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亞抑菌濃度環(huán)丙沙星對大腸埃希菌喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響

2017-12-12 01:29鄂順梅龍一飛曾建明魯洋陳茶
山東醫(yī)藥 2017年43期
關(guān)鍵詞:環(huán)丙沙星氨芐西林喹諾酮

鄂順梅,龍一飛,曾建明,魯洋,陳茶

(廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,廣州510006)

亞抑菌濃度環(huán)丙沙星對大腸埃希菌喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響

鄂順梅,龍一飛,曾建明,魯洋,陳茶

(廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,廣州510006)

目的探討亞抑菌濃度環(huán)丙沙星對大腸埃希菌喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響。方法采用PCR法篩選含有質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥基因[包括qnrA、qnrB、qnrC、aac(6′)-Ib-c基因]的大腸埃希菌作為供體菌;質(zhì)粒接合試驗分析喹諾酮類耐藥質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力;不同亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星處理供體菌后,觀察喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合效率的改變。結(jié)果16株供體菌攜帶質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥基因,其中6株供體菌攜帶的喹諾酮類耐藥質(zhì)??梢越雍限D(zhuǎn)移,接合效率為2.6×10-2~1.2×10-1;接合效率最高的1株供體菌經(jīng)不同亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星處理后,其接合效率最高可較無環(huán)丙沙星處理組增加1.5倍。結(jié)論亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星可以促進大腸埃希菌喹諾酮類耐藥質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移。

細菌耐藥;質(zhì)粒介導的喹諾酮耐藥;耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移;大腸埃希菌; 環(huán)丙沙星; 抗生素亞抑菌濃度

大腸埃希菌(E.coli)是院內(nèi)感染和交叉感染的主要致病菌之一??股氐牟缓侠響檬笶.coli的耐藥問題日趨嚴重[1,2]。作為一種廣譜高效的抗生素,喹諾酮類抗生素廣泛用于治療E.coli引起的感染,然而近幾年E.coli對喹諾酮類藥物的耐藥率逐年上升,局部地區(qū)耐藥率高達70%[3]。E.coli對喹諾酮類抗生素的耐藥機制復雜多樣,其中質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥(PMQR)[4],因其可通過細菌間基因水平轉(zhuǎn)移(HGT)而使耐藥基因在細菌間水平傳播,導致院內(nèi)感染大范圍流行而備受關(guān)注。隨著抗生素使用的增加,細菌對其抗性也隨之增加,反之亦然。這種情況不僅限于E.coli等革蘭陰性桿菌,革蘭陽性球菌亦是如此,如在減少紅霉素的使用以后,A類鏈球菌抗生素耐藥株的數(shù)量減少[5]。若抗生素是導致細菌耐藥性增強的原因,那么可否將這一現(xiàn)象解釋為“抗生素對HGT有一定的促進作用”呢?基于接合反應對HGT具有重要的促進作用[6,7],我們推測抗生素能通過促進細菌接合反應而加速耐藥基因在細菌間的轉(zhuǎn)移[8]。通常抗生素對細菌的作用具有濃度和時間依賴性,為達到抑制甚至殺滅細菌的作用,臨床應用抗生素時需根據(jù)藥物代謝動力學參數(shù)定時定量給藥,以維持抗生素的濃度大于其最小抑菌濃度(MIC)[10]。然而,實際上有多種因素導致到達感染部位的抗生素僅達到“亞抑菌濃度,即亞MIC”(sub-MIC)而殺滅不了細菌。sub-MIC的抗生素可導致細菌發(fā)生一系列的反應,如促進接合反應[10]。為此,2016年6~12月,我們就不同sub-MIC的環(huán)丙沙星對E.coli的喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合效率的影響進行了觀察?,F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株 廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院2015年1~12月分離的E.coli菌株,其中包括環(huán)丙沙星耐藥或中介菌株60株、環(huán)丙沙星敏感菌株15株,共75株,無重復菌株;75株E.coli菌株采用VITEK2全自動細菌鑒定系統(tǒng)鑒定,-70 ℃保存。對疊氮化鈉耐藥的E.coli J53AZr菌株由上海復旦大學王明貴教授饋贈。

