文/Sebastian Wiererm amp; Hans Rainer Wollseifen

別緊張，放松肌肉測定動物尿液中天然類固醇和合成類固醇

文/Sebastian Wiererm amp; Hans Rainer Wollseifen

圖1：在家畜育肥過程中，除常規(guī)飼料外經常有人使用違禁飼料，例如，類固醇類藥物。

德國動物及動物源食品中的殘留物監(jiān)控計劃NRKP是國家保護消費者健康計劃，并由歐盟于1989年作為統(tǒng)一標準在歐盟內部頒布實施。該計劃需要對肉用家畜體內的有害物質進行檢測。在該背景條件下，德國化學獸醫(yī)檢驗局CVUA-MEL承擔定期抽取動物尿液檢測類固醇任務。

德國化學獸醫(yī)檢驗局CVUA-MEL專業(yè)領導人Thorsten Bernsmann博士表示：“歐洲禁止將類固醇作為動物飼料添加劑。即便合成類固醇在尿檢中只有很低濃度。該類物質中的每種類固醇最低檢測限，也就是‘推薦濃度’值只有每升尿液1 μg，實現(xiàn)如此低的檢測限必須在檢測分析前進行樣本制備。”

人工手動提純費時費力

檢測動物尿液中類固醇樣本制備工作繁瑣，因為，需要完成兩道固相萃取操作：首先是尿液樣本離心濃縮，以便分離出固體雜質。

圖2：將尿液樣本、SPE固相萃取柱與兩個洗脫皿放入Freestyles自動化樣本制備系統(tǒng)中并開始制備樣本。第一次水解樣本萃取物提純作為磁性固相提純，要求在C18 SPE固相萃取柱中完成，然后，用濃度為5%的甲醇清洗、純甲醇洗脫；其中，洗脫出的第一毫升洗脫液不必丟棄并不能用于檢測分析。第二次提純是非磁性固相萃取，利用NH2 SPE固相萃取柱。萃取提純自動完成，最后，只需對樣本進行蒸發(fā)濃縮，在檢測分析前再用溶劑溶解開來。

然后，需要用酸堿度pH值緩沖劑調節(jié)樣本，使尿液樣本在葡萄糖醛酸酶及芳基硫酸酯酶的酶化作用下水解。通過水解，附著在糖分子上的類固醇就會脫離出來形成游離狀類固醇，這樣就可以在后續(xù)檢測過程中被檢出。

Bernsmann博士解釋：“第一次水解樣本萃取物提純是磁性固相提純，要求在C18 SPE固相萃取柱中完成，然后，用濃度5%甲醇清洗，純甲醇洗脫；其中，洗脫出的第一毫升洗脫液必須丟棄、不能用于檢測分析。第二次提純是非磁性固相萃取，使用的是NH2SPE固相萃取柱。將洗脫液收集起來，在蒸發(fā)器中蒸發(fā)，再用稀釋劑溶解，最后，才可用于檢測分析?！?/p>

Bernsmann博士表示：“自2015年起我們就在CVUA-MEL德國化學獸醫(yī)檢驗局中按照上述方式人工手動進行肉用家畜尿液類固醇檢測。這是一項非常耗費時間的檢驗分析工作：大約24份樣本就需要一名實驗員忙活一整天。樣本注入固相萃取柱后狀態(tài)不同，因為，它們濃度不同。在人工手動準備樣本時實驗員可以調節(jié)真空度；但他需要照顧到每一個樣本，因為一次要處理多個樣本。當一份樣本緩慢的流過SPE萃取柱、需要加大真空時，另一份樣本則順利的流過了萃取柱。而實驗員要避免固相萃取柱中沒有液體的空流動?！?/p>

圖3：為減輕實驗室工作人員的勞動強度，減少兩次固相萃取工作量，德國化學獸醫(yī)檢驗局CVUA-MEL不久前引進自動化樣本制備設備——模塊化機器人系統(tǒng)：Freestyle，用來測定動物尿液中的類固醇。

本刊提示：壓力較高的好處

固相萃取技術能夠完成從難以提取檢測物質樣本中提取檢測樣本，使實驗室人員能夠處理含有懸浮物或長絲基質材料，例如，含有沉積物的河水。

軟件輕松制定出檢測分析方法

從2015年2月份開始，CVUAMEL德國化學獸醫(yī)檢驗局開始用自動化樣本制備方式代替費時費力的人工手動操作；所使用的樣本制備儀器設備是LC-Tech公司的Freestyle系統(tǒng)。該模塊化機器人檢測分析儀所使用的軟件專門針對樣本制備而設計，LC-Tech公司的工藝技術開發(fā)工程師Sebastian Wierer先生表示：“它的最大特點是：兩個固相萃取交替工作，將其不同的工作方法整合到一起（稱之為SPE雙柱萃取法）。為實現(xiàn)該目標，我們對該系統(tǒng)控制軟件進行了具有針對性的設計改進，將其控制在兩個不同萃取柱中進行固相萃取。”

