王艷萍 ，高 帥 ，劉 迥 ，梁 鞏 ，張 媛 ，曾維斌 *

（1. 石河子大學動物科學學院，新疆石河子 832003；2. 塔里木大學動物科學學院，新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300；3.中國農業(yè)大學動物科技學院，北京 100193）

王艷萍1,2，高 帥3，劉 迥1，梁 鞏1，張 媛1，曾維斌1,2*

（1. 石河子大學動物科學學院，新疆石河子 832003；2. 塔里木大學動物科學學院，新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300；3.中國農業(yè)大學動物科技學院，北京 100193）

本研究旨在探究不同年齡、不同部位新疆驢皮中?型膠原蛋白2個亞基基因（COL1A1、COL1A2）mRNA的表達量及其蛋白含量的差異，確定宰驢取皮的年齡段，以提高驢皮的利用率。對不同年齡段新疆驢背部皮膚組織，應用RT-qPCR、Western blotting技術檢測膠原蛋白基因的表達量及其蛋白含量；對新疆驢不同部位皮膚進行HE染色切片與RT-qPCR技術分析。結果表明：6～7歲年齡段的驢皮中COL1A1、COL1A2基因的表達量及其蛋白含量顯著高于其他各年齡段（P<0.05）。從組織切片上可以看到，驢皮背部與頸部的膠原纖維密集且多，而臉部的疏松且少，腿部和腹部居中；這與其膠原蛋白基因RT-qPCR的結果相一致。綜上，6～7歲年齡段的新疆驢背部皮膚中，膠原蛋白基因的表達量及含量最高，故此年齡段可作為宰驢取皮的最佳年齡段。

驢皮；膠原蛋白；基因

驢皮是生產阿膠的唯一原料。驢真皮中的主要蛋白質是?型膠原蛋白，它是由2條相同的α1鏈（由COL1A1基因表達）和1條α2鏈（由COL1A2基因表達）組成的異質膠原，它和血清白蛋白等多肽類物質、多糖類物質及其他小分子物質構成了阿膠的主要成分[1]。

皮膚膠原蛋白及透明質酸是由真皮層內的成纖維細胞合成的，隨著皮膚組織與真皮成纖維細胞的不可避免性衰老，膠原蛋白的表達量將逐漸降低[2]。TGF-β1/Smad信號通路調節(jié)真皮成纖維細胞?、IV型膠原蛋白的表達量，此通路上正向調控膠原蛋白表達的基因也隨著年齡的增加其表達量呈顯著降低趨勢[3]。50～70年齡段女性乳腺皮膚中，IV型膠原蛋白的表達量較30～50年齡段的降低63%[4]。從死亡24 h內、平均年齡23.3歲的成年男性尸體腹部肌肉樣品中，檢測到?、IV型膠原蛋白的含量及密度都顯著高于平均年齡為46.2歲的[5]。RT-qPCR技術檢測來自不同年齡鼠尾部皮膚原代成纖維細胞中基因的表達量，發(fā)現(xiàn)青年組成纖維細胞中COLl、COL3基因mRNA的表達量顯著高于老年組[6]。

在生產實踐中，青年驢因皮膚薄而熬制的阿膠較少；老年驢相對皮厚，能得到較高重量的阿膠，但年齡太老，會導致驢皮中的膠原蛋白含量因老齡而大量流失，且養(yǎng)殖的時間越長，飼養(yǎng)成本則相應提高。在集約化養(yǎng)殖業(yè)中，具體在哪個年齡段“宰驢取皮”才能得到最高的膠原蛋白，目前僅憑借養(yǎng)殖經驗來估計，故本研究擬通過分子生物學的技術，檢測不同年齡段、不同部位驢皮中膠原蛋白的含量，為現(xiàn)代化生產中“宰驢取皮”的最佳年齡段的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 皮膚樣本的采集 本研究所用新疆驢皮膚組織采自于阿克蘇肉驢屠宰場，通過驢的齒齡和初生記錄，選定體重一致、體況良好的0～1、2～3、4～5、6～7、8～9、10～11、12～13歲年齡段的新疆驢各5只，屠宰前刮去需采樣部位的被毛，現(xiàn)場屠宰后，迅速采集驢皮組織樣，并立即置于液氮中，然后保存于-80℃冰箱，用于總RNA與蛋白的提取。另外，將其中一部分6～7歲驢背、腹、頸、腿（后肢小腿）、面部皮膚組織樣置于10%甲醛溶液中用于組織切片的制作。

