梁 英，孟祥榮，孫明輝，田傳遠(yuǎn)，黃徐林

( 中國海洋大學(xué)，海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003 )

氮磷饑餓時間對筒柱藻生長及總脂含量的影響

梁 英，孟祥榮，孫明輝，田傳遠(yuǎn)，黃徐林

( 中國海洋大學(xué)，海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003 )

以筒柱藻為試驗(yàn)材料，研究了其在一次性培養(yǎng)過程中，氮磷營養(yǎng)鹽饑餓時間(0、1、2、4、6、8 d)對該藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度、葉綠素含量、干質(zhì)量、總脂含量及脂肪酸組成的影響。結(jié)果表明，光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量、光化學(xué)淬滅、最大光合作用速率、快速光曲線的初始斜率和半飽和光照度均隨氮、磷饑餓時間的延長而顯著下降，說明該藻的光合作用受到了抑制。細(xì)胞密度分別在氮饑餓的第6 d和磷饑餓的第8 d達(dá)到最大值，但總體升高幅度不大。氮饑餓和磷饑餓條件下，干質(zhì)量和總脂含量均隨氮磷饑餓時間的延長逐漸升高，總脂含量分別在氮饑餓的第8 d(35.3%)和磷饑餓的第6 d(28.9%)達(dá)到最大值。氮磷饑餓時間對筒柱藻的脂肪酸組成也有顯著影響，16:0和總飽和脂肪酸含量隨氮磷饑餓時間的延長逐漸升高，20:4n-6、20:5n-3和總多不飽和脂肪酸含量則隨氮磷饑餓時間的延長逐漸降低，16:1n-7和總單不飽和脂肪酸含量隨氮饑餓時間的延長逐漸升高，而磷饑餓時間對16:1n-7和總單不飽和脂肪酸含量變化影響不顯著。上述指標(biāo)隨氮磷饑餓時間的變化趨勢可為筒柱藻的大規(guī)模培養(yǎng)及開發(fā)利用提供參考。

筒柱藻；氮磷饑餓時間；葉綠素?zé)晒鈪?shù)；生長；總脂含量；脂肪酸組成

隨著石油資源的逐漸枯竭，用微藻生產(chǎn)生物柴油的研究正成為目前的熱點(diǎn)[1-2]，而選育生長繁殖速度快、產(chǎn)油量高的微藻是生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。諸多研究表明，氮磷營養(yǎng)鹽限制或饑餓是提高微藻油脂含量的有效方法[4-6]。對海綠球藻(Halochlorococumsarcotum)的研究結(jié)果表明[4]，氮限制能顯著提高該藻的總脂含量。小球藻(Chlorellasp.)[5]在缺磷條件下總脂和中性脂肪酸含量均逐漸升高。三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)和角毛藻(Chaetocerossp.)在磷饑餓條件下，總脂含量增加，但效果沒有氮饑餓顯著[6]。氮磷限制或饑餓可提高微藻的總脂含量和改變脂肪酸組成，但影響的程度受到微藻種類、受限營養(yǎng)鹽種類、營養(yǎng)鹽限制程度、限制時間等因素的影響。在氮磷脅迫條件下，微藻生物量往往較低，從而影響微藻作為生物柴油原料的開發(fā)利用。國內(nèi)外學(xué)者嘗試用“兩步法”來調(diào)控生物量與總脂含量之間的平衡[7-9]，但對于氮磷限制或饑餓多長時間能提高微藻的總脂含量，還需要進(jìn)一步研究。

