薛 蓓，張 培，李志輝，趙 蓮，賴曉芳，閻斌倫，高 煥

( 1．淮海工學(xué)院 海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222001；3.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014 )

脊尾白蝦不同發(fā)育期線粒體基因組甲基化特征分析

薛 蓓1,2,3，張 培1,2,3，李志輝1,2,3，趙 蓮1,2,3，賴曉芳1,2,3，閻斌倫1,2,3，高 煥1,2,3

( 1．淮海工學(xué)院 海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222001；3.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014 )

為研究不同發(fā)育階段脊尾白蝦線粒體基因組表觀遺傳學(xué)特征，本研究在篩選硫化測(cè)序引物的基礎(chǔ)上，對(duì)不同發(fā)育期的脊尾白蝦線粒體基因組甲基化特征進(jìn)行了分析。經(jīng)引物篩選驗(yàn)證，選取了4對(duì)引物在脊尾白蝦的受精卵、幼體期、仔蝦期和成蝦期共4個(gè)發(fā)育期進(jìn)行甲基化特征的分析，結(jié)果表明，除ND5基因3′端序列(21#引物擴(kuò)增區(qū))無(wú)甲基化現(xiàn)象外，COX3基因的起始區(qū)序列(13#引物擴(kuò)增區(qū))、COX3基因的3′端序列(16#引物擴(kuò)增區(qū))和ND5基因5′端序列(19#引物擴(kuò)增區(qū))均存在不同程度的甲基化現(xiàn)象。其中，COX3基因的起始區(qū)序列僅在受精卵孵化期和幼體期存在甲基化現(xiàn)象，COX3基因3′端序列在除受精卵外的其他3個(gè)時(shí)期均存在甲基化現(xiàn)象，且以上甲基化率隨個(gè)體發(fā)育階段的提高呈下降趨勢(shì)；ND5基因5′端序列在4個(gè)不同發(fā)育期均存在甲基化現(xiàn)象，但甲基化率無(wú)顯著差異。甲基化主要發(fā)生在COX3基因和ND5基因位點(diǎn)上，推測(cè)脊尾白蝦在生長(zhǎng)發(fā)育過程中通過調(diào)節(jié)線粒體基因組甲基化來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝過程。本研究首次從整個(gè)發(fā)育周期角度探討了線粒體基因組甲基化特征，以期為進(jìn)一步揭示甲殼類生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)遺傳機(jī)制提供幫助。

脊尾白蝦；線粒體基因組；不同發(fā)育期；甲基化

在組蛋白修飾、DNA甲基化和染色質(zhì)重塑等表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象中，DNA甲基化是最為常見并且研究最為深入的[1]。在真核生物的細(xì)胞中，除核基因組DNA(nDNA)外，其線粒體細(xì)胞器中也含有DNA(mtDNA)；mtDNA雖僅占細(xì)胞內(nèi)總DNA的不到1%，但其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)于發(fā)揮細(xì)胞正常功能是必不可少的[2-3]。以前針對(duì)DNA甲基化的研究多集中在nDNA上[4-5]，而近年來(lái)關(guān)于mtDNA甲基化的研究也逐漸增多；但這些研究多集中在衰老[6]、神經(jīng)退行性疾病[7]及腫瘤[8]等疾病方面，有關(guān)不同發(fā)育期下mtDNA甲基化的研究鮮見報(bào)道，在甲殼動(dòng)物中更未見報(bào)道。

脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)是我國(guó)特有的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)種類，廣泛分布于我國(guó)沿海區(qū)域，尤以黃海、渤海區(qū)域最為豐富[9]，產(chǎn)量可占我國(guó)東部沿海地區(qū)池塘混養(yǎng)模式產(chǎn)量的三分之一，且養(yǎng)殖規(guī)模有進(jìn)一步擴(kuò)大的趨勢(shì)[10]。因此，近年來(lái)為加強(qiáng)其生長(zhǎng)發(fā)育及免疫等生理生化機(jī)制方面的了解，以其為對(duì)象的研究也逐漸增多[11-13]。在前期的研究中，已獲得脊尾白蝦線粒體基因組的全序列[14]，并發(fā)現(xiàn)該蝦在應(yīng)答饑餓時(shí)線粒體基因組會(huì)產(chǎn)生甲基化現(xiàn)象[15]，但是，在其他情況下線粒體基因組的甲基化特征還不清楚，尤其在不同發(fā)育階段下，而這對(duì)于了解線粒體基因組在脊尾白蝦等甲殼類生物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制非常重要。因此，筆者希望通過對(duì)脊尾白蝦不同發(fā)育階段線粒體基因組甲基化特征的研究，為加深對(duì)甲殼類生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)遺傳機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供幫助。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

