宋青龍 袁 翔 張海燕 譙仕彥

(1.北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司，北京 100193；2.國家飼料工程技術(shù)研究中心，北京 100193)

大豆球蛋白的抗?fàn)I養(yǎng)作用及檢測技術(shù)研究進(jìn)展

宋青龍1袁 翔1張海燕1譙仕彥2*

(1.北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司，北京 100193；2.國家飼料工程技術(shù)研究中心，北京 100193)

大豆球蛋白是熱穩(wěn)定性最強(qiáng)的抗原蛋白之一，同時(shí)也是大豆引起動物過敏反應(yīng)和腹瀉的主要成分。本文重點(diǎn)闡述了大豆球蛋白對仔豬、犢牛和魚等動物的抗?fàn)I養(yǎng)作用及其作用機(jī)理，并對檢測大豆及其副產(chǎn)品中大豆球蛋白的方法進(jìn)行了分析，著重介紹了酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法的最新研究進(jìn)展，希望為大豆及其副產(chǎn)品的開發(fā)提供一定參考。

大豆球蛋白；抗?fàn)I養(yǎng)作用；檢測方法；應(yīng)用

飼糧過敏反應(yīng)的現(xiàn)象在畜禽生產(chǎn)中時(shí)有發(fā)生。大量研究發(fā)現(xiàn)，在幼齡動物飼糧中添加生大豆作為蛋白質(zhì)來源會導(dǎo)致仔豬、犢牛等幼齡動物的腸黏膜增生腫大、過敏性腹瀉、生長受阻等不良反應(yīng)，嚴(yán)重的會導(dǎo)致死亡[1-4]。已有研究證實(shí)，大豆球蛋白(glycinin)是大豆抗原蛋白中免疫原性最強(qiáng)的因子之一，約占大豆籽實(shí)蛋白總量的40%。大豆球蛋白是由6個單聚體亞基(A—S—S—B)組成的多聚體，相對分子質(zhì)量為320～360 ku。每個亞基是由酸性多肽(A)和堿性多肽(B)組成，二者由二硫鍵(S—S)鏈接起來[5]。大豆球蛋白熱穩(wěn)定性好，一般加熱處理對其滅活能力較弱。因此，了解掌握大豆球蛋白的抗?fàn)I養(yǎng)作用及其機(jī)理、檢測方法等對指導(dǎo)動物生產(chǎn)具有一定的意義。

1 大豆球蛋白的抗?fàn)I養(yǎng)作用及其機(jī)理

已有的研究發(fā)現(xiàn)，大豆球蛋白主要引起仔豬、犢牛等幼齡動物和嬰兒的過敏反應(yīng)[5-6]。劉欣[6]在小鼠試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，中低劑量的大豆球蛋白容易引發(fā)BALB/c小鼠的速發(fā)型過敏反應(yīng)，該過敏反應(yīng)是由Th1和Th2型T淋巴細(xì)胞同時(shí)介導(dǎo)但以Th2型為主的免疫反應(yīng)。研究中還發(fā)現(xiàn)，腸黏膜的T調(diào)節(jié)細(xì)胞亞群以及所分泌的抑制性細(xì)胞因子功能不足是導(dǎo)致小鼠過敏的最主要的原因。孫鵬[7]在仔豬研究中發(fā)現(xiàn)，大豆球蛋白誘發(fā)仔豬的過敏反應(yīng)為Th2型免疫反應(yīng)，此反應(yīng)是免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的速發(fā)型過敏反應(yīng)，過敏仔豬皮膚試敏反應(yīng)呈陽性，血清及腸道勻漿液中IgE抗體濃度升高，血清中大豆球蛋白特異性抗體免疫球蛋白G1(IgG1)以及Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-10水平升高，小腸肥大細(xì)胞數(shù)量和組胺釋放增加，導(dǎo)致過敏仔豬生長性能下降并發(fā)生過敏性腹瀉。Wang[8]在研究大豆球蛋白在消化系統(tǒng)代謝規(guī)律中發(fā)現(xiàn)，大豆球蛋白的免疫活性由胃到小腸逐漸下降，到回腸時(shí)，剩余大豆球蛋白的活性為5.5%，特異性結(jié)合的抗原蛋白主要分布在胃黏膜、小腸絨毛、隱窩和腸系膜淋巴結(jié)中。上述試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了斷奶仔豬飼喂含有大豆球蛋白的飼糧后可以引起絨毛高度的急劇下降、絨毛的嚴(yán)重脫落、腸黏膜淋巴細(xì)胞增生和隱窩細(xì)胞有絲分裂加快[2，9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，采用營養(yǎng)學(xué)技術(shù)可以緩解大豆球蛋白致敏活性，維生素C[10]、硫辛酸[11]、葡萄籽花青素[12]等抗氧化物質(zhì)可通過調(diào)節(jié)斷奶動物體內(nèi)輔助性T淋巴細(xì)胞Th1和Th2的平衡，減少大豆球蛋白特異性IgE的產(chǎn)生和組胺釋放，從而有效緩解由大豆球蛋白引起的斷奶應(yīng)激所導(dǎo)致的腹瀉。