筒柱藻(Cylindrothecasp.)細(xì)胞壁硅化弱[10]，富含胞外多糖[11]和多種高度不飽和脂肪酸[12]。在流加—連續(xù)培養(yǎng)條件下，可得到高含量的粗蛋白、粗脂肪和種類齊全的氨基酸，適合作為海洋經(jīng)濟(jì)動物苗種的餌料[13]。該藻通過優(yōu)化培養(yǎng)，可獲得較高的生物量和高達(dá)50%以上的總脂含量，而且脂肪酸組成主要為16碳鏈，與柴油分子15個左右的碳鏈極其相似，可作為生物柴油的生產(chǎn)原料[14]。筆者以筒柱藻B200為試驗(yàn)材料，采用“兩步法”對其進(jìn)行培養(yǎng)，即首先在最適培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)筒柱藻，到指數(shù)生長末期時，將其離心轉(zhuǎn)接到不添加氮鹽和磷鹽的培養(yǎng)基中進(jìn)行饑餓試驗(yàn)以促進(jìn)脂類積累，研究氮、磷饑餓時間對其葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度、葉綠素含量、干質(zhì)量、總脂含量和脂肪酸組成的影響，以期為該藻的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藻種

試驗(yàn)所用筒柱藻藻種取自中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫，編號為MACC/B200。

1.2 試驗(yàn)方法和培養(yǎng)條件

將50 mL處于指數(shù)生長期的筒柱藻接種到4000 mL的f培養(yǎng)基(即f/2培養(yǎng)基[15]的2倍)中，在25 ℃、5000 lx光照度下連續(xù)充氣培養(yǎng)到指數(shù)生長末期，離心后，分別以2.2×106個/mL和3.42×106個/mL的接種量轉(zhuǎn)接到不含氮、磷元素的f培養(yǎng)基中(培養(yǎng)液體積為4000 mL)，分別進(jìn)行氮、磷饑餓試驗(yàn)，每種饑餓處理設(shè)3個平行。每日定時取樣10 mL進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)和細(xì)胞密度的測定。在第0、1、2、4、6、8 d分別收獲500 mL藻液進(jìn)行干質(zhì)量、葉綠素含量、總脂含量和脂肪酸組成的測定。

1.3 參數(shù)測定

1.3.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

每天定時取樣，采用德國Walz公司產(chǎn)Water-PAM調(diào)制式水樣葉綠素?zé)晒鈨x，按文獻(xiàn)[16]中的方法測定葉綠素?zé)晒飧鲄?shù)：光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量、光化學(xué)淬滅、非光化學(xué)淬滅，并參照Platt等[17]的方法進(jìn)行快速光曲線擬合，擬合方程如下：

P=Ps(1-e-(α×PAR/Ps))·e-(β×PAR/Ps)

式中，Ps表示無光抑制時的最大相對電子傳遞速率，α表示擬合后快速光曲線的初始斜率，β表示光抑制參數(shù)，PAR表示光合有效輻射強(qiáng)度[μmol/(m2·s)]。擬合后，最大相對電子傳遞速率rETRmax表示為Pm，Pm=Ps×[α/(α+β)]×[β/(α+β)]β/α，半飽和光照度Ik=Pm/α。

1.3.2 細(xì)胞密度和葉綠素含量的測定

每日定時取樣，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞密度的測定，測4次取平均值。按照文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行葉綠素含量的測定。

1.3.3 總脂含量和脂肪酸組成的測定

在第0、1、2、4、6、8 d定時取樣，冷凍干燥后測定其單位體積干質(zhì)量(g/L)和總脂含量(占干質(zhì)量的百分比)?？傊堪锤倪M(jìn)的Bligh-Dyer[19](簡稱BD)方法進(jìn)行。脂肪酸樣品的處理按照改進(jìn)的Lepage等[20]方法，先對冷凍干燥的筒柱藻樣品進(jìn)行甲酯化，然后用2 mL正己烷對獲取的脂肪酸甲酯進(jìn)行萃取，振蕩離心，最后取分層后上層液體放入1.5 mL EP管，等待分析。