自養(yǎng)殖池塘中選取性腺發(fā)育成熟的脊尾白蝦個(gè)體，保持溫度(27±1) ℃、鹽度29±1、pH 8.0±0.5的恒定養(yǎng)殖條件，在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行養(yǎng)殖并取材。選取受精卵[16]、幼體期[17]、仔蝦期和成蝦期4個(gè)不同發(fā)育階段，每個(gè)發(fā)育期選取6個(gè)樣本。

1.2 線粒體基因組DNA提取及處理

利用基因組DNA提取試劑盒(MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit, TaKaRa)分別提取各發(fā)育期的總DNA(其中含有線粒體基因組DNA)，受精卵、幼體期和仔蝦期樣本采用整體液氮研磨后提取，成蝦期樣本則取其腹部肌肉進(jìn)行研磨后提取DNA。利用甲基化檢測(cè)試劑盒(EpiMarkTM, New England Biolabs Inc.)對(duì)提取的基因組進(jìn)行重亞硫酸鹽處理以獲得處理后的線粒體基因組DNA，并以處理后的基因組DNA為PCR模板進(jìn)行BSP引物的驗(yàn)證和后續(xù)各不同發(fā)育期脊尾白蝦的甲基化特征分析。

1.3 硫化測(cè)序(BSP)引物的篩選及驗(yàn)證

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)的引物[14]，選取10對(duì)(引物3、8、11、12、13、16、19、21、33和48)擴(kuò)增穩(wěn)定的硫化測(cè)序引物(表1)，用于對(duì)處理后基因組DNA的擴(kuò)增，篩選擴(kuò)增穩(wěn)定的引物對(duì)脊尾白蝦線粒體基因組DNA的甲基化情況進(jìn)行分析。引物名稱中的數(shù)字為線粒體基因組全序列中對(duì)應(yīng)的序列區(qū)間。

采用如下PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增：總體積25 μL，含10×PCR buffer 2.5 μL，Mg2+(25 mmol/L) 1.5 μL，dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL， Forward Primer (10 mmol/L) 1 μL，Reverse Primer (10 mmol/L) 1 μL，ddH2O 15 μL 及處理后的基因組DNA 3 μL。利用Touchdown PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s(其中退火溫度每個(gè)循環(huán)降低1 ℃，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)后再以45 ℃固定退火溫度進(jìn)行30個(gè)循環(huán))；68 ℃ 5 min；4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，對(duì)有擴(kuò)增條帶的片段進(jìn)行切膠回收，利用pEASY-T3載體進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化后，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，并通過對(duì)比測(cè)序序列與原序列確認(rèn)是否為線粒體基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 脊尾白蝦線粒體基因組BSP引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序獲得的處理后線粒體基因組DNA序列與原序列通過在線軟件QUMA(http://quma.cdb.riken.jp/)進(jìn)行比對(duì)分析以確認(rèn)甲基化的有無(wú)及其相應(yīng)特征，并計(jì)算相應(yīng)的甲基化率，其中：