最近幾年，大豆球蛋白對犢牛生產(chǎn)性能及作用機(jī)理的研究報(bào)道并不多。早期研究認(rèn)為，飼喂大豆球蛋白的犢牛小腸絨毛萎縮，隱窩細(xì)胞增生，小腸對木糖的吸收下降，進(jìn)而降低了犢牛的生產(chǎn)性能[13-15]。犢牛胃的收縮力減弱，腸道收縮能力增強(qiáng)，其結(jié)果是食糜通過時(shí)間顯著縮短，養(yǎng)分消化率降低[16-17]。其作用機(jī)制可能是，犢牛采食含有大豆球蛋白的飼糧后，大量完整的大豆球蛋白分子被直接吸收進(jìn)入血液和淋巴循環(huán)，產(chǎn)生特異性抗體介導(dǎo)的Ⅰ型過敏反應(yīng)和淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型過敏反應(yīng)，進(jìn)而破壞消化系統(tǒng)，影響營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，降低生產(chǎn)性能[18]。

大豆球蛋白對魚等水產(chǎn)動物的研究主要集中在最近10年。目前研究認(rèn)為，大豆球蛋白對魚生長性能的影響主要包括2個方面：一方面，大豆球蛋白可引起魚類腸道過敏反應(yīng)，導(dǎo)致腸道組織損傷及結(jié)構(gòu)變化，影響腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，進(jìn)而降低魚類的生長性能。Rumsey等[19]報(bào)道，飼料中大豆球蛋白含量為58.8 mg/g時(shí)，會引起虹鱒腸道結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致其生長性能下降。Baeverfjord等[20]報(bào)道，大西洋鮭飼喂豆粕后，后腸單褶皺襞和復(fù)合褶皺襞高度分別降低了44.3%和21.7%。Refstie等[21]、Ksudhik等[22]分別在虹鱒和歐洲真鱸的飼料中添加一定水平的大豆球蛋白，結(jié)果表明，魚后腸絨毛上皮的黏膜褶縮短，黏膜固有層加深加寬，同時(shí)腸黏膜發(fā)生了炎癥反應(yīng)。吳莉芳等[23]在研究大豆球蛋白對不同食性魚類生長及腸道組織的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加大豆球蛋白組的鯉和埃及胡子鲇中腸、后腸及草魚前腸、中腸、后腸的皺襞高度均極顯著低于對照組；鯉魚前腸、后腸和埃及胡子鲇后腸及草魚前腸絨毛均有不同程度破損，固有層組織較疏松而且斷裂。另一方面，飼料中添加大豆球蛋白可以使腸道消化酶活性的降低，影響魚的生長性能。吳莉芳等[24]在研究中報(bào)道，大豆球蛋白添加到30 g/kg時(shí)，鯉稚魚后腸和中腸的蛋白酶活性顯著下降，添加到60 g/kg時(shí)，鯉幼魚蛋白酶活性顯著下降，對淀粉酶活性的影響不顯著。孫玲[25]報(bào)道，飼喂含有大豆球蛋白飼料的肉食性魚類埃及胡子鯰胃、前腸、肝胰臟蛋白酶活性顯著降低，前腸和后腸淀粉酶活性顯著降低。Krogdahi等[26]研究表明，飼喂含豆粕飼料的虹鱒中腸和后腸上皮刷狀緣胞外酶、麥芽糖酶、堿性磷酸酶、乳糖酶和蔗糖酶活性均出現(xiàn)不同程度的降低?？傊蠖骨虻鞍讓︳~生產(chǎn)性能產(chǎn)生了不良影響，但是其作用機(jī)制如何，對其他水產(chǎn)動物生產(chǎn)性能是否有不良影響？這還需要進(jìn)一步做大量的研究工作。

