晁毛妮,張志勇,張金寶,溫青玉,郭書磊,馬亮,王清連
(1.河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院, 現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,河南 鄭州 450002)
通過調(diào)控植物的光合作用來增加植物的產(chǎn)量,是繼通過傳統(tǒng)育種技術(shù)、栽培措施及農(nóng)業(yè)實(shí)踐等方法后,實(shí)現(xiàn)植物產(chǎn)量增加的一個新的重要的方向[1]。在大多數(shù)植物中,卡爾文循環(huán)在植物碳代謝中占據(jù)重要位置,調(diào)控這個途徑對于提高植物的光合效率和產(chǎn)量意義重大。
Rubisco作為卡爾文循環(huán)中的關(guān)鍵酶,不僅可以催化2個具有競爭性的反應(yīng),同時它也是一個具有較低周轉(zhuǎn)次數(shù)的低效酶,它的有效活化需要Rubisco活化酶(RCA)的參與[2]。因此,對RCA基因的研究已成為近年來提高植物產(chǎn)量的一個新的重要目標(biāo)。通過調(diào)控RCA基因的表達(dá)來增加Rubisco的活性,在改善植物光合效率和提高植物產(chǎn)量方面具有很大的潛力[3-4]。許多研究發(fā)現(xiàn),RCA基因的表達(dá)受光、植物激素、組織特異性及晝夜模式的調(diào)控[5-8]。與RCA基因具有組織特異性和受光調(diào)控的轉(zhuǎn)錄模式一致,菠菜[9]、擬南芥[10]、馬鈴薯[11]和水稻[12]的RCA基因啟動子在高等植物的綠色組織及光誘導(dǎo)下具有活性。RCA基因啟動子的光誘導(dǎo)和組織特異性在應(yīng)對葉食害蟲或葉片抗病植物基因工程方面具有特定的優(yōu)勢。例如,在馬鈴薯基因工程方面,馬鈴薯的RCA基因啟動子可用于表達(dá)只在植物綠色組織表達(dá)的防御基因來特異性的防御白粉病或者蚜蟲[11]。因此,研究植物RCA基因的啟動子,不僅有助于了解該基因的表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制,而且對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也具有重要意義。
啟動子是影響基因表達(dá)效率的重要因子,其順式作用元件決定了基因的表達(dá)量及表達(dá)模式[13]。啟動子區(qū)的順式作用元件可以響應(yīng)光、植物激素、逆境脅迫和生物鐘等,從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。對啟動子區(qū)進(jìn)行順式作用元件分析,有助于了解下游基因的表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制。棉花作為重要的經(jīng)濟(jì)作物,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位。目前,關(guān)于棉花RCA基因的研究主要集中在結(jié)構(gòu)、活性和熱脅迫條件下的蛋白表達(dá)等方面[14-15],關(guān)于其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制研究很少。為此,本研究利用棉花基因組測序結(jié)果,以陸地棉品種百棉1號為材料,通過PCR方法從基因組中擴(kuò)增GhRCAα啟動子序列,并利用PlantCARE對其順式作用元件進(jìn)行分析。同時為了驗(yàn)證該啟動子的功能,利用熒光定量PCR技術(shù)研究了該基因的表達(dá)特性,并通過瞬時表達(dá)的方法進(jìn)一步研究其活性。旨在摸清RCA表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制,從而為提高棉花光合速率和產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)。
用于GhRCAα啟動子克隆或組織表達(dá)模式分析的材料為陸地棉品種百棉1號,該材料由河南科技學(xué)院棉花研究所提供,于2015年4月20日種植于河南科技學(xué)院喬謝試驗(yàn)田。在幼苗期,當(dāng)?shù)?復(fù)葉完全展開時,取完全展開葉并立即速凍于液氮中,用于基因組DNA的提取。在盛花期取棉花植株的根、莖、葉和花(花瓣和萼片)及初鈴期的鈴殼和纖維用于棉花GhRCAα的組織表達(dá)模式分析。
使用基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN, China, DP321)提取百棉1號葉片DNA。以基因組DNA為模板進(jìn)行GhRCAα啟動子序列的擴(kuò)增。引物序列為:GhRCAα-Promoter-F:5′- TCAGGGTATCTTCAGGGGTA-3;GhRCAα-Promoter-R:5′-GTCCTTTTCGGTCTGTGTCT-3′。