脂肪酸分析采用島津氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-QP2010Ultra。色譜柱型號為Rxi-1MS，色譜柱規(guī)格為：30.0 m×0.25 mm×0.25 μm。載氣為高純氦氣，流速1.00 mL/min，整體流速24.0 mL/min，壓力92.4 kPa。進(jìn)樣口溫度25 ℃，進(jìn)樣量1 μL，色譜柱初溫150 ℃，3 min內(nèi)勻速升溫至200 ℃并保持1 min，然后以2 ℃/min升至250 ℃，分析過程持續(xù)30 min。采用EI離子源，溫度為230 ℃，接口溫度280 ℃，掃描質(zhì)量質(zhì)荷比為1.5～1090 u，最大掃描頻次20 000 u/s。通過檢索NIST質(zhì)譜圖庫獲取每個脂肪酸的質(zhì)譜圖，通過比較樣品的質(zhì)譜圖與圖庫中標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜圖以及比較試驗(yàn)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品每個脂肪酸的出峰時間來對脂肪酸的種類進(jìn)行鑒定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

用Sigmaplot 10.0軟件進(jìn)行作圖。用SPSS 19.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，單因子方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮、磷饑餓時間對筒柱藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

氮饑餓時間對筒柱藻葉綠素?zé)晒飧鲄?shù)的影響見圖1。單因子方差分析結(jié)果表明，氮饑餓時間對筒柱藻葉綠素各熒光參數(shù)均有顯著影響(P<0.05)。由圖1可知，光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，自接種后的第1 d開始隨氮饑餓時間的延長緩慢下降，到第7 d時顯著下降，至試驗(yàn)結(jié)束時(第8 d)，該參數(shù)從接種時的0.67降至0.58。光化學(xué)淬滅、最大光合作用速率和半飽和光照度隨氮饑餓時間的延長變化趨勢相似，從接種后的第1 d開始隨氮饑餓時間的延長先降低，在第5 d達(dá)到最小值，然后隨氮饑餓時間的延長逐漸升高。非光化學(xué)淬滅在接種后的1～3 d變化很小，第3 d以后隨氮饑餓時間的延長顯著升高，第7 d時達(dá)到最大值后顯著下降。光飽和曲線的初始斜率隨氮饑餓時間的延長先升高，在饑餓的第2 d達(dá)到最大值，然后隨著氮饑餓時間的延長而逐步降低，在饑餓的第8 d達(dá)到最小值。

磷饑餓時間對筒柱藻葉綠素各熒光參數(shù)的影響見圖2。單因子方差分析結(jié)果表明，磷饑餓時間對筒柱藻葉綠素各熒光參數(shù)均有顯著影響(P<0.05)。由圖2可知，光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量和光飽和曲線的初始斜率變化趨勢相似，均隨磷饑餓時間的延長先升后降，均在第3 d出現(xiàn)最大值，其中磷饑餓組光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量由第3 d時的0.72降至試驗(yàn)結(jié)束時的0.69。光化學(xué)淬滅，最大光合作用速率和半飽和光照度均隨磷饑餓時間的延長持續(xù)降低。其中，第0～4 d，最大光合作用速率變化不顯著，第4 d后，顯著下降。非光化學(xué)淬滅隨磷饑餓時間的延長先升后降。

2.2 氮、磷饑餓時間對筒柱藻細(xì)胞密度、干質(zhì)量、葉綠素含量和總脂含量的影響

氮饑餓時間對筒柱藻細(xì)胞密度、干質(zhì)量、葉綠素含量和總脂含量的影響見圖3。由圖3可知，筒柱藻的細(xì)胞密度隨氮饑餓時間的延長先升高后小幅降低，總體變化幅度不大，到培養(yǎng)結(jié)束時(第8 d)，細(xì)胞密度是接種時(0 d)的1.35倍。干質(zhì)量隨氮饑餓時間的延長不斷升高，到饑餓的第8 d干質(zhì)量達(dá)到最大值，其中第6、8 d干質(zhì)量差異不顯著。葉綠素含量隨氮饑餓時間的延長先升后降，第1 d達(dá)到最大值?？傊侩S氮饑餓時間的延長顯著升高，剛接種時總脂含量為22.5%，饑餓8 d后總脂含量達(dá)到35.3%，比未進(jìn)行氮饑餓時增加了56.9%，其中第4、6、8 d差異不顯著。

