蘇麗艷，田愛梅，陶貴榮，李 蒙

(西安文理學院 生物與環(huán)境工程學院，陜西 西安 710065)

鈣調蛋白(CaM)是生物細胞內一種結構保守型很強的調控蛋白，也是研究得最多的Ca2+受體蛋白，其原型是由148個氨基酸組成的小分子酸性蛋白(17 kDa)，具有專一性結合鈣離子的EF hand結構域[1]。CaM只有在結合Ca2+后形成Ca2+/CaM復合物才有生物活性[2]。Ca2+/CaM復合物發(fā)揮生物活性的機制主要有2種，一種是該復合物直接與下游靶蛋白相互作用，另一種是通過活化依賴Ca2+/CaM復合物的蛋白激酶起作用[2-3]。

鈣調蛋白在植物體內參與多種生理活動的調節(jié)，如參與激素反應[4]、調節(jié)基因表達[5]、參與調節(jié)植物發(fā)育[6]、參與植物對許多脅迫信號的轉導等[7-9]。目前，已經從小麥、大豆、玉米、煙草、香蕉、臍橙等多種植物中克隆了CaM基因，目前對CaM基因在響應脅迫信號中的功能有了初步的了解，例如擬南芥的AtCaM基因與冷脅迫信號的轉導有關[10-11]；另有研究表明，調控植物耐鹽性相關的蛋白均受到Ca2+/CaM復合物的調控[12-13]；在香蕉中，CaM被證明參與香蕉幼苗對干旱、低溫等的逆境調控過程[14]。

蘋果(Malusdomestica)是我國的主要果品，也是世界上種植最廣、產量最多的水果。市場供應的蘋果多以儲藏果為主，蘋果從采后包裝、運輸、貯藏到消費者手的整個過程中都不可避免地受到擠壓、振動、碰撞等導致的損傷、高溫和低氧的儲藏環(huán)境等逆境脅迫因素的影響，從而極易發(fā)生病害和腐爛。因此，了解蘋果釆后響應逆境脅迫的生理機制，篩選關鍵響應因子，對開展蘋果抗逆品種改良有重要的指導意義。

周倩[15]已通過RACE技術獲得MdCaM全長(GenBank登錄號為HM369505)，并證明MdCaM是秦冠蘋果抗褐斑病關鍵調控基因。然而，關于MdCaM在蘋果釆后逆境脅迫下的表達模式及功能尚不清楚。本研究根據(jù)MdCaM全長cDNA序列設計特異性引物，克隆了MdCaM基因。利用MEGA 5.0 軟件將蘋果MdCaM與其他物種的鈣調蛋白氨基酸序列進行了聚類分析。同時，采用熒光定量PCR技術分析了MdCaM在蘋果釆后非生物脅迫(損傷、低氧、高溫)下的表達情況，明確該基因在逆境脅迫下的表達模式，旨在為進一步分析MdCaM蛋白在響應逆境脅迫中的功能，為將來開展蘋果抗逆品種改良提供基因儲備，為提高蘋果釆后對外界脅迫環(huán)境的適應能力的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗用植物材料均采自陜西省銅川市蘋果示范種植基地6年生紅富士蘋果樹。采后當天運回實驗室，用蒸餾水小心清洗且紗布擦干后，選取色澤一致、大小均勻(單果重約250 g)、無損傷病害果實進行脅迫處理，處理后果實貯存于4 ℃，相對濕度為90%的無光照儲藏室中。

本研究中所用的分子試劑，高保真聚合酶Ex-Taq酶、SYBR premix EX TagTM reagent 試劑盒均購自TaKaRa公司；DNA 凝膠回收試劑購自Omega Bio-tek公司；其他分子試劑及載體等均購于生工生物工程(上海)技術服務有限公司。

1.2 逆境脅迫處理方法

1.2.1 損傷脅迫 將蘋果置于離地面60 cm的地方，使其自由落地跌落大理石地面，每個蘋果正反雙面各跌落一次，以未處理蘋果為對照，儲藏于溫度為4 ℃，相對濕度為90%～93%無光照儲藏室中。每組設3個生物樣本重復，每次取9個蘋果用于樣品分析。分別于處理后0，1，6，12，24 h取材，將果實削成1 cm3左右小塊存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高溫脅迫 將蘋果分別置于溫度為4，20，40 ℃，相對濕度為90%～93%無光照儲藏室內。每組設3個生物樣本重復，每次每個處理組取9個蘋果用于樣品分析，分別于處理后0，1，6，12，24 h取材，將果實削成1 cm3左右小塊存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 低氧脅迫 將蘋果儲藏于30 L的容器中，通入100%N2+0 O2和97%N2+3%O2。每組3個重復，儲藏于4 ℃，相對濕度為90%～93%無光照儲藏室內。每次每個處理組取9個蘋果用于樣品分析，分別于處理后0，1，6，12，24 h取材，將果實削成1 cm3左右小塊存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 果實RNA提取和MdCaM基因克隆方法