GhRCAα啟動子擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系,包括:10 μL 5×PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+plus),4.0 μL 2.5 mmol/LdNTPs,1.5 μL 10 mmol/L正反向引物,1 μL 1.2 U/μL PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (TaKaRa, Japan),4.0 μL DNA模板及28.0 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序:94 ℃ 2 min;98 ℃ 20 s, 61 ℃ 2.5 min, 共35個循環(huán);最后4 ℃保溫10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測,根據(jù)比對Marker條帶,鑒定為目的基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(Axygen, China, AP-GX-4)純化后送深圳華大公司測序。
利用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools /plantcare/html/)[16]在線預(yù)測分析所克隆序列的順式作用元件。
使用RNA提取試劑盒(BioFLUX, BSC65S1B),對所取樣品進(jìn)行總RNA提取。再用1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質(zhì)量,而后RNA儲存于- 80 ℃?zhèn)溆?。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒對約2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,生成cDNA。反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA采用棉花內(nèi)參基因Actin檢測質(zhì)量,并保存于-20 ℃。
以反轉(zhuǎn)錄得到的各組織cDNA為模板,以棉花Actin基因?yàn)閮?nèi)參,進(jìn)行熒光定量PCR分析。棉花GhRCAα和Actin基因的特異性熒光定量PCR引物分別為:QGhRCAα-F:5′-AGCCGCCGACATAATCAAAAAG-3′; QGhRCAα-R:5′-ACGGATGAGAGGAGCATACA GT-3′; QActin-F:5′-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3′; QActin-R:5′-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3′。
熒光定量PCR擴(kuò)增體系(20 μL):2 × SYBR Premix ExTaq(TaKaRa) 10 μL,正反引物各1 μL,模板cDNA 2 μL,ddH2O 6 μL。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-rad Chromo4熒光定量PCR儀上運(yùn)行,擴(kuò)增條件為95 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù),確定基因的相對表達(dá)量。
已克隆的2 000 bp啟動子片段通過載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(EcoRⅠ和PstⅠ)連入含有GUS報(bào)告基因的雙元載體pCAMBIA1381Z(Cambia, Australia)中。構(gòu)建好的雙元載體(GhRCAα∷GUS)以及載體pCAMBIA1301(陽性對照:CaMV35S∷GUS)和pCAMBIA1381Z(陰性對照:無啟動子)分別轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。
GUS活性檢測參照J(rèn)efferson等[17]的方法并略加修改。取待檢測的植物組織,加入GUS染色液,37 ℃溫育過夜24 h。接著,用體積分?jǐn)?shù)為70%,80%,90%,100%的乙醇系列進(jìn)行脫色。最后,在體式顯微鏡下觀察組織的染色情況并拍照。
以已克隆出的陸地棉GhRCAαcDNA序列(GenBank 登錄號:AF329935)為查詢序列BlastN陸地棉全基因組[18],得到起始密碼子ATG上游2 000 bp調(diào)控序列,然后根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物,在百棉1號DNA(圖1-A)中擴(kuò)增GhRCAα啟動子。GhRCAα的理論大小為2 309 bp,所得片段電泳結(jié)果顯示,與預(yù)期的片段大小相符(圖1-B)。經(jīng)Blast比對確認(rèn),該片段為GhRCAα啟動子序列。
