熊鏵龍，蔣左玉，張儒學，馮亞楠，姚俊杰，梁 琍

( 1.貴州省甕安縣農(nóng)村工作局，貴州 甕安 550400； 2.北京好未來教育摩比事業(yè)部，北京 100000；3.貴州大學 動物科學學院 水產(chǎn)科學系，貴州 貴陽 550025；4.銅仁學院 生物與農(nóng)林工程學院，貴州 銅仁 554300 )

鹽酸恩諾沙星對雜交鱘幼魚肝臟抗氧化酶活性的影響

熊鏵龍1，蔣左玉1，張儒學1，馮亞楠2，姚俊杰3，梁 琍4

( 1.貴州省甕安縣農(nóng)村工作局，貴州 甕安 550400； 2.北京好未來教育摩比事業(yè)部，北京 100000；3.貴州大學 動物科學學院 水產(chǎn)科學系，貴州 貴陽 550025；4.銅仁學院 生物與農(nóng)林工程學院，貴州 銅仁 554300 )

在水溫(17.5±0.5) ℃和鹽酸恩諾沙星質(zhì)量濃度1.56、6.25、25.00 mg/L和100.00 mg/L 下，采用生化和半靜態(tài)亞急性毒性方法研究了鹽酸恩諾沙星對體質(zhì)量(10.26±2.37) g雜交鱘(施氏鱘♀×西伯利亞鱘♂)幼魚肝臟中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響。試驗結果顯示，鹽酸恩諾沙星對雜交鱘幼魚96 h半致死質(zhì)量濃度>100.00 mg/L，屬于低毒。各試驗劑量鹽酸恩諾沙星均顯著影響雜交鱘幼魚肝臟超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性(P<0.05)，且隨時間的延長超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性均呈先升后降變化，即先誘導后抑制，但3種抗氧化酶活性被誘導的程度在時間上具有差異性。低質(zhì)量濃度組(1.56、6.25 mg/L)酶活性峰值出現(xiàn)較晚，高質(zhì)量濃度組(25.00、100.00 mg/L)酶活性峰值出現(xiàn)較早，表明高質(zhì)量濃度下魚體首先出現(xiàn)氧化應激反應，鹽酸恩諾沙星引起的酶活性變化與暴露質(zhì)量濃度和時間有一定相關性。

鹽酸恩諾沙星；雜交鱘幼魚；肝臟；抗氧化酶

鹽酸恩諾沙星又名乙基環(huán)丙沙星、恩氟沙星，是第三代氟喹諾酮類動物專用藥，具有高效、廣譜、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星對疾病防治也具有很好的效果，目前已廣泛應用于魚、蝦、蟹等疾病防治中。但作為常用漁藥，它對水生生物的生態(tài)效應和生態(tài)環(huán)境的潛在影響尚未有明確的認識和評價[1]。而抗氧化酶活性是魚類氧化脅迫的生物標志物，在一定程度上能評價水體污染度、藥物安全性和機體氧化損傷度[2]。因此，研究漁藥對魚類抗氧化功能的影響具有一定生態(tài)和生理意義。

研究證實，喹諾酮類藥物能影響水生生物體內(nèi)抗氧化酶的活性，在體內(nèi)代謝過程中會產(chǎn)生一些有親電子活力的中間產(chǎn)物，影響生物體內(nèi)抗氧化酶活性的變化[3]。Vaccaro等[4-5]研究表明，恩諾沙星對鱸魚(Dicentrarchuslabrax)、小體鱘(Acipenserruthenus)和施氏鱘(A.schrenckii)多功能氧化還原酶細胞色素P450酶系的活性有一定的抑制作用，且隨給藥量的增加酶活性逐漸降低。李紹戊等[6]研究表明，在不同恩諾沙星給藥量下，小體鱘與施氏鱘血漿和肌肉中超氧化物歧化酶活性先升后降，40 mg/kg劑量組活性最高。盧彤巖等[7-8]發(fā)現(xiàn)，達氟沙星能不同程度地誘導施氏鱘肝臟、紅細胞抗氧化酶活性，高劑量組超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性最強，在100 mg/kg時，達氟沙星對紅細胞中谷胱甘肽過氧化物酶產(chǎn)生一定的誘導作用，說明高劑量組首先表現(xiàn)出誘導現(xiàn)象和氧化應激反應。張喆等[9]研究諾氟沙星對中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)肌肉和鰓中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性影響的研究時也表明，高劑量組促進了兩種酶的活性。類似的結果在諾氟沙星對小體鱘和施氏鱘血漿和肝臟中超氧化物歧化酶活性影響，氧氟沙星對錦鯉(Cyprinuscarpio)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶活性和丙二醛含量的影響等研究中也得到證實[10-11]。