1.2 主要試劑 革蘭陰性細菌鑒定卡、革蘭陰性細菌藥敏卡、VITEK2全自動微生物分析系統(tǒng)為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品;PCR試劑盒、DNA Marker DL 2000為大連寶生物公司產(chǎn)品;抗生素標準品氨芐西林和環(huán)丙沙星購自廣東省藥品檢驗所及中國食品藥品檢定研究院。

1.3 E.coli菌株P(guān)MQR基因和接合相關(guān)基因的檢測 采用PCR技術(shù)。將75株E.coli菌株在血平板上分離出單個菌落。采用煮沸法提取75株E.coli的DNA,按菌株分離的時間先后順序?qū)?5株細菌進行編號(1~75號)。目的基因引物序列見表1(其中qnrA、qnrB,qnrS引物來自文獻[11],aac(6′)-Ib-cr、traI、traG引物采用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計)。采用多重PCR對qnrA、qnrB、qnrS進行擴增,反應體系和反應條件參照文獻[11]。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗證,并與GenBank數(shù)據(jù)庫提供的基因序列進行比對以確定其基因型。

1.4 環(huán)丙沙星的MIC值測定 采用微量肉湯法。參照CLSI M07-A9進行環(huán)丙沙星的MIC值測定。用倍比稀釋法稀釋環(huán)丙沙星,設置陰性對照孔與無抗生素對照孔,將100 μL稀釋后的環(huán)丙沙星藥液加入96孔聚苯乙烯板中。將新鮮復蘇的2~3個含有PMQR基因的E.coli菌株的單個菌落接種于3 mL 的LB營養(yǎng)肉湯中并培養(yǎng)至指數(shù)生長期,調(diào)濁度至0.5麥氏單位(約含細菌1×108CFU/mL)。將0.5麥氏濁度的菌液稀釋20倍,然后向已加入環(huán)丙沙星藥液的96孔聚苯乙烯板每孔中加入10 μL(5×104CFU/孔)稀釋后的菌液,35 ℃孵育18~20 h,判讀結(jié)果。

表1 目的基因引物序列(5′-3′)

1.5 PMQR質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實驗 采用液體接合法。①能夠接合轉(zhuǎn)移的E.coli菌株的篩選:用含有PMQR基因的E.coli菌株(PMQR陽性菌株)作為供體菌,E.coli J53Azr菌株作為受體菌進行接合試驗,篩選能夠接合轉(zhuǎn)移的PMQR陽性菌株。具體過程如下:挑取PMQR陽性菌株和E.coli J53Azr菌株的單個菌落接種于LB營養(yǎng)肉湯,分別培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取96孔板,每孔加入100 μL的LB營養(yǎng)肉湯,取1×106CFU供體菌和等量的受體菌接種于100 μL的LB營養(yǎng)肉湯中接合2 h。取30 μL上述接合后菌液,1∶50稀釋后取30 μL涂布于含有50 μg/mL氨芐西林和50 μg/mL疊氮化鈉的LB瓊脂平板上,35℃培養(yǎng)24 h,計數(shù)接合子數(shù)目并計算接合效率:接合效率=接合子菌落數(shù)/供體菌菌落數(shù)[12]。②sub-MIC的環(huán)丙沙星對接合反應的影響:采用倍比稀釋法配制不同sub-MIC的環(huán)丙沙星溶液(環(huán)丙沙星濃度分別為1/16、1/32、1/64、1/128、1/256的MIC,同時設不加環(huán)丙沙星的對照組),按照一定量加入3 mL的LB營養(yǎng)肉湯中,將3×106CFU的接合效率最高的PMQR陽性菌株接種于上述培養(yǎng)基中,35 ℃培養(yǎng)至指數(shù)生長期,吸取1 mL菌液,4 000 r/min離心5 min,棄上清,加入1 mL的 LB營養(yǎng)肉湯。然后按照上述方法與E.coli J53Azr菌株進行接合試驗。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料比較用配對t檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 E.coli菌株P(guān)MQR基因的檢測結(jié)果 從75株E.coli中分離到16株含有PMQR基因aac(6′)-Ib-cr、qnrB、qnrS的菌株(判為PMQR陽性菌株),沒有分離到含有qnrA基因的菌株。16株P(guān)MQR陽性菌株均對氨芐西林耐藥,除43號菌株對環(huán)丙沙星敏感外,其余15株均對環(huán)丙沙星耐藥。16株P(guān)MQR陽性菌株的耐藥基因分布情況及氨芐西林和環(huán)丙沙星的MIC見表2。