2 大豆球蛋白的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測及應(yīng)用

目前常用的大豆球蛋白檢測方法包括聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)法、高效液相色譜法、ELISA法、免疫印跡法和免疫組織化學(xué)法。其中高效液相色譜法(包話色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法)、免疫印跡法和免疫組織化學(xué)法3種方法操作繁瑣，檢測成本高，在實(shí)際生產(chǎn)使用較少。

SDS-PAGE法屬于定性及半定量檢測，是根據(jù)大豆抗原蛋白的特征條帶染色后顏色的深淺來估算其含量。黃麗華等[27]利用SDS-PAGE分析我國828批次大豆品種種子中11S(主要成分為大豆球蛋白)和7S(主要組分為β-伴大豆球蛋白)組分相對含量及其亞基組成和各亞基含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11S在2種球蛋白中的含量為37.57%～81.42%，均值為60.30%，11S/7S值為0.60～4.38，均值為1.56。關(guān)榮霞[28]用SDS-PAGE分析了175份中國栽培大豆中11S和7S相對含量相及11S/7S值時(shí)發(fā)現(xiàn)，11S/7S值為0.77～4.67，均值為1.8；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，北方春大豆中該比值分布與整體趨勢一致，黃淮夏大豆比值分布集中在1.6～1.8，南方春大豆比值多低于1.4，而南方夏大豆比值多分布于2.0～2.2，說明不同栽培地區(qū)的大豆中大豆球蛋白的含量差異較大。麻浩等[29]采用SDS-PAGE分析了706份中國大豆種質(zhì)資源中7S、11S組分及其亞基相對含量，結(jié)果表明，11S和7S組分及其亞基相對含量具有豐富的遺傳變異。SDS-PAGE法具有操作簡單、檢測成本低等優(yōu)勢，其最主要缺點(diǎn)是不能區(qū)分抗原蛋白是否具有活性，導(dǎo)致定量不夠精確，既不利于生產(chǎn)企業(yè)對大豆及其副產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行的精準(zhǔn)監(jiān)控，又不利于飼料和養(yǎng)殖企業(yè)對其開展合理評價(jià)和選擇。