鱘魚是一種很古老的軟骨硬鱗魚類，衍生出很多重要的經(jīng)濟雜交鱘。研究證實，雜交鱘生長快，抗病性強，經(jīng)濟效益高[12-13]，廣泛在我國養(yǎng)殖。本試驗研究了鹽酸恩諾沙星對雜交鱘[施氏鱘♀×西伯利亞鱘(A.baeri)♂]幼魚肝臟中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響，以期評價該漁藥對雜交鱘幼魚的安全性，為該藥在水產(chǎn)動物疾病治療中的應用提供一些基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚為貴州省畢節(jié)地區(qū)金沙縣鱘魚苗種場培育的人工繁殖雜交鱘(施氏鱘♀×西伯利亞鱘♂)幼魚，平均體長(12.35±0.94) cm，平均體質(zhì)量(10.26±2.37) g。挑選無病體質(zhì)健壯的個體用于試驗，試驗前在水族箱中暫養(yǎng)2 d，試驗前1 d不投餌。

1.2 方法

1.2.1 預試驗

預試驗按靜水毒性法在50 L水族箱中進行，設4個質(zhì)量濃度梯度組(5.0、25.0、250.0、2500.0 mg/L)，每一梯度組設置3個平行，每組放入30尾魚，第0、24、48、72 h和96 h觀察、記錄魚存活。按Karber法計算96 h半致死質(zhì)量濃度。

在96 h預試驗中，各質(zhì)量濃度組均未見試驗魚異常及死亡，說明鹽酸恩諾沙星對雜交鱘幼魚半致死質(zhì)量濃度>100 mg/L。根據(jù)魚類急性毒性試驗的極限試驗[14]，可確定鹽酸恩諾沙星對雜交鱘幼魚為低毒物質(zhì)，不需要再進行急性毒性試驗。

1.2.2 亞急性毒性試驗

根據(jù)極限試驗規(guī)定，以100 mg/L為最大質(zhì)量濃度組，按等對數(shù)間距設置4個質(zhì)量濃度梯度組和1個空白對照組：0、1.56、6.25、25、100 mg/L。將已馴養(yǎng)的試驗魚隨機放入50 L水箱內(nèi)進行15 d亞急性毒性試驗，每組3個平行，每個質(zhì)量濃度組30尾。試驗中連續(xù)充氣，保持溶解氧>6.0 mg/L，水溫為(17.5±0.5) ℃，每8 h更換一次藥液。

1.2.3 取樣方法

試驗開始后24、96、168、240 h和312 h時自各質(zhì)量濃度水箱中隨機取3尾魚，置于冰盤內(nèi)解剖。將取出的肝臟組織用預冷的生理鹽水清洗，濾紙吸干水分后置于5 mL離心管中，于冰箱中-80 ℃保存待測。

1.3 酶液制備

取不同時期的樣品，加入樣品質(zhì)量10倍體積的預冷重蒸水，在玻璃勻漿器中冰浴勻漿，9000～10 000 r/min冷凍離心30 min，上層為油層，下層為沉淀，小心取中間層，3000 r/min再次離心后取上清液測定消化酶活力。酶液置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆?，?4 h內(nèi)分析完畢。

1.4 抗氧化酶活性的測定

采用考馬斯亮藍法測定酶液蛋白含量。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活性均采用南京建成生物技術有限公司試劑盒測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差(n=9)表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，用Duncan′s法對均值進行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 鹽酸恩諾沙星對雜交鱘幼魚肝臟超氧化物歧化酶活性的影響

不同劑量鹽酸恩諾沙星對雜交鱘幼魚肝臟超氧化物歧化酶活性的影響見圖1。由圖1可知，在24、96 h和168 h各質(zhì)量濃度組超氧化物歧化酶活性均顯著或極顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01)，在240 h時1.56、6.25 mg/L質(zhì)量濃度組超氧化物歧化酶活性極顯著高于對照組(P<0.01)，100.00 mg/L質(zhì)量濃度組超氧化物歧化酶活性極顯著低于對照組(P<0.01)，312 h時1.56 mg/L質(zhì)量濃度組超氧化物歧化酶活性極顯著高于對照組(P<0.01)，6.25、25.00 mg/L質(zhì)量濃度組超氧化物歧化酶活性稍高于對照組，差異不顯著(P>0.05)，100.00 mg/L質(zhì)量濃度組超氧化物歧化酶活性極顯著低于對照組(P<0.05)。在各質(zhì)量濃度組中，隨著暴露時間的延長超氧化物歧化酶活性先升后降，1.56 mg/L質(zhì)量濃度組在240 h時活性最高，其余3個質(zhì)量濃度組均在168 h時活性最大。