總甲基化率/%=(甲基化胞嘧啶位點(diǎn)個(gè)數(shù)/總胞嘧啶位點(diǎn)個(gè)數(shù))×100%

CpG位點(diǎn)甲基化率/%=(甲基化CpG位點(diǎn)個(gè)數(shù)/總CpG位點(diǎn)個(gè)數(shù))×100%

CpHs位點(diǎn)甲基化率/%=(甲基化CpHs位點(diǎn)個(gè)數(shù)/總CpHs位點(diǎn)個(gè)數(shù))×100%

2 結(jié) 果

2.1 硫化測(cè)序引物的篩選結(jié)果

以各發(fā)育期混合DNA為模板的甲基化驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，10對(duì)硫化測(cè)序引物中，13、16、19和21共4對(duì)引物擴(kuò)增穩(wěn)定，這4對(duì)引物的具體遺傳信息特征如下：

引物13(13#)擴(kuò)增區(qū)域位于COX3(細(xì)胞色素氧化酶亞基3)基因的起始區(qū)序列，序列全長(zhǎng)207 bp，其中包含CpG位點(diǎn)4個(gè)，CpHs(CpA/CpT/CpC)位點(diǎn)46個(gè)；引物16(16#)擴(kuò)增區(qū)域位于COX3基因的3′端序列和ND3基因的起始區(qū)序列，序列全長(zhǎng)218 bp，其中包含CpG位點(diǎn)5個(gè)，CpHs位點(diǎn)46個(gè)；引物19(19#)擴(kuò)增區(qū)域位于ND5(還原型輔酶Ⅰ脫氫酶亞基5)基因的5′端序列，序列全長(zhǎng)241 bp，其中包含CpG位點(diǎn)5個(gè)，CpHs位點(diǎn)60個(gè)；引物21(21#)擴(kuò)增區(qū)域位于ND5基因的3′端序列，序列全長(zhǎng)114 bp，其中包含CpG位點(diǎn)4個(gè)，CpHs位點(diǎn)22個(gè)。

通過對(duì)不同發(fā)育期脊尾白蝦基因組DNA的硫化測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在COX3基因的起始區(qū)序列和3′端序列以及ND5基因的5′端序列存在甲基化現(xiàn)象，而在ND5基因的3′端不存在甲基化現(xiàn)象。

2.2 不同發(fā)育期脊尾白蝦的甲基化特征

對(duì)4個(gè)不同發(fā)育期(受精卵、幼體期、仔蝦期和成蝦期)脊尾白蝦的甲基化特征分析發(fā)現(xiàn)，3對(duì)硫化測(cè)序引物的擴(kuò)增序列的甲基化不僅發(fā)生在CpG位點(diǎn)，也發(fā)生在CpHs位點(diǎn)。但3個(gè)序列區(qū)間在具體的甲基化率等方面存在不同，具體如下：

COX3基因起始區(qū)序列(引物13#)僅在受精卵和幼體期各有1個(gè)個(gè)體存在甲基化，而其他發(fā)育期均未發(fā)現(xiàn)甲基化現(xiàn)象，受精卵的甲基化率高于幼體期(表2)。

表2 不同發(fā)育期脊尾白蝦線粒體基因組甲基化特征

COX3基因的3′端序列(引物16#)在受精卵中未發(fā)現(xiàn)甲基化現(xiàn)象，在幼體期、仔蝦期和成蝦期分別有3個(gè)、1個(gè)和1個(gè)個(gè)體存在甲基化現(xiàn)象，且隨著脊尾白蝦的發(fā)育，甲基化率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(表2)；ND3基因的起始序列(引物16#)中未發(fā)現(xiàn)甲基化現(xiàn)象。

ND5基因5′端(引物19#)在4個(gè)不同發(fā)育期脊尾白蝦中均存在甲基化現(xiàn)象，只是在受精卵和幼體期取樣的6個(gè)個(gè)體均存在甲基化現(xiàn)象，而在仔蝦期和成蝦期各有2個(gè)個(gè)體存在甲基化現(xiàn)象。然而，19#引物的擴(kuò)增序列在不同發(fā)育期的甲基化率不存在明顯的差異，單就甲基化位點(diǎn)來(lái)看并無(wú)明顯規(guī)律(表2)。