借助于該軟件技術改進，促使軟件技術控制的雙柱萃取控制、調整變得異常簡單：“在軟件界面窗口中，萃取過程所用的必要參數(shù)均顯示于此。只需點擊鼠標就可以選擇操作步驟并設置例如流量及壓力參數(shù)，從而定義下一個操作模式。一旦將該模式保存下來，您便可以隨時在實驗室中調取出并使用。” 為高效而快捷的完成樣本提純，CVUA-MEL德國化學獸醫(yī)檢驗局為制備該類樣本使用的是Macherey Nagel公司研發(fā)生產的Chromabond固相萃取柱。

Macherey Nagel公司的應用技術專家Hans Reiner Wollseifen博士介紹：“該種固相萃取柱不僅可以在系統(tǒng)方法研究樣本制備中使用，也可以在標準常規(guī)檢驗過程樣本制備中使用?！痹摲N固相萃取柱的基本材料保證其能夠高效濃縮與提純，并具有理想的流動性、最佳的微孔結構和很高的比表面積，適用于低試劑消耗量檢測分析使用。

Wierer先生表示：“為提高流量及減小萃取柱的無效空間，我們設計出了Chromabond固相萃取柱專用柱塞桿。沒有這一專用柱塞桿，萃取柱中的高流量常常需要等待，直至柱床上清液排空為止。目前，則可以對柱中萃取液、清洗液及洗脫液施加恒定壓力?！?/p>

圖4：德國化學獸醫(yī)檢驗局CVUA-MEL利用Machery Nagel公司研發(fā)生產的Chromabond固相萃取柱進行樣本提純。這一萃取柱非常適合于在機器人系統(tǒng)中高效的、快捷的完成樣本提純。為了減少萃取柱中的死角，提高流量，LC-Tech公司專門設計了覆蓋在固相萃取柱上的專用柱塞桿。

較小的工作量就便可獲得更準確的檢測信號

在自動化樣本制備過程中，已水解的樣本、帶有專用柱塞桿的SPE萃取柱及兩個洗脫皿都要放入自動化設備中。第一個洗脫皿用于首次固相萃取后短時間接納一部分樣本。在選擇接納第二次固相萃取樣本洗脫皿時應注意：該洗脫皿應能在Turbovap濃縮儀中蒸發(fā)濃縮。

Bernsmann博士解釋：“設備啟動后，儀器設備能夠自動完成上述介紹的兩個提純步驟；只剩樣本的蒸發(fā)濃縮和用另一種溶劑重新溶解。向Freestyles設備中放置器皿和樣本的工作，啟動一系列樣本制備的流程所需的時間僅僅是人工手動操作很小的一部分時間。而這種方法的制備出來的樣本就是手工制備的感覺一樣好。留給實驗員從事其他工作的時間，通過自動化樣本制備明顯節(jié)約實驗分析的時間”在同一過程中能夠完成處理18個樣本。

測量信號的穩(wěn)定性明顯有所提高，所有試劑均在恒定壓力下流經萃取柱與人工手動操作檢測結果相比，檢測結果標準偏差明顯降低；自動化系統(tǒng)具有比人工手動更高的可重復再現(xiàn)性及穩(wěn)定性。樣本在不同濃度、粘度幾乎不成問題。

Bernsmann先生表示：“除恒定壓力與檢查結果的可重復再現(xiàn)性能外，改用自動化樣本制備系統(tǒng)同樣帶來其他優(yōu)點及好處。就像人工手動操作，使用LCTech公司的自動化設備一周僅制備50個樣本，但采用Freestyles系統(tǒng)后明顯減少人力資源占用。原來人工手動執(zhí)行的、費時費力的SPE固相萃取與技術開發(fā)工作也可以在夜間自動進行。無人值守的樣本制備可以在周末進行。另外，檢測分析結果同樣證明該系統(tǒng)工作絕無交叉污染。使用自動化樣本制備系統(tǒng)意味贏得效率；CVUA-MEL德國化學獸醫(yī)檢驗局職工可以在Freestyles系統(tǒng)自動工作期間從事其他沒能實現(xiàn)的自動化工作。

在動物飼料中添加違禁成分，例如，類固醇類成分，從而實現(xiàn)催肥增膘快速出欄的事件并不少見。閱讀本文，您會更詳盡了解到利用自動化固相萃取技術明顯提高類固醇檢測效率的有效方法。

本文作者Sebastian Wiererm先生系Obertaufkirchen市，LC-Tech有限責任公司職工。Hans Rainer Wollseifen博士系Dueren市，Machery Nagel有限兩合公司職工。