將分離獲得的棉花GhRCAαATG上游2 000 bp的啟動子序列提交到啟動子預(yù)測網(wǎng)站plantCARE在線分析啟動子區(qū)的順式作用元件組成。結(jié)果表明,許多重要的順式作用元件,包括TATA-box、 HSE、 G-box、5UTR Py-rich和ciradian等特異地存在于GhRCAα啟動子區(qū)(圖2),且不同順式作用元件的拷貝數(shù)也存在很大差異(表1)。進(jìn)一步分析表明,這些順式作用元件主要分為以下6類(表1)。第1類是光響應(yīng)元件,包括G-box、I-box和GT1-motif等可能參與GhRCAα光調(diào)控的順式作用元件;第2類是生物鐘調(diào)控元件ciradian,該元件可能參與GhRCAα的晝夜表達(dá)模式調(diào)控;第3類是與植物激素響應(yīng)有關(guān)的GARE-motif和ABRE元件,表明GhRCAa的表達(dá)可能受植物激素的調(diào)節(jié);第4類是與逆境響應(yīng)有關(guān)的元件,包括響應(yīng)干旱脅迫的MBS元件,熱激響應(yīng)元件HSE等;第5類是基礎(chǔ)表達(dá)相關(guān)的元件,包括CAAT-box (與增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率有關(guān))和TATA-box等,說明GhRCAα啟動子是一個典型的由RNA 聚合酶Ⅱ結(jié)合的啟動子;第6類是包括CGTCA-motif、TGACG-motif、as1、Skn-1_motif以及CAT-box等其他類順式作用元件,其中as1具有參與根特異性表達(dá)的功能,CGTCA-motif和TGACG-motif具有參與茉莉酸響應(yīng)的功能。以上這些結(jié)果表明GhRCAα的表達(dá)可能受光、生物鐘、逆境及植物激素等的調(diào)控。
由于GhRCAα啟動子區(qū)包含許多響應(yīng)光、特定組織或生物鐘的順式作用元件,為了摸清這些元件的存在對GhRCAα表達(dá)有何影響,采用熒光定量PCR方法來研究GhRCAα在棉花不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明:GhRCAα在葉片中大量表達(dá),而葉片是光合作用進(jìn)行的主要位置,在纖維、莖、萼片、根、花瓣和鈴殼中表達(dá)量很低(圖3)。先前對棉花GhRCAα進(jìn)行晝夜表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),GhRCAα基因的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性,在光周期開始后1 h表達(dá)量最高,午夜表達(dá)量最低[15]。這些結(jié)果表明,GhRCAα的表達(dá)具有組織特異性且受晝夜模式的影響。該結(jié)果與啟動子區(qū)的順式作用元件分析結(jié)果相一致。
圖1 棉花基因組DNA的提取(A)及GhRCAα啟動子序列的擴(kuò)增(B)Fig. 1 The extraction of genomic DNA (A) and the PCR amplification (B) of GhRCAα promoter in cotton
ATG上游的2 000 bp片段定義為啟動子區(qū)域,部分預(yù)測的順式作用元件在圖中用灰色陰影表示;
表1 GhRCAα啟動子區(qū)包含的順式作用元件Tab.1 Cis-acting elements in promoter of GhRCAα
表1(續(xù))
圖3 棉花 GhRCAα的組織特異性表達(dá)分析Fig. 3 Analysis of organ-specific expression of GhRCAα in cotton
將克隆的2 000 bp的片段,用雙酶切法連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1381Z。對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,得到1條約為2 000 bp的特異性條帶(圖4),與預(yù)期片段一致,表明已成功構(gòu)建了由該啟動子驅(qū)動報(bào)告基因GUS的植物表達(dá)載體(GhRCAα∷GUS)。
圖4 表達(dá)載體GhRCAα∷GUS 的酶切分析Fig.4 Restriction analysis of GhRCAα∷GUS vector
將重組表達(dá)載體(GhRCAα∷GUS)、pCAMBIA1301(陽性對照,CaMV35S∷GUS)以及pCAMBIA1381Z(陰性對照),通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行瞬時表達(dá)。結(jié)果表明,陽性對照CaMV35S 啟動子(圖5-A)以及重組載體GhRCAα∷GUS(圖5-B)轉(zhuǎn)化的煙草葉片均能檢測到GUS的表達(dá)產(chǎn)物,但是與陽性對照(CaMV35S 啟動子)相比,目的載體染色弱于陽性對照,表明其活性比CaMV35S啟動子低;pCAMBIA1381Z 載體沒有啟動子來驅(qū)動GUS的表達(dá),所以檢測不到GUS表達(dá)(圖5-C)。這些結(jié)果表明,本研究克隆的GhRCAα啟動子能夠驅(qū)動下游基因GUS的表達(dá),具有驅(qū)動目標(biāo)基因表達(dá)的活性。
A.35S啟動子; B.GhRCAα啟動子;C.不含啟動子的對照。
啟動子是決定外源基因在受體植物中轉(zhuǎn)錄效率高低的關(guān)鍵因子,合適的啟動子將會促進(jìn)外源基因的高效表達(dá)[19]。組成型啟動子能使外源基因在受體植物中高效、持續(xù)的表達(dá),但在特定時間或特定組織部位的表達(dá)達(dá)不到預(yù)期效果[20]。因此,誘導(dǎo)型或特異型啟動子的研究越來越受到廣大研究者們的青睞,發(fā)掘一種組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子對于轉(zhuǎn)基因作物育種具有重要意義[21-23]。RCA基因作為光合作用過程中的一個關(guān)鍵基因,其表達(dá)除了受光誘導(dǎo)和晝夜模式的影響以外,還具有組織特異性,且受發(fā)育時期和植物激素的影響[5-8]。與其表達(dá)模式相一致,RCA啟動子在高等植物的綠色組織及光誘導(dǎo)下具有活性,可作為一種組織特異型和誘導(dǎo)型啟動子[9-11]。因此,克隆植物RCA基因的啟動子,明確其組織特異性表達(dá),可為轉(zhuǎn)基因育種提供一種組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子。
