趙賢亮，陳 鶴，楊 瀟，巴新霞，李 莉，孔祥會(huì)

( 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

黃河鯉嗜水氣單胞菌的分離、毒力及用藥分析

趙賢亮，陳 鶴，楊 瀟，巴新霞，李 莉，孔祥會(huì)

( 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

自發(fā)病黃河鯉4種組織中分離致病菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)分離到的細(xì)菌屬氣單胞菌屬?；貧w感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，患病魚體出現(xiàn)鰓蓋等多處組織出血且伴隨腸炎等癥狀，表明引起黃河鯉發(fā)病的致病菌為嗜水氣單胞菌，命名為HNAh01。半致死密度測(cè)定發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌HNAh01的半致死密度為1.38×107cfu/mL。藥敏結(jié)果表明，該致病性嗜水氣單胞菌是典型的多重耐藥嗜水氣單胞菌，但對(duì)恩諾沙星極為敏感。因此，選擇恩諾沙星對(duì)分離菌株進(jìn)行體外藥效學(xué)和用藥分析試驗(yàn)。藥效學(xué)試驗(yàn)表明，恩諾沙星對(duì)嗜水氣單胞菌HNAh01的最小抑菌質(zhì)量濃度為1.56 ng/mL，最小殺菌質(zhì)量濃度為3.12 ng/mL，防耐藥突變質(zhì)量濃度為12.5 ng/mL，耐藥選擇窗的范圍為1.56～12.5 ng/mL。用藥分析結(jié)果顯示，黃河鯉口服劑量為10 mg/kg時(shí)對(duì)嗜水氣單胞菌HNAh01的相對(duì)保護(hù)率達(dá)83%。本文研究為嗜水氣單胞菌的防治提供了理論基礎(chǔ)與實(shí)踐依據(jù)。

黃河鯉；嗜水氣單胞菌；恩諾沙星；用藥分析

黃河鯉(Cyrinuscarpio)是我國四大名魚之一，其產(chǎn)業(yè)化迅速發(fā)展，在促進(jìn)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)及區(qū)域漁民增收上發(fā)揮著重要作用。但是，由于養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境惡化(水體污染、富營養(yǎng)化、高密度養(yǎng)殖等)導(dǎo)致各種病害頻發(fā)，嚴(yán)重制約黃河鯉養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)作為一種條件性致病菌，其具有多種毒力因子及胞外產(chǎn)物，可引起魚類、兩棲類、爬行類等多種冷血?jiǎng)游锖筒溉閯?dòng)物發(fā)病，是一種典型的人—畜—魚共患病病原菌[1]，一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。嗜水氣單胞菌可感染多種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，如草魚(Ctenopharyngodonidellus)[2]、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)[3]、鳙魚(Aristichthysnobilis)[4]、鯉魚[5]、鯽魚(Carassiusauratus)[6]、麥穗魚(Pseudorasboraparva)[7]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[8]和斑點(diǎn)叉尾(Ietaluruspunetaus)[9]等。

本研究從河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)殖基地獲得患病黃河鯉，通過體表觀察和剖檢分析發(fā)病癥狀，對(duì)發(fā)病鯉的4種不同組織進(jìn)行病原分離純化，通過16S rDNA序列分析鑒定病原菌。選擇病原菌進(jìn)行回歸感染、病原菌半數(shù)致死密度計(jì)算、藥敏試驗(yàn)及用藥分析，旨在為研究鯉魚感染細(xì)菌性疾病及臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

病魚采自河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)殖基地瀕臨死亡黃河鯉，體質(zhì)量約50 g，體長(zhǎng)約12.0 cm?；疾□庺~鰓蓋、鰭基等多處組織具有充血癥狀，解剖樣品發(fā)現(xiàn)腸炎等癥狀。

1.2 主要試劑

細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯培養(yǎng)基、抗生素均購自上海生工生物工程有限公司，PCR相關(guān)試劑均為寶生物工程技術(shù)服務(wù)公司產(chǎn)品。引物及測(cè)序分析由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 菌株分離及16S rDNA測(cè)序驗(yàn)證