ELISA法是一種高通量的檢測方法，其特點(diǎn)是敏感度高、特異性強(qiáng)、快速簡單、易操作。彭楠等[30]采用酸沉淀和親和層析分離純化到純度為95%的大豆球蛋白，并用該純品免疫大白兔獲得多克隆抗體，建立起間接競爭ELISA法，線性檢測范圍在10～100 μg/mL。韓景華[31]獲得純度為90.1%的大豆球蛋白，并用其免疫兔子制備多克隆抗體，建立檢測大豆球蛋白的雙抗夾心ELISA法，線性檢測范圍在2.5～5 000.0 ng/mL，靈敏度達(dá)到了2.5 ng/mL。Ma等[32]用純度大于92%的大豆球蛋白免疫小鼠制備了單克隆抗體4B2，建立了大豆球蛋白的競爭性ELISA法，其線性檢測范圍在0.3～11.2 μg/mL，檢測限達(dá)到了0.3 ng/mL。布冠好等[33]用純品大豆球蛋白免疫兔子制備多克隆抗體，建立大豆球蛋白的間接競爭ELISA檢測方法，線性檢測范圍在0.01～0.05 μg /mL。陳靜舒[34]用人工分離純化純度大于85%的大豆球蛋白制備兔多克隆抗體和鼠單克隆抗體，建立雙抗夾心ELISA法檢測大豆球蛋白含量，該方法的線性范圍為3～200 ng/mL，靈敏度達(dá)到1.63 ng/mL。張?jiān)妶騕35]采用自制的大豆球蛋白免疫兔子制備的多克隆抗體為一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記抗兔免疫球蛋白G(IgG)為酶標(biāo)二抗，建立了直接ELISA法檢測大豆及其制品中大豆球蛋白含量，靈敏度達(dá)到10 ng/mL。隨著蛋白純化和克隆抗體技術(shù)的進(jìn)步，使用檢測成本低，精準(zhǔn)快捷的ELISA法檢測大豆及其制品中大豆球蛋白和其他抗原蛋白含量將是實(shí)際生產(chǎn)中一種較好的選擇。

目前，我國飼料行業(yè)常用的大豆加工產(chǎn)品包括有膨化大豆、豆粕、帶皮豆粕、去皮豆粕、去皮膨化豆粕、發(fā)酵豆粕、大豆分離蛋白以及大豆?jié)饪s蛋白等。作者總結(jié)了近幾年采用ELISA法檢測大豆及其副產(chǎn)品中大豆球蛋白含量的試驗(yàn)研究，從表1可以看出，大豆經(jīng)過加工提油后生成豆粕，無論是從均值還是區(qū)間值看，大豆球蛋白含量沒有發(fā)生較大的變化。而發(fā)酵豆粕、膨化大豆、大豆?jié)饪s蛋白、大豆分離蛋白等大豆和豆粕的深加工產(chǎn)品中大豆球蛋白含量均有較大幅度的降低，說明大豆通過一般性的加工手段(壓榨等)不能有效降低大豆球蛋白的含量，而通過生物發(fā)酵、高溫等深加工處理可以降低其的含量，但是也不能徹底去除。此外，高溫對大豆及其產(chǎn)品中的主要營養(yǎng)物質(zhì)影響較大。因此，開發(fā)既保證大豆中的主要營養(yǎng)物質(zhì)含量，又降低大豆球蛋白等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的加工工藝，是動物營養(yǎng)學(xué)者面臨的一個重要課題。

大豆蛋白質(zhì)約占大豆籽粒的40%，大豆球蛋白是純化的11S大豆球蛋白，是大豆蛋白質(zhì)中最大的單體成分，占大豆籽實(shí)蛋白質(zhì)總量的25%～35%[18]。據(jù)此推算1 g大豆中理論上含有100～140 mg大豆球蛋白。從表1中可以看出，899份生大豆中大豆球蛋白含量與理論值非常接近，說明ELISA法是一種比較準(zhǔn)確的檢測方法，能真實(shí)地反映大豆及其制品中大豆球蛋白的含量。

表1 大豆及其加工產(chǎn)品中大豆球蛋白含量

續(xù)表1種類Types大豆球蛋白含量Glycinincontent(mg/g)樣本數(shù)Samplenumber樣本來源Samplesource參考文獻(xiàn)References發(fā)酵豆粕Fermentedsoybeanmeal≤109．3454山東、河南、廣東、天津、江西和遼寧等13個省楊玉娟等[38]52．4(均值)188北京、天津、山東、河南、內(nèi)蒙、遼寧、湖北和四川等周天嬌等[36]大豆分離蛋白Soybeanproteinisolate12．0(均值)2北京周天嬌等[36]大豆?jié)饪s蛋白Soybeanproteinconcentrate2．4(均值)6廣西和山東周天嬌等[36]