近年來,關(guān)于棉花RCA基因啟動子的克隆及功能研究很少,而關(guān)于RCA的結(jié)構(gòu)、活性和蛋白表達(dá)已開展很多研究[14-15,24]。本研究對棉花GhRCAα啟動子進(jìn)行克隆及順式作用元件分析表明,GhRCAα啟動子除了具有基本的調(diào)控元件,還包含許多與光、生物鐘、植物激素以及逆境響應(yīng)有關(guān)的調(diào)控元件,這些元件特異地存在于GhRCAα啟動區(qū),并在拷貝數(shù)上存在很大差異。已有報(bào)道表明,啟動子誘導(dǎo)表達(dá)的強(qiáng)度主要依賴于順式作用元件的拷貝數(shù),更具體的來說就是順式作用元件相對于TATA-box的間距[25-26]。對大豆的RCA研究表明,重要啟動子元件如G-box和pyrimidine-rich 5′-UTR在拷貝數(shù)目上的差異可能是導(dǎo)致GmRCAα和GmRCAβ表達(dá)量差異的一個原因[3]。棉花中GhRCAα啟動子區(qū)這些重要順式調(diào)控元件拷貝數(shù)變異可能參與了調(diào)控下游基因GhRCAα表達(dá)的強(qiáng)度及模式,但是關(guān)于其影響GhRCAα表達(dá)的分子機(jī)制還不清楚,在今后的研究中仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
利用熒光定量PCR對GhRCAα表達(dá)特性進(jìn)行分析表明,GhRCAα在棉花的不同組織表達(dá)量存在很大差異,在光合作用進(jìn)行的主要位置葉片中表達(dá)量最高,其他組織表達(dá)量很低,其表達(dá)具有組織特異性。與此相一致的是大量光響應(yīng)元件(G-box、ACE及I-box等),組織特異表達(dá)元件(as1等)特異地存在于GhRCAα啟動子區(qū)。已有研究表明,植物的組織特異性表達(dá)可能是來源于根特異性表達(dá)元件的負(fù)調(diào)控,也可能是來源于葉特異性表達(dá)元件的正調(diào)控[10,27-28]。GhRCAα啟動子區(qū)根特異性表達(dá)元件as1的存在可能是作為一個負(fù)調(diào)控元件參與組織特異性表達(dá),但仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在植物的生長發(fā)育過程中,光不但作為一種重要的信號來調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá),而且還直接參與光合作用[29]。GhRCAα啟動子區(qū)光響應(yīng)元件的大量存在可能參與GhRCAα的光調(diào)控及光合組織葉片中GhRCAα的大量表達(dá)。另外,晝夜節(jié)律響應(yīng)元件circadian及同時參與生物鐘及光響應(yīng)的調(diào)控元件I-box[30-32]均存在于GhRCAα的啟動子區(qū),說明其表達(dá)可能受到光周期的調(diào)節(jié),這與先前報(bào)道的GhRCAα的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性的結(jié)果相一致[15]。對棉花[15]、水稻[33]和菠菜[34]的RCA研究表明,45 kDa(RCAα)亞型可能在光合機(jī)構(gòu)適應(yīng)體外中度熱脅迫方面起著重要作用,熱激響應(yīng)元件HSE特異存在于GhRCAα啟動子區(qū)可能賦予該基因在熱脅迫條件維持下Rubisco活性方面的重要作用。總的來說,與其他物種一樣[5-8],棉花的GhRCAα表達(dá)具有組織特異性,且可能受熱脅迫和晝夜模式的影響,該基因啟動子區(qū)相關(guān)調(diào)控元件的存在可能決定了該基因的表達(dá)特性。然而,GhRCAα啟動子區(qū)哪些核心元件參與調(diào)控GhRCAα的表達(dá)仍不清楚。大量逆境響應(yīng)元件及植物激素響應(yīng)元件存在GhRCAα啟動子區(qū)是否意味著該基因在植物應(yīng)對逆境脅迫方面也具有重要作用,在今后的研究中,通過啟動子區(qū)的缺失試驗(yàn)分析、定點(diǎn)突變及逆境條件下基因表達(dá)特性研究,將有助于了解GhRCAα啟動子調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的分子機(jī)制。
本研究克隆獲得的GhRCAα啟動子可以驅(qū)動GUS基因的表達(dá),表明該啟動子片段具有驅(qū)動目標(biāo)基因表達(dá)的活性,因此,有望用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化,進(jìn)而更好地調(diào)控重要基因的特異性表達(dá)。本研究結(jié)果不僅有助于進(jìn)一步深入認(rèn)識棉花GhRCAα基因功能及其表達(dá)調(diào)控規(guī)律,也可為植物遺傳轉(zhuǎn)化提供一種組織特異型或誘導(dǎo)型的啟動子。