取患病鯉魚的鰓、腸、腎和肝臟組織進(jìn)行病原分離和純化。觀察細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)的形態(tài)特征，并進(jìn)一步用16S rDNA的PCR擴(kuò)增引物(F:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′ 和R:5′-CTACGGTTACCTTGTTACGAC-3′)對(duì)其進(jìn)行序列擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系:模板DNA 1 μL，16S rDNA上下游引物各1 μL，dNTP 2.5 μL，PCR Buffer 2.5 μL，ExTaq 0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

將已得到的序列與GenBank進(jìn)行序列相似性比對(duì)，確定其物種。

1.4 半致死密度測(cè)定

細(xì)菌在腦心浸液肉湯固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)16 h，挑取單菌落于新鮮腦心浸液肉湯液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，再用無菌生理鹽水(0.85%)按5倍梯度稀釋，分別配成2×106～2.5×108cfu/mL 4個(gè)密度梯度的菌懸液。取50尾黃河鯉分為5組，每組10尾，分別于腹腔注射0.2 mL菌懸液，對(duì)照組每尾注射等體積生理鹽水，魚感染試驗(yàn)在20～26 ℃室溫下進(jìn)行。觀察試驗(yàn)魚發(fā)病癥狀，每12 h統(tǒng)計(jì)魚的死亡情況，連續(xù)觀察7 d。依據(jù)累計(jì)法(Reed-Muench法)[10]計(jì)算該病原菌的半數(shù)致死密度。

1.5 抗菌藥物最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度測(cè)定

病原菌對(duì)常見抗生素的最小抑菌質(zhì)量濃度測(cè)定采用96孔板進(jìn)行。將2倍梯度稀釋的抗菌藥物分別加入至滅菌的96孔板中，第1至第11孔加藥液，每孔10 μL，第12孔不加藥液作為生長(zhǎng)對(duì)照。過夜培養(yǎng)的菌液經(jīng)腦心浸液肉湯培養(yǎng)基1∶1000稀釋后(每孔約1×105～2×105cfu)，向每孔中加100 μL，密封后置28 ℃培養(yǎng)箱中16～20 h，以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物質(zhì)量濃度，即為最小抑菌質(zhì)量濃度。從最小抑菌質(zhì)量濃度以上的孔中取100 μL培養(yǎng)液，涂布于腦心浸液肉湯瓊脂平板上，以菌落數(shù)不超過5個(gè)的最小藥物質(zhì)量濃度為最小殺菌質(zhì)量濃度，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 防耐藥突變質(zhì)量濃度和突變選擇窗的測(cè)定

防耐藥突變質(zhì)量濃度的測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]。將單菌落接種于腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，菌液于3000 r/min離心5 min，將菌體懸浮于10倍原液體積的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)6 h，再次離心后將菌液密度用適量的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基調(diào)整為3×1010cfu/mL。分別取調(diào)整好密度的菌液100 μL均勻涂抹在每個(gè)含有1～10 個(gè)最小抑菌質(zhì)量濃度的恩諾沙星藥物瓊脂平板上，每個(gè)藥物質(zhì)量濃度4個(gè)平板。腦心浸液肉湯固體平板于30 ℃孵育72 h，以72 h后沒有菌落生長(zhǎng)的最低藥物質(zhì)量濃度即為恩諾沙星對(duì)該病原菌的防耐藥突變質(zhì)量濃度。突變選擇窗的上界為防耐藥突變質(zhì)量濃度，下界為細(xì)菌的最小抑菌質(zhì)量濃度，即突變選擇窗的范圍為最小抑菌質(zhì)量濃度至防耐藥突變質(zhì)量濃度。

1.7 恩諾沙星的給藥及細(xì)菌攻毒試驗(yàn)

將50 mg/mL的恩諾沙星溶液用無菌生理鹽水稀釋至0.625、1.25 mg/mL和2.5 mg/mL，健康黃河鯉分別口服0.2 mL藥物，即口服劑量分別為2.5、5 mg/kg和10 mg/kg恩諾沙星，對(duì)照組以等體積無菌生理鹽水代替。每日給藥一次，連續(xù)給藥6 d[12-13]。給藥3 d后分別對(duì)各組試驗(yàn)魚進(jìn)行病原菌攻毒，每尾魚注射0.2 mL 5×107cfu/mL HNAh01菌株。感染后每12 h觀察黃河鯉的死亡情況，持續(xù)7 d。