3 討 論

3.1 不同發(fā)育期脊尾白蝦線粒體基因組的甲基化水平

在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，DNA甲基化可以通過直接或間接的方式參與到基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用中，對(duì)基因表達(dá)具有重要的協(xié)同作用[18-19]。生物體內(nèi)某些核基因在不同發(fā)育期的表達(dá)量存在差異[20-21]，而這種差異與其甲基化水平存在一定的相關(guān)性[20]。那么，mtDNA在不同發(fā)育期中的甲基化水平是否存在差異？已有的研究表明，疾病[22]、衰老[7,23]、環(huán)境因子脅迫[24]和饑餓[15]等因素均可能影響mtDNA甲基化。本研究中通過對(duì)脊尾白蝦線粒體基因組甲基化水平的研究，發(fā)現(xiàn)其在不同發(fā)育期的甲基化水平存在差異，且隨著個(gè)體的發(fā)育，在甲基化個(gè)體數(shù)或總甲基化率水平上呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，這可能是由于隨著生物體的生長(zhǎng)發(fā)育，其生命活動(dòng)所需能量增多，而線粒體作為生物體的能量中心，其基因組甲基化水平的降低有利于相關(guān)基因的表達(dá)。

3.2 不同發(fā)育期脊尾白蝦COX3基因的甲基化情況

COX3基因的起始區(qū)序列(引物13#)及COX3基因的3′端序列(引物16#)，在不同發(fā)育期的脊尾白蝦mtDNA的甲基化情況均表現(xiàn)為隨生物體發(fā)育甲基化程度降低的整體趨勢(shì)。細(xì)胞色素氧化酶是線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的重要組成[25]，因此這也說(shuō)明在脊尾白蝦的發(fā)育過程中，生物體通過調(diào)節(jié)自身mtDNA甲基化程度來(lái)調(diào)節(jié)能量代謝。但是，這兩個(gè)序列區(qū)間的甲基化情況還略有差異，COX3基因的起始序列在受精卵表現(xiàn)為較高的甲基化率，而COX3基因的3′端序列在該時(shí)期則并無(wú)甲基化現(xiàn)象；相反COX3基因的3′端序列在仔蝦期及成蝦期均存在甲基化現(xiàn)象，而COX3基因的起始序列則并無(wú)甲基化現(xiàn)象。說(shuō)明同一基因的不同區(qū)間在同一發(fā)育階段的甲基化現(xiàn)象也存在不同，線粒體基因組甲基化的具體機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

3.3 不同發(fā)育期脊尾白蝦ND5基因的甲基化情況

還原型輔酶Ⅰ脫氫酶是電子進(jìn)入電子傳遞鏈的主要位點(diǎn)，為線粒體內(nèi)三磷酸腺苷的形成提供約40%的質(zhì)子，在氧化磷酸化系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用[26-27]。但脊尾白蝦在4個(gè)不同發(fā)育期中ND5基因的5′端序列(引物19#)均表現(xiàn)為較高的甲基化率，且各發(fā)育期之間不存在顯著差異；而ND5基因的3′端序列(引物21#)在4個(gè)發(fā)育階段則均無(wú)甲基化現(xiàn)象。這進(jìn)一步說(shuō)明同一基因的不同區(qū)間在同一發(fā)育階段的甲基化現(xiàn)象存在不同。另外，已有的研究結(jié)果顯示[15]，不同的饑餓期下ND5基因的5′端序列無(wú)甲基化現(xiàn)象，而ND5基因的3′端序列存在甲基化現(xiàn)象，這說(shuō)明ND5基因可能在不同發(fā)育階段甲基化較為穩(wěn)定，而饑餓脅迫應(yīng)激后為甲基化現(xiàn)象的高發(fā)區(qū)。

此外，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，同一發(fā)育期的6個(gè)個(gè)體在不同區(qū)間的甲基化發(fā)生情況存在較大的不同，一方面可能是因?yàn)槿〔臅r(shí)并未區(qū)分各發(fā)育期的具體Ⅰ～Ⅵ期，而同一發(fā)育期內(nèi)的甲基化也存在變化，這仍需要進(jìn)一步研究；另一方面基因組甲基化具有一定的可遺傳性[28]，因而不同個(gè)體間可能存在遺傳上的差異，這需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣品量并進(jìn)行深入的研究。

[1] Lee T, Zhai J, Meyers B C. Conservation and divergence in eukaryotic DNA methylation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107(20):9027-9028.