1.2 主要試劑 Trizol和Ranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit均 購 于Life Technologies公 司；LightCycler 480 SYBR Green I Master購于Roche公司；蛋白裂解液為RIPA裂解液（中），購于康為世紀；瓊脂糖購于Thermo scientific公司；?型膠原蛋白一抗為Anti-Collagen I抗體（貨號ab34710）購于abcam公司，內參Gapdh的一抗為Anti-Gapdh抗體（貨號G9545）購于Sigma公司。二抗均為羊抗兔，購于中杉金橋公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 RT-qPCR技術檢測 膠原蛋白COL1A1、COL1A2基因mRNA的表達量總RNA的提?。翰捎肨RIzol（異硫氰酸胍）-酚-氯仿一步抽提法按試劑盒說明書提取總RNA，經紫外分光光度計檢測 OD260/OD280>1.9。

反轉錄cDNA： cDNA 第 1 鏈的合成，使用20 μL體系，主要包括反應緩沖液、10 mmol/L dNTP、1 μg 總 RNA（0.1 μg RNA）、50 U RNase inhibitor、50 U AMV 反轉錄酶、1.6 μg oligo（dT）15；此體系于42℃反應30 min，99℃ 5 min 終止反應，最終反轉錄出cDNA。

引物設計及熒光定量PCR: 根據NCBI中公布的COL1A1、COL1A2基因mRNA的序列，采用Primer 5.0軟件設計1對引物，并交invitrogen公司北京合成部合成。建立 100 μL的反應體系，用熒光定量試劑盒，定量PCR檢測?型膠原蛋白COL1A1、COL1A2基 因mRNA的 表 達 量。實驗中使用Gapdh作為內參基因。驢皮膠原蛋白COL1A1、COL1A2基因引物序列見表1。

1.3.2 膠原蛋白的Western blot表達量檢測 將蛋白裂解液加入到真皮組織中，冰上孵育30 min后，離心提取蛋白上清，經Bradford assay法檢測蛋白濃度。將蛋白樣品等量(約30 μg)加樣按照常規(guī)步驟進行SDS-PAGE電泳，電轉膜，封閉，抗體孵育和發(fā)光檢測。一抗稀釋濃度分別為膠原蛋白?(1:500)，Gapdh (1:3000)；二抗為羊抗兔（1:5000）；蛋白條帶經軟件Quantity One定量分析。

1.3.3 驢皮組織切片制作 驢皮膚組織用10%甲醛固定，石蠟包埋。切片厚度為7 μm。展片水溫40℃，烤片溫度為55℃，烤片3 h。應用常規(guī)HE染色法染色，其過程包括脫蠟、脫水、染色、分化、促藍、透明等過程，染色后再進行脫水與封片。

1.4 統(tǒng)計分析 應用11.5版SPSS軟件的單因素方差分析對數(shù)據進行統(tǒng)計學處理，所有試驗至少重復3次，數(shù)據用平均數(shù)±標準差進行表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 不同年齡驢背部皮膚中COL1A1、COL1A2基因mRNA的水平變化 不同年齡驢背部皮膚中膠原蛋白的表達量完全不同（表2），6～7歲驢背部皮膚中COL1A1、COL1A2基因mRNA的表達水平顯著高于其他年齡段（P<0.05），其次為4～5歲年齡段膠原蛋白的表達量，其余年齡段的表達量都比較低，尤其在驢9歲以后，COL1A2基因的mRNA幾乎不表達。比較兩個基因的表達量可見，驢各年齡段COL1A1基因的mRNA表達水平遠高于COL1A2基因的表達量（P<0.05）。