2.2 鹽酸恩諾沙星對雜交鱘幼魚肝臟過氧化氫酶活性的影響

不同劑量鹽酸恩諾沙星對雜交鱘幼魚肝臟過氧化氫酶的影響見圖2。由圖2可知，在各試驗劑量下肝臟過氧化氫酶活性隨暴露時間的延長均呈先升后降的變化趨勢，1.56 mg/L質(zhì)量濃度組在240 h時活性最高，6.25、25.00 mg/L質(zhì)量濃度組在168 h時活性最高，100.00 mg/L在96 h時活性達到最大值。在168 h內(nèi)各質(zhì)量濃度組酶活性均顯著或極顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01)；暴露至240 h時，僅1.56 mg/L質(zhì)量濃度組酶活性極顯著高于對照組(P<0.05)，100.00 mg/L高質(zhì)量濃度組酶活性顯著低于對照組(P<0.05)；暴露至312 h時，除1.56 mg/L質(zhì)量濃度組酶活性顯著高于對照組外(P<0.05)，其余3個組酶活性均低于對照組，且25.00 mg/L和100.00 mg/L兩組極顯著低于對照組(P<0.01)。

圖1 鹽酸恩諾沙星對雜交鱘幼魚肝臟超氧化物歧化酶活性的影響

圖2 鹽酸恩諾沙星對雜交鱘幼魚肝臟過氧化氫酶活性的影響

圖3 鹽酸恩諾沙星對雜交鱘幼魚肝臟谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

2.3 鹽酸恩諾沙對雜交鱘幼魚肝臟谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

不同劑量鹽酸恩諾沙星對雜交鱘幼魚肝臟谷胱甘肽過氧化物酶的影響見圖3。由圖3可知，隨暴露時間的延長，各質(zhì)量濃度組肝臟谷胱甘肽過氧化物酶活性呈先升后降趨勢，暴露至240 h時，1.56、6.25 mg/L兩組活性達到最大值，而25.00、100.00 mg/L質(zhì)量濃度組在暴露96 h時達到最大值。暴露至168 h內(nèi)的各質(zhì)量濃度組酶活性均顯著或極顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01)，至312 h時，1.56、6.25 mg/L活性極顯著高于對照組(P<0.01)，100.00 mg/L組極顯著低于對照組(P<0.01)。

3 討 論

活性氧是機體新陳代謝、殺傷異源物質(zhì)、抗應激時產(chǎn)生的一類重要物質(zhì)，包括氧自由基、羥自由基和過氧化氫等。如不及時清除這些物質(zhì)就會對機體產(chǎn)生氧化損傷。清除這些物質(zhì)需要抗氧化酶的參與，抗氧化酶存在于所有生物組織。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶作為生物體內(nèi)3種重要的抗氧化酶，對阻斷羥自由基起關鍵作用。超氧化物歧化酶是機體內(nèi)唯一一種清除氧自由基的酶，可使氧自由基歧化生成過氧化氫和氧氣，而過氧化氫在過氧化氫酶或谷胱甘肽過氧化物酶的作用下生成水和氧氣，消除氧自由基對機體的氧化損傷[15]。

鹽酸恩諾沙星對雜交鱘幼魚半致死質(zhì)量濃度>100 mg/L，屬低毒物質(zhì)，但其作為一種外來物質(zhì)進入魚體，可使魚體產(chǎn)生過多活性氧，導致活性氧代謝失衡。相關研究表明，恩諾沙星、諾氟沙星、達氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星等喹諾酮類漁藥對魚類抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性或脂類氧化損傷指標丙二醛含量等的影響均表現(xiàn)為先誘導后抑制效應，隨時間的延長主要表現(xiàn)為抑制效應，且高質(zhì)量濃度下首先表現(xiàn)出誘導現(xiàn)象[5-11]。本試驗表明，在同一鹽酸恩諾沙星質(zhì)量濃度下，隨暴露時間的延長，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性均呈先升后降的變化趨勢，但3種抗氧化酶活性被誘導的程度在時間上具有差異性。在低質(zhì)量濃度(1.56 mg/L和6.25 mg/L)下，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶隨暴露時間的延長，其活性被顯著誘導，但表現(xiàn)出一定時間的滯后性，在240 h時超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性達到最高，顯著高于24 h和96 h超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性。而過氧化氫酶在24 h時各試驗劑量處理組之間差異較小，隨暴露時間的延長，過氧化氫酶活性顯著增強，在168 h時活性達到最大值，隨后開始下降。而在高質(zhì)量濃度(25.00 mg/L和100.00 mg/L)下，滯后性提前，3種酶均在96 h時活性達到峰值。這與相關的研究結果相類似[16-17]。