[2] 劉振山, 馮云, 薛志剛, 等. 線粒體DNA與DNA甲基化[J]. 生物學(xué)雜志, 2013, 30(5):77-80.

[3] Iacobazzi V, Castegna A, Infantino V, et al. Mitochondrial DNA methylation as a next-generation biomarker and diagnostic tool [J]. Molecular Genetics & Metabolism, 2013, 110(2):25-34.

[4] Laird P W. The power and the promise of DNA methylation markers [J]. Nature Reviews Cancer, 2003, 3(3):253-266.

[5] Dehan P, Kustermans G, Guenin S, et al. DNA methylation and cancer diagnosis:new methods and applications [J]. Expert Review of Molecular Diagnostics, 2009, 9(7):651-657.

[6] Mawlood S K, Dennany L, Watson N, et al. Quantification of global mitochondrial DNA methylation levels and inverse correlation with age at two CpG sites [J]. Aging, 2016, 8(2):1-6.

[7] Wong M, Gertz B, Chestnut B A, et al. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS[J]. Front Cell Neurosci,2013(7):279.

[8] Feng S, Xiong L, Ji Z, et al. Correlation between increased ND2 expression and demethylated displacement loop of mtDNA in colorectal cancer[J]. Mol Med Rep, 2012, 6(1):125-130.

[9] 王緒峨. 脊尾白蝦繁殖生物學(xué)的初步觀察[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志, 1987, 22(1):7-10.

[10] Xu W, Xie J, Shi H, et al. Hematodinium infections in cultured ridgetail white prawns,Exopalaemoncarinicauda, in eastern China [J]. Aquaculture, 2010(300):25-31.

[11] Duan Y F, Jian L, Zhe Z, et al. Characterization of ADP ribosylation factor 1 gene fromExopalaemoncarinicauda, and its immune response to pathogens challenge and ammonia-N stress [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2016(55):123-130.

[12] Zhang C S, Li F H, Xiang J H. Effect of salinity on growth and first sexual maturity ofExopalaemoncarinicauda(Holthuis, 1950) [J]. Chinese Journal of Oceanology & Limnology, 2014, 32(1):65-70.

[13] 梁俊平, 李健, 李吉濤, 等. 不同溫度對(duì)脊尾白蝦胚胎發(fā)育與幼體變態(tài)存活的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2013, 33(4):1142-1152.

[14] Shen X, Sun M, Wu Z, et al. The complete mitochondrial genome of the ridgetail white prawnExopalaemoncarinicaudaHolthuis, 1950 (Crustacean:Decapoda:Palaemonidae) revealed a novel rearrangement of tRNA genes[J]. Gene, 2009, 437(1):1-8.

[15] 高煥, 趙蓮, 薛蓓, 等. 脊尾白蝦線粒體基因組應(yīng)答饑餓的甲基化特征分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2015, 39(7):953-960.

[16] 王緒峨.脊尾白蝦早期胚胎發(fā)育以及溫、鹽度與其孵化的關(guān)系[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào),1989,13(1):59-64.

[17] 梁象秋, 李亞娟, 周昭曼. 脊尾白蝦的幼體發(fā)育[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1988,12(2):157-168.

[18] Grunau C, Renault E, Rosenthal A, et al. MethDB—a public database for DNA methylation data[J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29(1):270-274.

[19] Jones P A. Functions of DNA methylation:islands, start sites, gene bodies and beyond[J]. Nature Reviews Genetics, 2012, 13(7):484-492.

[20] Huang Y Z, Zhan Z Y, Sun Y J, et al. Intragenic DNA methylation status down-regulates bovine IGF2, gene expression in different developmental stages[J]. Gene, 2014, 534(2):356-361.

[21] Wang R L, Li J, Staehelin C, et al. Expression analysis of two P450 monooxygenase genes of the tobacco cutworm moth (Spodopteralitura) at different developmental stages and in response to plant allelochemicals[J]. Journal of Chemical Ecology, 2015, 41(1):111-119.