表2 PMQR陽性菌株的耐藥基因分布及氨芐西林和環(huán)丙沙星的MIC(μg/mL)

注:環(huán)丙沙星的MIC值≤1 μg/mL為敏感、≥4 μg/mL為耐藥;氨芐西林的MIC值≤8 μg/mL為敏感、≥32 μg/mL為耐藥。

2.2 PMQR陽性菌株與受體菌的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗結(jié)果 16株P(guān)MQR陽性菌株中,只有11、22、28、43、58號PMQR陽性菌株的質(zhì)粒能夠接合轉(zhuǎn)移,與受體菌E.coli J53Azr的接合效率分別為2.6×10-2、3.2×10-2、9.2×10-2、8.1×10-2、1.2×10-1。58號菌株接合效率最高,在接合18 h后就可見接合子長出,其他菌株需要36 h才見接合子,所有單獨供體菌或受體菌在含有氨芐西林和疊氮化鈉的篩選板上培養(yǎng)48 h未見菌落生長。在11、22、28、43、58號菌株中可以檢測到接合基因traI和traG(見圖1),而在其他PMQR陽性菌株中未檢測到上述兩種接合基因。

2.3 sub-MIC的環(huán)丙沙星對58號菌株中的喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響 喹諾酮類耐藥質(zhì)粒接合效率最高的58號E.coli菌株,分別經(jīng)1/16、1/32、1/64、1/128、1/256 MIC的環(huán)丙沙星處理后,其與受體菌E.coli J53Azr的接合效率分別為0.12±0.02、0.15±0.04、0.18±0.05、0.21±0.06、0.27±0.07,未加環(huán)丙沙星的58號E.coli菌株與受體菌E.coli J53Azr的接合效率為0.10±0.02。與未加環(huán)丙沙星的菌株的接合效率相比,加入不同sub-MIC的環(huán)丙沙星菌株的接合效率均升高,其中加入1/256 MIC的環(huán)丙沙星菌株的接合效率升高1.5倍(Plt;0.05)。

注:A為traG接合基因在PMQR陽性菌株中的表達;B為traI接合基因在PMQR陽性菌株中的表達。

圖1接合基因traI和traG在PMQR陽性菌株中的檢測結(jié)果

3 討論

質(zhì)粒介導的耐藥是新發(fā)現(xiàn)的一類喹諾酮類抗生素耐藥機制,該類質(zhì)粒具有廣泛的宿主,它可以通過接合的方式轉(zhuǎn)移到E.coli、肺炎克雷伯菌、傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌等細菌中,即通過HGT使耐藥基因在細菌間水平傳播。在E.coli中PMQR基因主要有qnr基因(包括qnrA、qnrB、qnrS等)、氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的變異基因aac(6′)-Ib-cr和喹諾酮外排蛋白基因(QepA或OqxAB)。Qnr等PMQR基因的單獨存在可以使菌株對喹諾酮藥物的敏感性降低,但可能并未達到具有臨床意義的喹諾酮耐藥水平或僅僅導致低水平的喹諾酮耐藥,不過含qnr等PMQR基因的菌株在長期大量使用喹諾酮藥物時更容易發(fā)生染色體突變,或者含染色體突變的菌株在適宜的條件下可以捕獲qnr基因,在這兩種情況下菌株同時具有了質(zhì)粒和染色體介導的喹諾酮耐藥機制,引起高水平喹諾酮耐藥[13]。因此,質(zhì)粒介導的耐藥成為導致喹諾酮高水平耐藥的重要途徑[14]。

本研究在75株E.coli菌株中發(fā)現(xiàn)16株(21.3%)可檢出PMQR基因(qnrB,qnrC,aac(6′)-Ib-c),其中12株檢出aac(6′)-Ib-cr、8株檢出qnrS、5株檢出qnrB,未檢出qnrA。Aac(6′)-Ib序列trp102arg和asp179tyr這兩個氨基酸突變后就成為喹諾酮耐藥基因aac(6′)-Ib-cr,經(jīng)測序證實所擴增的片段均為aac(6′)-Ib-cr。本研究目的就是篩選含有PMQR基因的菌株作為后續(xù)接合實驗的供體菌,因此盡可能選擇喹諾酮耐藥菌株為研究對象。