磷饑餓時間對筒柱藻細(xì)胞密度、干質(zhì)量、葉綠素含量和總脂含量的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，筒柱藻的細(xì)胞密度也隨磷饑餓時間的延長逐步升高，但升高幅度不大，到培養(yǎng)結(jié)束時(第8 d)，細(xì)胞密度是接種時(0 d)的1.43倍。干質(zhì)量、葉綠素含量和總脂含量均隨磷饑餓時間的延長不斷升高，其中總脂含量在磷饑餓的第6 d達(dá)到較大值(28.9%)，比未進(jìn)行磷饑餓時增加了19.0%，但第4、6、8 d差異不顯著。

圖1 不同氮饑餓時間對筒柱藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

圖2 不同磷饑餓時間對筒柱藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.3 氮、磷饑餓時間對筒柱藻脂肪酸組成的影響

氮饑餓時間對筒柱藻脂肪酸組成的影響見表1。由表1可知，氮饑餓條件下，筒柱藻的主要脂肪酸是14:0(7.31%～9.66%)、16:0(28.01%～39.07%)、16:1n-7(28.51%～37.23%)、20:4n-6(4.52%～8.76%)和20:5n-3(3.48%～10.46%)。單因子方差分析結(jié)果表明，氮饑餓時間對14:0、16:0、16:1n-7、20:4n-6及20:5n-3含量的影響差異顯著(P<0.05)。其中16:0和總飽和脂肪酸含量隨氮饑餓時間的延長先逐漸升高，分別在饑餓的第6 d和第4 d達(dá)到最大值，之后緩慢下降；16:1n-7和總單不飽和脂肪酸含量隨氮饑餓時間的延長逐漸升高，至培養(yǎng)結(jié)束時達(dá)到最大值；14:0、20:4n-6、20:5n-3和總多不飽和脂肪酸含量隨氮饑餓時間的延長逐漸降低，至培養(yǎng)結(jié)束時達(dá)到最小值。

圖3 不同氮饑餓時間對筒柱藻細(xì)胞密度、干質(zhì)量、葉綠素含量和總脂含量的影響

圖4 不同磷饑餓時間對筒柱藻細(xì)胞密度、干質(zhì)量、葉綠素含量和總脂含量的影響

表1 不同氮饑餓時間對筒柱藻脂肪酸組成的影響(占總脂肪酸的百分比) %

磷饑餓時間對筒柱藻脂肪酸組成的影響見表2。由表2可知，磷饑餓條件下，筒柱藻的主要脂肪酸是14:0(6.90%～9.12%)、16:0(30.66%～38.61%)、16:1n-7(29.13%～31.61%)、20:4n-6(4.14%～8.23%)和20:5n-3(4.39%～10.33%)。單因子方差分析結(jié)果表明，磷饑餓時間對14:0、16:0、20:4n-6及20:5n-3含量的影響差異顯著(P<0.05)，對16:1n-7和總單不飽和脂肪酸含量的影響差異不顯著(P>0.05)。其中，14:0含量隨磷饑餓時間的延長先升后降，在饑餓的第2 d達(dá)到最大值；16:0和總飽和脂肪酸含量隨磷饑餓時間的延長逐漸升高，至培養(yǎng)的第6 d達(dá)到最大值，之后逐漸降低；20:4n-6、20:5n-3和總多不飽和脂肪酸含量隨磷饑餓時間的延長逐漸降低，至培養(yǎng)的第6 d達(dá)到最小值，之后逐漸升高；16:1n-7和總單不飽和脂肪酸含量變化不顯著。