肝臟作為魚體重要的解毒器官，對外來藥物的應激反應比較迅速。本試驗發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量濃度組(100.00 mg/L)鹽酸恩諾沙星對雜交鱘肝臟中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性出現(xiàn)誘導的時間比低質(zhì)量濃度組(1.56 mg/L)要早， 但在低質(zhì)量濃度組中活性被誘導的時間比高質(zhì)量濃度組長，說明高質(zhì)量濃度下魚體首先出現(xiàn)氧化應激反應，但此過程持續(xù)時間短。其可能原因為，在低質(zhì)量濃度下，雜交鱘幼魚對鹽酸恩諾沙星具有一定的適應反應過程，促使3種酶活性隨暴露時間的延長而升高，以增強機體對氧自由基、羥自由基和過氧化氫等物質(zhì)的清除能力。但由于藥物在機體內(nèi)代謝都有富集效應，隨暴露時間延長魚體內(nèi)藥物含量增大，氧自由基增多，超過魚體的適應能力，且抗氧化酶蛋白分子關鍵性氨基酸殘基被大量活性氧中間體攻擊，造成魚體和抗氧化酶受到損傷，抗氧化酶活性降低，清除氧自由基能力降低[18]。在高質(zhì)量濃度條件下，短暴露時間內(nèi)，超氧化物歧化酶表現(xiàn)出代償性增強，以清除藥物代謝時產(chǎn)生的過量氧自由基，而此期間過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性的顯著增強有利于兩種酶發(fā)揮協(xié)同作用，清除羥自由基和過氧化氫等氧化損傷物質(zhì)[15]。但隨暴露時間延長，高劑量藥物誘導產(chǎn)生的大量活性氧開始攻擊魚體和抗氧化酶，氧自由基誘導的抗氧化酶活性增加已不足以抵抗其對抗氧化酶的嚴重損傷，從而導致酶活性逐漸降低[6]。

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EffectsofEnrofloxacinHydrochlorideonActivitiesofSuperoxideDismutase,CatalaseandGlutathionePeroxidaseinLiverofJuvenileHybridSturgeon

XIONG Hualong1, JIANG Zuoyu1, ZHANG Ruxue1,FENG Yanan2, YAO Junjie3, LIANG Li4

( 1.Rural Work Bureau of Weng′an County, Guizhou Province, Weng′an 550400, China; 2.TAL Education Group in the Mobby Business Division of Beijing, Beijing 100000, China; 3.Department of Fisheries Science, College of Animal Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 4.College of Biology and Agro-forestry Engineering, Tongren University, Tongren 554300, China )

The effects of enrofloxacin hydrochloride on activities of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase were studied in liver of juvenile hybrid sturgeon(Acipenserschrenckii♀×A.baeri♂)with body weight of (10.26±2.37) g exposed to enrofloxacin hydrochloride concentration of 1.56 mg/L, 6.25 mg/L, 25.00 mg/L and 100.00 mg/L at water temperature of(17.5±0.5) ℃ by biochemical and subacute toxicity methods. The results showed that the 96 h LC50of enrofloxacin hydrochloride to juvenile hybrid sturgeon was found to be higher than 100 mg/L, indicating that enrofloxacin hydrochloride was low-toxic to hybrid sturgeon juveniles. The activities of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase were significantly affected by concentrations of enrofloxacin hydrochloride and exposure period(P<0.05), with the trend of “ first increase and then decrease” with exposure period. The enzyme activity peak was observed later in low concentration groups(1.56 mg/L and 6.25 mg/L)than in high concentration groups. The findings indicated that oxidative stress reaction first appeared in fish in the high concentration group(25.00 mg/L and 100.00 mg/L), and the enzyme activities were involved in enrofloxacin concentrations and the exposure period．

enrofloxacin hydrochloride; hybrid sturgeon juvenile; liver; antioxidant enzyme

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.05.010

2016-09-05；

2016-12-08.

貴州省科學技術基金資助項目[黔科合LH字(2014)7486].

熊鏵龍(1988-)，男，水產(chǎn)工程師，碩士；研究方向：水產(chǎn)動物繁殖與發(fā)育生物學. E-mail:hualongx67@163.com. 通訊作者:姚俊杰(1968-)，男，教授，碩士生導師，博士；研究方向：水產(chǎn)動物繁殖與發(fā)育生物學. E-mail:junjieyao@163.com.

S948

A

1003-1111(2017)05-0601-05