恩諾沙星的相對(duì)保護(hù)率/%=[1-(治療組死亡率/對(duì)照組死亡率)]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離鑒定

將發(fā)病魚體的4種組織分離得到的病原菌在細(xì)菌基礎(chǔ)固體瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)16 h后，菌落為園形，直徑約1 mm，表面光滑，半透明，乳白色，中央隆起(圖1)。

從4種組織平板中分別挑取單菌落培養(yǎng)并提取細(xì)菌基因組DNA，擴(kuò)增16S rDNA基因序列，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)其片段長(zhǎng)度約為1500 bp。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果采用在線BLAST分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌序列與GenBank中多個(gè)已報(bào)道的嗜水氣單胞菌序列同源性最高，達(dá)99%以上。結(jié)合分離菌的表型及分子生物學(xué)分析，判定該菌株為氣單胞菌屬。選取其中一株HNAh01作進(jìn)一步的研究。

圖1 病魚鰓(a)、腸(b)、腎(c)和肝(d)的病原菌分離

2.2 菌株HNAh01毒力分析

人工感染試驗(yàn)表明，菌株HNAh01注射黃河鯉12 h后，5×107cfu/mL及2.5×108cfu/mL密度組首先出現(xiàn)死亡情況，攻毒48 h內(nèi)，各個(gè)密度梯度中試驗(yàn)魚分別出現(xiàn)不同數(shù)量的死亡，對(duì)照組全部正常。其中，24 h后，107cfu/mL密度組出現(xiàn)死亡，注射36 h后，2.5×108cfu/mL密度組魚全部死亡(圖2)。死亡魚體從體表觀察和剖檢結(jié)果都表現(xiàn)出與自然發(fā)病相似的癥狀，主要表現(xiàn)為鰓蓋、胸鰭、腹鰭等基部及多處內(nèi)臟出血，確定感染鯉魚的病原菌為嗜水氣單胞菌。根據(jù)累計(jì)法計(jì)算嗜水氣單胞菌HNAh01的半數(shù)致死密度為1.38×107cfu/mL，即每尾魚注射約2.7×106cfu即會(huì)導(dǎo)致魚體死亡50%。

圖2 嗜水氣單胞菌HNAh01感染試驗(yàn)結(jié)果

2.3 耐藥性分析

采用微量液體稀釋法測(cè)定嗜水氣單胞菌HNAh01對(duì)常見抗菌藥物的最低抑菌質(zhì)量濃度。以實(shí)驗(yàn)室一株敏感且低毒力菌株作為對(duì)照菌株[14]，比較該分離菌株的耐藥性。結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌HNAh01對(duì)鏈霉素、青霉素類抗生素和磺胺類抗生素均表現(xiàn)出較高耐藥性(最小抑菌質(zhì)量濃度≥64 μg/mL)，且對(duì)巴洛沙星、慶大霉素、卡那霉素和頭孢曲松鈉也表現(xiàn)一定的耐藥性(嗜水氣單胞菌HNAh01最小抑菌質(zhì)量濃度/對(duì)照菌株最小抑菌質(zhì)量濃度≥4)。在所有受試的抗生素中，嗜水氣單胞菌HNAh01僅對(duì)恩諾沙星和氟苯尼考表現(xiàn)出敏感性，特別是恩諾沙星的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.00156 μg/mL(表1)。這一結(jié)果可為發(fā)病魚的藥物防治提供用藥依據(jù)，但其藥物的劑量、效果還待進(jìn)一步研究。

表1 嗜水氣單胞菌HNAh01及對(duì)照菌株對(duì)常見抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：S，敏感，與對(duì)照菌株的最小抑菌質(zhì)量濃度比≤4；R，耐藥，與對(duì)照菌株的最小抑菌質(zhì)量濃度比≥4；-，對(duì)照菌株和分離菌株均對(duì)此抗生素表現(xiàn)較強(qiáng)的耐藥性.