3 小 結(jié)

大豆球蛋白作為大豆中的主要耐熱型抗?fàn)I養(yǎng)因子，對使用大豆及其副產(chǎn)品作為飼料原料的動物(特別是幼齡動物)都會產(chǎn)生不良的影響。目前對于仔豬和犢牛生產(chǎn)性能影響的研究較多，需要進(jìn)一步研究如何更準(zhǔn)確使用不同含量的大豆球蛋白的飼料原料，做到精準(zhǔn)飼喂，降低影響。對于水產(chǎn)動物的研究也相對較多，需要研究大豆球蛋白對不同種類的水產(chǎn)動物生產(chǎn)性能的影響和作用機(jī)理，做到精準(zhǔn)使用。

ELISA法具有操作簡便、快速準(zhǔn)確、價(jià)格低等優(yōu)勢，是一種測定大豆及其副產(chǎn)品中大豆球蛋白含量的可行方法，但由于大豆副產(chǎn)品較多，成分復(fù)雜，需要研究不同的前處理方法，避免雜質(zhì)干擾。此外，大豆球蛋白由6個亞基構(gòu)成，有些品種大豆球蛋白某些亞基會缺失，需制備更多的單克隆抗體，提高檢測的準(zhǔn)確性。

大豆球蛋白作為豆科植物在抵御外部不良環(huán)境時(shí)產(chǎn)生的一類物質(zhì)，既具有營養(yǎng)價(jià)值，又具有明顯的抗?fàn)I養(yǎng)作用。因此，如何保持大豆及其副產(chǎn)品中蛋白質(zhì)營養(yǎng)又適當(dāng)降低其中的抗原蛋白含量需要進(jìn)一步探討。大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子對畜禽和水產(chǎn)動物特別是幼齡動物生長性能均有較大影響，能否將大豆球蛋白和其他抗?fàn)I養(yǎng)因子作為大豆及其副產(chǎn)品質(zhì)量好壞的評價(jià)指標(biāo)亦需要營養(yǎng)學(xué)者的進(jìn)一步研究和推動。

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ProgressinAnti-NutritionalActionofGlycininandItsDetectionTechnology

SONG Qinglong1YUAN Xiang1ZHANG Haiyan1QIAO Shiyan2*

(1.BeijingLongkefangzhouBio-EngineeringTechnologyCo.,Ltd.,Beijing100193,China; 2.NationalFeedEngineeringTechnologyResearchCenter,Beijing100193,China)

Glycinin is one of the most thermal stability soybean antigenic protein, as well as an allergen, which is the main component causing the allergy and diarrhea of animals. The paper mainly expounded the anti-nutritional action and resistance mechanism of glycinin for piglets, calves and fishes, analyzed the detection methods of glycincin in soybean and its by-products, and emphatically introduced the latest research progress of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) detection method, aiming to provide references for the use of soybean and its by-products.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(12)：4260-4265]

glycinin; antinutritional action; detection method; application

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.12.003

S816

A

1006-267X(2017)12-4260-06

2017-05-05

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金——大豆主要抗?fàn)I養(yǎng)因子快速檢測試劑盒的中試生產(chǎn)(2014GB2A000264)

宋青龍(1974—)，男，吉林東豐人，中級畜牧師，碩士，從事生物飼料及飼料檢測技術(shù)研究。E-mail: sql19972002@126.com

*通信作者：譙仕彥，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: qiaoshy@nferc.org

*Corresponding author, professor, E-mail: qiaoshy@nferc.org

(責(zé)任編輯 田艷明)