表2 不同磷饑餓時間對筒柱藻脂肪酸組成的影響(占總脂肪酸的百分比) %

3 討 論

3.1 氮、磷饑餓時間對筒柱藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

通過葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)測定的葉綠素?zé)晒飧鲄?shù)能反映光合作用的原初反應(yīng)過程包括光能吸收、激發(fā)能傳遞和光化學(xué)反應(yīng)等，且各熒光參數(shù)與電子傳遞、質(zhì)子梯度的建立及二氧化碳同化過程有關(guān)[21-22]。因此，葉綠素?zé)晒鈪?shù)可作為脅迫條件下微藻抗逆反應(yīng)的指標(biāo)，用于浮游植物營養(yǎng)鹽限制的監(jiān)測[23-24]。光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量是環(huán)境脅迫對光合作用影響的重要指標(biāo)之一，在脅迫條件下明顯降低[16]。徐興蓮等[25]研究發(fā)現(xiàn)，三角褐指藻在氮限制的條件下，該參數(shù)值顯著下降。刁永芳等[26]研究發(fā)現(xiàn)，筒柱藻B169在磷饑餓條件下，光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量與接種時相比顯著降低，由最初的0.668降至0.304。本試驗(yàn)對筒柱藻B200的研究也得出了相同的結(jié)論，氮饑餓組和磷饑餓組上述參數(shù)與接種時相比均有顯著下降，但磷饑餓組的下降幅度(第3 d時的0.72 降至試驗(yàn)結(jié)束時的0.69)小于刁永芳等[26]的研究結(jié)果，原因可能是不同藻種或不同試驗(yàn)條件造成的。刁永芳等[26]的試驗(yàn)用的是中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫保存的筒柱藻B169，而本試驗(yàn)所用的是筒柱藻B200，雖然來自同一個種質(zhì)庫，但品系不同。此外，刁永芳等[26]的試驗(yàn)是由密度7.33×104個/mL接種時開始進(jìn)行磷饑餓試驗(yàn)，而本試驗(yàn)是先在最適培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)筒柱藻，到指數(shù)生長末期達(dá)到密度3.42×106個/mL時，將其離心轉(zhuǎn)接到磷饑餓的培養(yǎng)基中進(jìn)行饑餓試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同導(dǎo)致了結(jié)果的差異。光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量下降說明氮、磷饑餓條件下，筒柱藻光系統(tǒng)Ⅱ活性中心受到傷害，光合作用受到了抑制，卡爾文循環(huán)速率降低，進(jìn)而使光合效率下降[27]。本試驗(yàn)結(jié)果還表明，與磷饑餓組相比，氮饑餓組的光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量下降的幅度更大一些，說明筒柱藻對氮饑餓更敏感，當(dāng)培養(yǎng)條件中氮元素缺乏時，光合系統(tǒng)在較短的時間內(nèi)更易受到損傷或抑制。光化學(xué)淬滅表示光能被光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心捕獲并參與光化學(xué)反應(yīng)的部分[28]，最大光合作用速率的變化與暗反應(yīng)碳同化過程中的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶有很大關(guān)系，快速光曲線的初始斜率表示微藻細(xì)胞內(nèi)光能利用效率，半飽和光照度表示強(qiáng)光耐受力[16]。本試驗(yàn)中，上述熒光參數(shù)均隨氮饑餓和磷饑餓時間的延長有所降低，說明在氮饑餓和磷饑餓的條件下，筒柱藻光合機(jī)構(gòu)的捕光色素復(fù)合體合成不足，影響光系統(tǒng)Ⅱ?qū)饽艿奈?、傳遞和光化學(xué)反應(yīng)，從而使光合同化能力下降，光能吸收量降低，耐強(qiáng)光能力下降[16]。非光化學(xué)淬滅表示光系統(tǒng)Ⅱ天線色素吸收的過剩光能以熱能的形式耗散掉的部分[4]。本試驗(yàn)中，非光化學(xué)淬滅隨氮、磷饑餓時間的延長，先升后降。開始階段該參數(shù)升高，表明其卡爾文循環(huán)的活性受抑制的程度增大，葉綠素吸收的光能利用率降低，光系統(tǒng)Ⅱ的潛在熱耗散能力增強(qiáng)，對藻體本身是一種保護(hù)。隨后該參數(shù)下降，表明筒柱藻的正常生理功能受到嚴(yán)重傷害，對熱能的耗散能力不斷喪失[27]。