2.2 不同年齡段驢背部皮膚中膠原蛋白的含量變化不同年齡驢背部皮膚中I型膠原蛋白的含量完全不同（圖1），與膠原蛋白的組成基因表達量相一致（表2），6～7歲驢背部皮膚中膠原蛋白的含量顯著高于其他年齡段的（P<0.05），其次是4～5年齡段膠原蛋白的含量，其余年齡段的含量都比較低。

表1 COL1A1、COL1A2基因的引物序列

表2 不同年齡段驢皮中COL1A1、COL1A2基因mRNA的相對表達水平變化

圖1 不同年齡段驢皮中膠原蛋白的含量

2.3 6～7歲不同部位驢皮膚組織結構特點 在低倍（4×10）顯微鏡下觀察到，驢的皮膚從外向內由表皮和真皮組成，表皮比較薄，由復層扁平上皮構成（圖2）。真皮比較厚，由大量的膠原纖維和少量的彈性纖維、網狀纖維及細胞組成。驢皮膚真皮層中，膠原纖維HE染色呈現(xiàn)粉紅色，且排列密度隨部位不同呈現(xiàn)一定的差異。背部和頸部膠原纖維縱橫交錯，排列細密且含量多，其次是腿部和腹部，膠原纖維排列比較疏松，臉部皮膚膠原纖維含量最少。

圖2 驢背部、腹部、頸部、腿部和臉部皮膚組織的HE染色

2.4 6～7歲驢不同部位驢皮中COL1A1、COL1A2基因RT-qPCR結果 6～7歲驢不同部位驢皮中膠原蛋白的表達量不同（表3），頸部和背部皮膚中COL1A1、COL1A2基因mRNA的表達水平顯著高于臉部的（P<0.05），腹部和腿部膠原蛋白的表達量居中，各部位皮膚中，COL1A1基因的mRNA表達水平遠高于（P<0.05）COL1A2基因的表達量。

表3 不同部位驢皮中COL1A1、COL1A2基因mRNA的相對表達水平變化

3 討 論

膠原作為一種結構蛋白，是人體皮膚的主要成分，膠原蛋白形成皮膚支架，使皮膚具有彈性、光澤，而富含膠原蛋白的組織很容易表現(xiàn)出一些與年齡相關的生理變化，隨著人的衰老，成纖維細胞數(shù)量減少，則膠原蛋白分泌減少，造成皮膚中層萎縮，即出現(xiàn)魚尾紋、額頭紋、鼻唇溝變深等現(xiàn)象，因此膠原蛋白一直被當作探討衰老機制的一個重要指標[7]。檢測不同年齡組女性單位面積皮膚膠原量的變化表明，幼年和青少年時期皮膚較薄，含水量較多，單位面積皮膚的膠原量相對較少，30 歲以后，由于真皮成纖維細胞數(shù)量逐漸減少，活力下降，膠原分泌也減少[8]。人到老年時，皮膚中的?型膠原蛋白會大量流失，皮膚將變的薄且脆弱，受傷后愈合遲緩，10～64 歲年齡段女性皮膚成纖維細胞內，膠原蛋白的表達量與年齡呈顯著相關性[9]。

動物在進入老年皮膚中膠原蛋白流失之前，由于膠原蛋白是真皮的主要組織成分，其皮膚的厚度和膠原蛋白的含量呈正相關性[10]，不同動物的真皮厚度各異，牦牛皮頸部最厚，厚度達到 9.24 mm，臀部次之，腹部最薄，厚度僅為 4.50 mm，頸部的厚度是腹部的2倍[11]。澳大利亞美利奴綿羊真皮層以臀部最厚，頸部次之，腹部最薄，臀部與腹部厚度之比約為 1.6:1[12]，而關于驢真皮中的膠原蛋白表達及厚度等情況還未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，驢皮中的膠原蛋白的表達量及總含量隨年齡不同而異，在6～7 歲驢背部皮膚中COL1A1、COL1A2基因mRNA的表達水平顯著高于其他年齡段的（P<0.05），而且其背部、頸部皮膚中膠原蛋白的表達量和組織切片的結果顯示其含量最高，且顯著高于面部的（P<0.05），這與其他家畜各部位的厚度情況基本一致，在生產實踐中，制作高品質阿膠時，驢腿部和面部的皮膚作為下腳料應被棄用。