采用CTAB法提取果實樣品的總RNA。利用M-MLV逆轉錄酶合成第一鏈cDNA，具體試驗體系、方法和步驟見試劑盒說明書。根據(jù)蘋果MdCaM基因序列全長，利用Primer 5.0設計引物(上海生工合成)，MdCaM-F和MdCaM-R，序列見表1。以cDNA為模板擴增MdCaM基因全長。反應體系為25 μL，程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s 共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，DNA凝膠回收試劑盒回收目標片段，連接pMD19-T載體進行T/A克隆，DNA測序由上海生物工程有限公司完成。

1.4 MdCaM基因擴增及熒光定量表達分析

以上述cDNA為模板，以NCBI上已經登錄的MdActin(登錄號：AB638619.1)為內參，采用RT-PCR方法對其進行表達分析。引物根據(jù)NCBI已經登錄的MdActin和MdCaM序列設計，分別為Q_MdActin-F、Q_MdActin-R；Q_MdCaM-F、Q_MdCaM-R，具體序列見表1。操作步驟按照SYBR premix EX TagTM reagent 試劑盒說明書進行。qPCR體系為10 μL，包括5 μL SYBR premix Ex Taq混合液，1 μL cDNA，引物各0.25 μL，ddH2O 3.5 μL。反應程序為：95 ℃變性3 min；然后，95 ℃ 20 s，54 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40 次循環(huán)；每次循環(huán)第3 步進行熒光采集，最后退火至65 ℃，每隔30 s 上升0.5 ℃，至95 ℃變性1 min。qRT-PCR 反應于Bio-RAD C1000TM Thermal Cycler 上進行，使用CFX96TM 系統(tǒng)進行熒光采集。cDNA標樣和待測樣均設置3 次重復。試驗結果用2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進行定量分析[16]。

2 結果與分析

2.1 MdCaM克隆的電泳檢測

對紅富士蘋果的MdCaM基因全長序列進行克隆(圖1)，將測序結果與已知MdCaM基因序列比對，結果一致。MdCaM包含450 bp的開放閱讀框，編碼150個氨基酸。根據(jù)在線軟件(http：//www.expasy.org/tools/pi_tool.html)預測其分子量約為16.875 7 kDa，預測等電點(pI)為4.12。利用DNAman軟件將MdCaM與其他物種的CaM氨基酸序列進行比對。結果顯示，MdCaM的蛋白序列與其他物種鈣調蛋白基因具有很高同源性，且具有2個鈣結合蛋白的保守結構域EF-hand(圖2)。

2.2 MdCaM序列的系統(tǒng)進化樹構建

根據(jù)編碼MdCaM的氨基酸序列并結合其他植物鈣調蛋白基因的編碼氨基酸序列，采用MEGA5.0構建了系統(tǒng)進化樹(圖3)。結果表明，MdCaM基因與芥藍和擬南芥的親緣關系最近。

1.DNA的PCR結果；M.分子量標準。

2.3 MdCaM基因在損傷脅迫下的表達分析

利用熒光定量PCR對MdCaM基因損傷脅迫后不同時間的相對表達量進行分析，結果顯示：與對照組相比，MdCaM基因的相對表達量在損傷脅迫早期1，6，12 h均有顯著性提高，且在損傷處理6 h后達到峰值。損傷脅迫6 h后，對照組的相對表達量為1.1，而損傷組為5.7，約為對照組的5倍，12 h后表達量較脅迫早期(1，6 h)有所下降，但仍明顯高于同時期對照果，損傷處理24 h后MdCaM基因的相對表達量恢復正常水平(圖4)。

黑色下劃線為2個EF-hand保守結構域。 Two conserved domain EF-hands were marked by black lines.