2.4 恩諾沙星用藥分析

微量液體稀釋法及涂平板結(jié)果顯示，恩諾沙星對(duì)嗜水氣單胞菌HNAh01的最小抑菌質(zhì)量濃度為1.56 ng/mL，最小殺菌質(zhì)量濃度為3.12 ng/mL，最小殺菌質(zhì)量濃度/最小抑菌質(zhì)量濃度為2。防耐藥突變質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，恩諾沙星的防耐藥突變質(zhì)量濃度為12.5 ng/mL，突變選擇窗的范圍為1.56～12.5 ng/mL。這一結(jié)果暗示魚體血液或肌肉中恩諾沙星質(zhì)量濃度在達(dá)到12.5 ng/mL時(shí)，既能有效的發(fā)揮殺菌效果，又能減少恩諾沙星耐藥菌株的發(fā)生概率。

[12-13]的研究，鯽魚口灌5 mg/kg恩諾沙星時(shí)，血清中恩諾沙星的峰質(zhì)量濃度達(dá)到(1.88±0.19) μg/mL，且血藥質(zhì)量濃度大于防耐藥突變質(zhì)量濃度發(fā)揮抗菌療效的時(shí)間可達(dá)24 h以上。因此，選取3個(gè)質(zhì)量濃度梯度的恩諾沙星劑量進(jìn)行用藥分析。健康黃河鯉分別口服2.5、5 mg/kg和10 mg/kg劑量的恩諾沙星，每日給藥1次，連續(xù)給藥6 d。給藥3 d后，用5×107cfu/mL菌懸液感染健康黃河鯉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.5、5 mg/kg和10 mg/kg恩諾沙星的相對(duì)保護(hù)率分別為33.3%、66.7%和83.3%，且給藥組的魚體死亡時(shí)間均推遲至少12 h，即攻毒24 h后魚體才開始出現(xiàn)死亡情況(圖3)。

圖3 口服不同劑量恩諾沙星的防治效果

3 討 論

3.1 嗜水氣單胞菌的毒力及耐藥性

嗜水氣單胞菌存在于許多水生動(dòng)物的體表和鰓上，是魚類最主要致病菌之一，可引起魚類疥瘡病、潰瘍病、出血病、敗血病等多種疾病，死亡率極高[15]。在我國淡水漁業(yè)養(yǎng)殖區(qū)，魚類因感染嗜水氣單胞菌發(fā)病的情況非常普遍，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌感染致病的雜交鱘(Husodauricus♀×Acipenserschrencki♂)，出現(xiàn)體表發(fā)紅、鰓絲潰爛、腹腔內(nèi)臟出血、神經(jīng)壞死彌散等癥狀[17]。在回歸感染試驗(yàn)中，本研究分離到的嗜水氣單胞菌HNAh01使試驗(yàn)魚的胸鰭、腹鰭等基部及肛門充血，與自然發(fā)生的爆發(fā)癥狀表現(xiàn)一致。毒力研究表明，該菌株的半致死密度為1.38×107cfu/mL，與實(shí)驗(yàn)室對(duì)照菌株相比具有較強(qiáng)的致病性，因此其具有較高的研究?jī)r(jià)值。

在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治中，養(yǎng)殖者大量使用抗菌藥物進(jìn)行防治魚類細(xì)菌性疾病。近年來，隨著抗生素的大量使用，濫用或錯(cuò)用問題突出，水產(chǎn)致病菌包括嗜水氣單胞菌的耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。在本研究中，分離到的嗜水氣單胞菌HNAh01耐藥情況十分嚴(yán)重，特別對(duì)鏈霉素、青霉素類抗生素和磺胺類抗生素均表現(xiàn)出較高耐藥性，對(duì)巴洛沙星、慶大霉素、卡那霉素和頭孢曲松鈉也表現(xiàn)一定的耐藥性，這一結(jié)果表明分離到的菌株是一株典型的多重耐藥嗜水氣單胞菌。在所有受試的抗生素中，嗜水氣單胞菌HNAh01僅對(duì)恩諾沙星和氟苯尼考表現(xiàn)出敏感性。因此，在實(shí)際的生產(chǎn)實(shí)踐中可以科學(xué)合理地使用恩諾沙星和氟苯尼考進(jìn)行防治，以預(yù)防耐藥菌株的產(chǎn)生與加重。