[22] Pirola C J, Gianotti T F, Burgueo A L, et al. Epigenetic modification of liver mitochondrial DNA is associated with histological severity of nonalcoholic fatty liver disease [J]. Gut, 2013, 62(9):1356-1363.

[23] Dzitoyeva S, Hu C, Manev H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria [J]. Neurobiology of Aging, 2012, 33(12):2881-2891.

[24] Byun H M, Panni T, Motta V, et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA methylation [J]. Particle & Fibre Toxicology, 2013, 10(1):18.

[25] Muntyan M S, Cherepanov D A, Malinen A M, et al. Cytochrome cbb3 of Thioalkalivibrio is a Na+-pumping cytochrome oxidase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015, 112(25):7695-7700.

[26] Hunte C, Zickermann V, Brandt U. Functional modules and structural basis of conformational coupling in mitochondrial complex I[J]. Science, 2010, 329(5990):448-451.

[27] Braun H P, Binder S, Brennicke A, et al. The life of plant mitochondrial complex I[J]. Mitochondrion, 2014(19):295-313.

[28] Eichten S, Borevitz J. Epigenomics:methylation′s mark on inheritance [J]. Nature, 2013, 495(7440):181-182.

MethylationProfileinMitochondrialGenomeofRidgetailWhitePrawnExopalaemoncarinicaudainResponsetoDifferentDevelopmentalStages

XUE Bei1,2,3, ZHANG Pei1,2,3, LI Zhihui1,2,3, ZHAO Lian1,2,3, LAI Xiaofang1,2,3,YAN Binlun1,2,3, GAO Huan1,2,3

( 1.Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, College of Marine Life and Fisheries, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China； 2.Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology, Lianyungang 222001, China； 3.The Jiangsu Provincial Platform for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm, Nanjing 210014, China )

BSP (Bisulfite sequencing PCR) primer pairs were screened in order to analyze the methylation profile of the mitochondria genome in response to different developmental stages in the ridgetail white prawnExopalaemoncarinicauda. Within ten synthesized BSP primer pairs, four primer pairs were selected for further studies because of their repeatable PCR amplification merits, including 13th (located in the 5′ end initiation zone of COX3), 16th (located in the 3′ sequence of COX3), 19th (located in the 5′ sequence of ND5) and 21st (located in the 3′ sequence of ND5). The methylation profile of different individuals at different developmental stages (fertilized eggs, larval, post larval and adult stages) were analyzed, using the above 4 primer pairs. The results showed that the methylation in both CpG sites and non-CpG sites were found in the 5′ and 3′ sequence of COX3 and the 5′ sequence of ND5, but not in the 3′ sequence of ND5. The 5′ sequence of COX3 was methylated at fertilized eggs and larval stage, while the 3′ sequence of COX3 was methylated at larval, post larval and adult stages. Additionally, the methylation ratio was decreased with the increasing of development stage for above two sequences of COX3. The 5′ sequence of ND5 was methylated in the all four developmental stages, and no significant differences for methylation ratio were found among different developmental stages. In view of the biology function of COX and ND genes which expression productions were responsible for maintaining the respiratory electron-transport chain in mitochondria, it is inferred that the function of methylation of mitochondrial genome in ridgetail white prawn is to regulate the energy metabolism during developmental stage.

Exopalaemoncarinicauda; mitochondrial genome; different developmental stage; methylation

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.05.015

2016-09-13；

2016-12-06.

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(PAPD)；江蘇省高等學(xué)校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(17KJA240001)；江蘇省“六大人才高峰”創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2016-HYGC-CXTD-004)；江蘇省2015年度普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(KYLX15_1486)；連云港市產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目(CXY1517).

薛蓓(1992-)，女，碩士研究生；研究方向：海洋生物繁殖與遺傳育種學(xué).E-mail:malvsy@163.com.通訊作者：高煥(1976-)，男，教授；研究方向：甲殼類種質(zhì)資源開發(fā)及利用.E-mail:huanmr@163.com.

S917

A

1003-1111(2017)05-0628-06