以反轉(zhuǎn)錄的樣品為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR體系20 μL：SYBR?Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)(2×)10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性10 s，55 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。

1.2.8 Western Blot檢測(cè) PRRSV N蛋白的表達(dá) 具體操作步驟參照1.2.5，其中一抗為N蛋白或者GAPDH抗體。

1.2.9 TCID50測(cè)定PRRSV的滴度 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上接種Marc-145細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到85%以上時(shí)即可用樣品進(jìn)行接種。每個(gè)樣品進(jìn)行10倍梯度的倍比稀釋(即10-1～10-8倍比稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度接種8孔，100 μL/孔)。接毒后，將細(xì)胞板放置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育作用1.5 h。棄去病毒液，補(bǔ)入含2%新生牛血清的DMEM，然后放置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)觀(guān)察2～7 d，記錄每個(gè)稀釋度的發(fā)生細(xì)胞病變的孔數(shù)，重復(fù)3次求其平均值，并按照Reed-Muench法計(jì)算各個(gè)樣品的TCID50。

1.2.10 qPCR和病毒滴度數(shù)據(jù)分析 qPCR分析計(jì)算方法采用2-ΔΔCt，qPCR數(shù)據(jù)和病毒滴度的差異性數(shù)據(jù)分析采用GraphPad軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRRSV XH-GD、CH-1R毒株Nsp9基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

由圖1可知， PRRSV XH-GD、CH-1R毒株Nsp9基因目的片段都在1 900 bp左右，與理論值相符。由圖2可知，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)XhoI、Hind Ⅲ雙酶切后出現(xiàn)1 900，5 600 bp左右的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，表明PRRSV XH-GD、CH-1R 毒株Nsp9基因重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DL2000 Marker； 1.XH-GD毒株；2.CH-1R毒株。M. DL2000 Marker； 1. XH-GD； 2. CH-1R.

M.DL2000 Marker；1.雙酶切pIRes2-EGFP-Nsp9-XH-GD；

2.2 PRRSV XH-GD、CH-1R毒株重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染結(jié)果

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染之后的細(xì)胞進(jìn)行Western Blot 驗(yàn)證，一抗為Nsp9單抗，可以看到目的條帶，大小為100 kDa(圖3)，與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明PRRSV XH-GD、CH-1R毒株重組質(zhì)粒在Marc-145細(xì)胞中得到了有效表達(dá)。

M.170 蛋白Marker ；1. pIRes2-EGFP-Nsp9-XH-GD；

2.3 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒之后對(duì)PRRSV N蛋白的mRNA表達(dá)水平變化

通過(guò)qPCR方法進(jìn)行N蛋白在mRNA表達(dá)水平上的變化，數(shù)據(jù)用GraphPad進(jìn)行處理，結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)染CH-1RNsp9基因Marc-145細(xì)胞上的病毒N蛋白的mRNA水平顯著高于轉(zhuǎn)染XH-GDNsp9基因的細(xì)胞。

2.4 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒之后對(duì)PRRSV的N蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化

從圖5可以看出，轉(zhuǎn)染CH-1RNsp9基因的Marc-145細(xì)胞上的病毒N蛋白的蛋白水平高于轉(zhuǎn)染XH-GDNsp9基因的細(xì)胞。

2.5 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒之后對(duì)PRRSV的滴度變化

從圖6可以看出， 轉(zhuǎn)染CH-1RNsp9基因的Marc-145細(xì)胞上的病毒滴度顯著高于轉(zhuǎn)染XH-GDNsp9基因的細(xì)胞。

*.差異顯著( P<0.05)。圖6同。

圖5 PRRSV XH-GD、CH-1R毒株Nsp9基因重組質(zhì)粒在Marc-145細(xì)胞上對(duì)N蛋白蛋白質(zhì)水平的影響Fig.5 Protein level of N protein influence of PRRSV XH-GD，CH-1R strain Nsp9 gene transfection in Marc-145 cells

圖6 PRRSV XH-GD、CH-1R毒株Nsp9基因?qū)Σ《镜味鹊挠绊慒ig.6 Variance of viral titer of PRRSV XH-GD，CH-1R strain Nsp9 gene transfection in Marc-145 cells

3 討論

前人研究結(jié)果表明，PRRSV毒力與Nsp9和Nsp10相關(guān)[20]，和其他病毒蛋白相比，Nsp9高度保守，2006年之前的經(jīng)典株和之后的變異株存在約12個(gè)氨基酸突變[17]。作為對(duì)病毒復(fù)制至關(guān)重要的酶，12個(gè)氨基酸的突變會(huì)不會(huì)造成對(duì)病毒復(fù)制的影響，故本研究克隆了2006年之前出現(xiàn)的弱毒株CH-1R的Nsp9基因和2006年之后出現(xiàn)的強(qiáng)毒株XH-GD的Nsp9基因，過(guò)表達(dá)之后，CH-1R的Nsp9基因相比XH-GD毒株的Nsp9基因更能促進(jìn)病毒的復(fù)制，強(qiáng)、弱毒株之間的Nsp9基因存在功能差異，其是否與細(xì)胞免疫、抗藥性存在關(guān)聯(lián)，與毒力、聚合酶活性相關(guān)還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證[21-23]。也可能是這12個(gè)氨基酸的突變共同造成了Nsp9三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，這個(gè)需要結(jié)構(gòu)生物學(xué)來(lái)驗(yàn)證。

弱毒比強(qiáng)毒促進(jìn)PRRSV復(fù)制，其原因可能是：弱毒株能適應(yīng)Marc-145細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的嗜性更好；弱毒株Nsp9基因抑制干擾素、白介素等細(xì)胞因子或者其他細(xì)胞凋亡現(xiàn)象強(qiáng)于強(qiáng)毒的Nsp9基因；使弱毒株Nsp9基因與細(xì)胞的作用更強(qiáng)，可以充分利用宿主細(xì)胞蛋白促進(jìn)自身的復(fù)制。從NCBI網(wǎng)站上預(yù)測(cè)Nsp9的活性區(qū)域?yàn)? 000～1 075 nt，本研究克隆的是Nsp9全基因，包括活性區(qū)域，是否活性區(qū)域的差別造成促進(jìn)病毒復(fù)制的差別，這個(gè)需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

關(guān)于PRRSVNsp9基因的研究日益增多，也逐步引起大家的關(guān)注，未來(lái)在預(yù)防和控制豬繁殖與呼吸綜合征方面，Nsp9基因?qū)⒊蔀樾碌淖饔冒悬c(diǎn)。目前PRRSV呈世界性廣泛分布，在主要養(yǎng)殖國(guó)家如美國(guó)、英國(guó)、中國(guó)、荷蘭、德國(guó)等都有流行[24-26]。其長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)感染和抗體依賴(lài)性增強(qiáng)效應(yīng)使得豬場(chǎng)的凈化十分困難。而Nsp9對(duì)病毒的復(fù)制有重要的作用，通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)該聚合酶基因的抑制劑可能是未來(lái)預(yù)防和治療豬繁殖與呼吸綜合征的一個(gè)方向。