Qnr基因主要存在于Ⅰ類整合子中,并與其他多種耐藥基因如β內(nèi)酰胺酶共存于同一質(zhì)粒而導致細菌對多種抗生素耐藥。含有aac(6′)-Ib-cr的菌株通常也與β內(nèi)酰胺酶基因共存。本研究篩選的16株P(guān)MQR陽性E.coli菌株均對氨芐西林耐藥,而受體菌E.coli J53Azr對疊氮化鈉耐藥、對氨芐西林敏感,因此實驗選用氨芐西林和疊氮化鈉篩選接合子。16株P(guān)MQR陽性株中只有11、22、28、43、58號菌株的質(zhì)粒可以接合轉(zhuǎn)移,同時在這些能夠接合轉(zhuǎn)移的分離株中可以檢測到traI和traG接合基因。traI編碼松弛酶,啟動接合反應;traG編碼先導蛋白,使切開的單鏈向受體菌轉(zhuǎn)移。其他不能接合的PMQR陽性菌株中未檢測到上述兩種基因。這一結(jié)果提示接合反應的發(fā)生與接合基因的表達密不可分。

sub-MIC的抗生素不能抑制細菌增殖,卻可以改變細菌的物理化學性質(zhì)[15]。低濃度的抗生素(環(huán)丙沙星,紅霉素,β-內(nèi)酰胺類)可以增加E.coli、金黃色葡萄球菌不同衍生物或大腸桿菌與金黃色葡萄球菌之間的耐藥性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移頻率[16]。而許多其他抗生素,包括萬古霉素和替考拉寧則沒有這樣的效果。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)接合效率最高的58號菌株經(jīng)不同sub-MIC的環(huán)丙沙星處理,再與E.coli J53Azr接合,其接合效率明顯升高,sub-MIC越小,接合效率越高,到1/256 MIC時接合效率增高約1.5倍。因此,我們認為sub-MIC濃度的環(huán)丙沙星可以促進喹諾酮耐藥質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移,但具體機制需要進一步研究確認。

抗生素的不充分使用通過促進多種耐藥基因的轉(zhuǎn)移而有助于增加細菌耐藥性,希望可以找到有效的預防措施來抵抗耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移。喹諾酮通常以濃度依賴性方式殺死病原體,對于該類藥物的使用,維持藥物濃度高于MIC的時間長度對于根除細菌是至關(guān)重要的。

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Effectofsub-minimuminhibitoryconcentrationofciprofloxacinonconjugativetransferofquinolone-resistantplasmidofEscherichiacoli

EShunmei,LONGYifei,ZENGJianming,LUYang,CHENCha

(TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

ObjectiveTo investigate the effect of sub-minimum inhibitory concentration of ciprofloxacin on the conjugative transfer of quinolone-resistant plasmid of Escherichia coli.MethodsQnrA, qnrB, qnrC, aac(6′)-Ib-c genes were confirmed by PCR and DNA sequencing. The transferability of the plasmids harboring PMQR genes was investigated by conjugation test, so as to screen transferable Escherichia coli as donor. The effect of ciprofloxacin on conjugative transfer of drug resistant plasmids was observed after treatment with Escherichia coli with sub-MIC of ciprofloxacin.ResultsThere were 16 strains of Escherichia coli which were detected the target genes. Among 16 strains of positive bacteria, the PMQR gene of the 6 strains was able to conjugative transfer, and the conjugative efficiency was between 2.6×10-2and 1.2×10-1. The conjugative efficiency of the 1 strain with the highest transfer efficiency could be up to 1.5 times when treated with different concentrations of ciprofloxacin.ConclusionThe sub-minimum inhibitory concentration of ciprofloxacin can promote the conjugative transfer of quinolone-resistant plasmids.

antibiotic resistance of bacteria; plasmid-mediated quinolone resistance; conjugation transfer of resistant plasmid; Escherichia coli; ciprofloxacin; antibiotic sub-minimum inhibitory concentration

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.008

R378

A

1002-266X(2017)43-0025-04

廣東省公益研究與能力建設專項基金資助項目(2014A020212281);廣州中醫(yī)藥大學拔尖人才科研專項基金資助項目(2014KT1491)。

鄂順梅(1978- ),女,碩士,副主任技師,主要研究方向為細菌耐藥機制。E-mail: sanhesi@163.com

陳茶(1970- ),男,碩士,教授,主要研究方向為細菌耐藥機制。E-mail: chencha906@163.com

2017-07-26)

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