4 結 論

6～7歲年齡段的新疆驢皮膚中，膠原蛋白的COL1A1、COL1A2基因mRNA的表達量和其含量都最高，故此年齡段為“宰驢取皮”的最佳時期。

[1]Cheng X L, Wei F, Xiao X Y,et al. Identification of five gelatins by ultra performance liquid chromatography/timeof-flight mass spectrometry (UPLC/Q-TOF-MS) using principal component analysis [J]. J Pharm Biomed Anal,2012, 62: 191-195.

[2]Kremer A, Ribitsch I, Reboredo J,et al. Three-Dimensional Coculture of Meniscal Cells and Mesenchymal Stem Cells in Collagen Type I Hydrogel on a Small Intestinal Matrix-A Pilot Study Toward Equine Meniscus Tissue Engineering[J]. Tissue Engineering Part A, 2017, 5: 390- 402.

[3]Silbiger S, Lei J, Ziyadeh F N,et al. TGF-beta1-stimulated type IV collagen gene transcription in murine mesangial cells [J]. Am J Physiol, 1998, 274: 1113-1118.

[4]F J, D E, R L,et al. Aging decreases collagen IV expression in vivo in the dermo-epidermal junction and in vitro in dermal fi broblasts: possible involvement of TGF-β1[J]. Eur J Dermatol, 2016, 26(4): 350-360.

[5]Calvi E N C, Nahas F X, Barbosa M V ,et al. Collagen fibers in the rectus abdominis muscle of cadavers of different age [J]. Hernia, 2014, 18: 527-533.

[6]宋仁剛. ANGPTL-1基因在老化鼠尾皮膚成纖維細胞中的表達及意義[J]. 組織工程與重建外科雜志, 2012, 8(5):264-266.

[7]Larson B J, Longaker M T, Lorenz H P. Scarless fetal wound healing: A basic science review[J]. Plast Reconstr Surg,2010, 126: 1172-1180.

[8]Sudel K M, Venzke K, Mielke H,et a1. Novel aspects of intrinsic and extrinsic aging of human skin:beneficial effects of soy extract[J]. Photoehem Photobiol, 2005, 8l(3):581-587.

[9]Quan T H, Shao Y, He T. Reduced Expression of Connective Tissue GrowthFactor (CTGF/CCN2) Mediates Collagen Loss in Chronologically Aged Human Skin[J]. J Invest Dermatol, 2010, 130: 415-424.

[10]Dang Y, Liu B, Liu L,et al. The 800-nm diode laser irradiation induces skin collagen synthesis by stimulating TGF-β/Smad signaling pathway[J]. Lasers Med Sci, 2011,26: 837-843.

[11]左秋, 陳武勇, 張濤, 等. 基于裘皮制作的西藏牦牛皮組織結構研究[J]. 皮革科學與工程, 2010, 20(3): 14-18.

[12]陳敏, 程海明, 孫丹紅, 等. 澳大利亞美利奴綿羊皮組織結構觀察[J]. 皮革科學與工程, 2002, 12(6): 11-14.

S822.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-041

2017-04-21；

2017-06-13

國家自然科學基金項目（31360530、31260531）；兵團塔里木畜牧科技重點實驗室項目（HS201503）

王艷萍（1978-），女，甘肅渭源人，碩士，副教授，主要從事基礎獸醫(yī)學和動物生殖技術的研究，E-mail：wypdky@126.com

*通訊作者：曾維斌，副教授，主要從事動物繁殖與生物技術的研究，E-mail：zwbdky@126.com