圖3 根據(jù)氨基酸序列聚類的植物鈣調蛋白基因進化關系分析

2.4 MdCaM基因在高溫脅迫下的表達分析

如圖5所示，與低溫(4 ℃)相比，20，40 ℃儲藏1 h后，MdCaM相對表達量呈現(xiàn)明顯上調，并隨著時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢，12 h后達到峰值，隨后表達量呈下降趨勢，但顯著高于同期對照組。

2.5 MdCaM基因在低氧脅迫下的表達分析

在無氧(0 O2)條件下，MdCaM在處理后1 h被迅速誘導呈上調表達，對照組的相對表達量為1.1，而無氧組為3.2，約為對照組的3倍，6 h后迅速恢復正常水平；在低氧(3% O2)儲藏條件下，MdCaM仍呈現(xiàn)為上調表達，但在處理后6 h達到最大值，12 h后恢復正常水平。在低氧(0 O2和3% O2)誘導12 h后，MdCaM表達量與對照組無顯著性差異(圖6)。

***.P<0.001；**.P<0.01； *.P<0.05。圖5-6同。***.P<0.001；**.P<0.01； *.P<0.05。The same as Fig.5-6.

圖5 高溫脅迫下MdCaM基因的表達情況Fig.5 Relative expression of MdCaM gene under high temperature stress

圖6 低氧脅迫下MdCaM基因的表達情況

3 討論

植物抗逆是指植物抵抗干旱、水澇、低溫、高溫、鹽堿、病蟲害等不良環(huán)境的能力。逆境可分為生物脅迫和非生物脅迫2種。其中，非生物脅迫條件下植物自身調節(jié)機制的研究越來越受到重視，已成為培育抗逆新品種的重要條件之一。損傷、高溫和低氧是蘋果儲藏過程中的主要非生物脅迫因子，是影響北方地區(qū)蘋果儲藏品質的重要因素。

已有研究表明，CaM是植物體內普遍存在的一類Ca2+結合蛋白，在植物響應非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[17-22]。鈣調蛋白本身不具有催化活性，只要通過與其下游鈣調蛋白結合蛋白(CaMBP)結合調控細胞的生理功能，從而影響植物的生長發(fā)育[23]。如毛白楊CaM通過提高G6PDHase、ATPase活性提高其幼苗在低溫條件下的存活率和抗凍性，從而證明CaM與植物的抗凍性相關[24]。因此，CaMBP的鑒定是研究CaM生理功能作用的重要手段。目前，已經鑒定了一系列參與逆境脅迫反應的CaMBP，如NAD激酶、一氧化氮合成酶、谷氨酸脫羧酶等[25]。研究證明，蘋果鈣調蛋白是抗褐斑病相關蛋白[15]，關于其在蘋果響應損傷、高溫和低氧等非生物脅迫中的功能尚無相關報道。

本研究結果表明，MdCaM對不同脅迫的響應模式不同。損傷處理后，MdCaM迅速應答，其相對表達量在處理后6 h達到峰值，約為為對照組的5倍，24 h后漸恢復正常水平；在20，40 ℃ 2個高溫逆境脅迫環(huán)境下，MdCaM均在脅迫早期被強烈誘導，且在處理后12 h左右達到峰值，隨后表達水平小幅下調，但仍然顯著高于對照組；MdCaM在無氧(0 O2)脅迫早期受到強烈誘導，在處理后1 h達到峰值，約為對照組的3倍，與無氧脅迫相比，低氧環(huán)境下(3%O2)MdCaM相對表達量上調幅度較小，應答較為遲緩，6 h后達到峰值，為對照組的2倍，后均恢復正常水平。從以上研究結果看，MdCaM基因受到損傷、高溫、低氧等脅迫條件誘導，特別是在脅迫早期有明顯應答。說明蘋果MdCaM基因具有響應損傷、高溫、低氧等非生物脅迫的能力，可能在適應脅迫環(huán)境的早期發(fā)揮重要作用。本研究為進一步利用現(xiàn)代分子生物學技術和植物遺傳育種方法揭示MdCaM的功能及其網絡調控機制奠定基礎，為闡明蘋果釆后抗逆生理機制及進一步利用該基因進行抗性育種提供重要參考依據(jù)。然而，MdCaM響應逆境脅迫的分子機制如何，有哪些下游靶蛋白參與其調控過程，其與下游靶蛋白相互作用的信號通路及調控網絡等問題亟待進一步深入研究。