3.2 抗菌藥物的用藥分析

為了科學(xué)合理地使用抗菌藥物進(jìn)行水產(chǎn)動(dòng)物病害的防治，以恩諾沙星為研究對(duì)象進(jìn)行藥物用量與藥效的評(píng)估。恩諾沙星作為第三代喹諾酮類抗菌藥物，在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，具有口服吸收效果好、抗菌譜廣、抗菌力強(qiáng)、作用迅速及與其他抗生素之間無交叉耐藥性等特點(diǎn)[18-19]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥過程中，要做到對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的精準(zhǔn)用藥，必須掌握致病菌對(duì)藥物的敏感性，即最小抑菌質(zhì)量濃度。根據(jù)抗菌藥物有效血藥質(zhì)量濃度維持在最小抑菌質(zhì)量濃度和防耐藥突變質(zhì)量濃度之間，且不對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用3個(gè)給藥劑量且采取攻毒前和攻毒后連續(xù)給藥的模式，結(jié)果表明，口服10 mg/kg的恩諾沙星后可以起到極好的治療效果，且停藥3 d后魚體基本不會(huì)再出現(xiàn)發(fā)病癥狀。這一結(jié)果與徐麗娟等[12-13,20]的研究結(jié)論相似。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，針對(duì)不同地區(qū)、不同時(shí)期及發(fā)病細(xì)菌的種類進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，適當(dāng)調(diào)整藥物劑量及種類的用藥方案，結(jié)合不同藥物在魚體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)研究，不僅做到科學(xué)的“精準(zhǔn)用藥”模式，在應(yīng)用中具有較好的用藥效果，同時(shí)也極大緩解水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病菌的耐藥問題。本文主要探討恩諾沙星用藥劑量及用藥效果，該試驗(yàn)結(jié)果可為研究鯉魚源嗜水氣單胞菌分離鑒定及臨床選藥提供參考，為水產(chǎn)養(yǎng)殖精準(zhǔn)用藥提供依據(jù)。

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Isolation,Virulence,ResistanceandMedicationofAeromonashydrophilafromCommonCarpCyprinuscarpio

ZHAO Xianliang, CHEN He, YANG Xiao, BA Xinxia, LI Li, KONG Xianghui

( College of Fisheries, Henan Normal University,Xinxiang 453007, China )

A pathogenic bacterial strain was isolated from four tissues of common carpCyprinuscarpiosuffering from hemorrhagic septicemia. Combined with the morphological characteristics and the 16S rDNA sequence analysis showed that the identified isolate belongs toAeromonashydrophila, named HNAh01. Recurrent infection showed that the LD50was 1.38×107cfu/mL after artificial infect healthy common carp with hemorrhages at the base of pectoral and pelvic fins. The drug sensitivity test revealed that HNAh01 was a typical multi-drug resistantA.hydrophila. However, the pathogen was extremely sensitive to enrofloxacin and the minimum inhibitory concentration (MIC) was 1.56 ng/mL, the minimum bactericidal concentration (MBC) was 3.12 ng/mL, mutant prevention concentration (MPC) was 12.5 ng/mL, and drug selection window (MSW) in the range of 1.56—12.5 ng/mL. Medication showed that once-daily dose of 10 mg/kg for 6 d the relative protection ratio (RPS) was amounted to 83%. The methods described in this study also can be used for developing dose guidelines for other anti-bacterial drugs for the prevention and treatment ofA.hydrophila.

Cyrinuscarpio;Aeromonashydrophila; enrofloxacin; medication

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.05.017

2016-08-29；

2016-10-10.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31502204)；廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(GPKLMB201503).

趙賢亮(1983—)，男，博士；研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物免疫與病害防治.E-mail：zxl830724@163.com.通訊作者：孔祥會(huì)(1968—)，男，博士；研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物免疫與病害防治.E-mail：xhkong@htu.cn.

S917.1

A

1003-1111(2017)05-0642-05