3.2 氮、磷饑餓時間對筒柱藻細(xì)胞密度和葉綠素含量的影響

氮和磷是植物生長必需的大量元素，對藻細(xì)胞的生長、發(fā)育和分裂等生理活動有著極其重要的作用[29]，一旦缺乏，蛋白質(zhì)及核酸等物質(zhì)合成受阻，細(xì)胞分裂緩慢甚至停止[30]。在長期的進(jìn)化過程中，微藻已形成了一些適應(yīng)營養(yǎng)鹽限制的方法，以保障其生理代謝過程的正常進(jìn)行[31]。夏榮霜等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在氮、磷營養(yǎng)鹽限制的初期，東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)受到的抑制作用較弱，細(xì)胞仍能進(jìn)行生長和分裂。許海等[33]研究發(fā)現(xiàn)，銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)在無磷的培養(yǎng)基中可保持8 d的指數(shù)生長，而斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)在無氮或無磷培養(yǎng)基中生長均很緩慢。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，筒柱藻在氮饑餓和磷饑餓條件下細(xì)胞密度均有所升高，但總體升幅不大，這可能與天然海水中存在微量的氮、磷元素有關(guān)[34]。另外，本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，磷饑餓條件下，細(xì)胞密度和葉綠素含量在整個培養(yǎng)周期內(nèi)均不斷升高，而氮饑餓條件下，細(xì)胞密度和葉綠素含量隨氮饑餓時間的延長先升后降。這說明筒柱藻對磷饑餓的耐受能力高于對氮饑餓的耐受能力。劉皓等[35]研究發(fā)現(xiàn)，中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)和威氏海鏈藻(Thalassiosiraweissflogii)在磷限制的條件下，細(xì)胞數(shù)量明顯高于氮限制條件。Guerrini等[36]研究發(fā)現(xiàn)，氮磷限制均可使短柄曲殼藻(Achnanthesbrevipes)細(xì)胞密度和葉綠素含量下降，但磷限制沒有氮限制效果明顯，以上試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。Cembella等[37]研究表明，藻類的生長直接取決于胞內(nèi)磷而并非胞外磷，當(dāng)環(huán)境中磷缺乏時并不一定意味著生長受到營養(yǎng)鹽限制而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，藻類細(xì)胞內(nèi)普遍存在“磷庫”，當(dāng)受到缺磷脅迫后，藻細(xì)胞可利用細(xì)胞中的“磷庫”進(jìn)行生長代謝。Li等[38]認(rèn)為，葉綠素是富氮化合物，當(dāng)?shù)狈r，葉綠素作為一種胞內(nèi)易得的氮源供細(xì)胞生長所需，導(dǎo)致葉綠素含量降低，當(dāng)葉綠素降低到臨界值以下時，細(xì)胞生長會受到抑制。本試驗(yàn)結(jié)果也間接證明了這一點(diǎn)，即氮饑餓條件下，葉綠素含量在氮饑餓的第1 d達(dá)到最高值后逐漸降低，降低到一定含量時，細(xì)胞停止生長。

3.3 氮、磷饑餓時間對筒柱藻總脂含量的影響

許多研究表明，氮、磷等營養(yǎng)鹽限制可有效提高藻細(xì)胞的油脂含量[4-7]。這可能是因?yàn)榈紫拗茣r，蛋白質(zhì)、酶和糖類等合成受阻，迫使代謝流向不含這些元素的化合物，如中性脂的合成[39]，最終使細(xì)胞中的總脂含量升高。也有學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞在氮磷脅迫條件下，細(xì)胞內(nèi)類囊體膜的含量降低，使乙酰水解酶得到活化，促進(jìn)了磷脂水解[40]。這些變化可能增加了細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A的含量，同時氮脅迫又能活化甘油二脂酰轉(zhuǎn)移酶，該酶能促使乙酰輔酶A向甘油三酯轉(zhuǎn)化。因此，氮磷脅迫能增加細(xì)胞內(nèi)總脂及甘油三酯的含量。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，筒柱藻的總脂含量在氮饑餓的第8 d達(dá)到最大值，比未進(jìn)行氮饑餓時增加了56.9%；在磷饑餓的第6 d達(dá)到最大值，比未進(jìn)行磷饑餓時增加了19.0%。從以上數(shù)據(jù)可以看出，氮饑餓能更好的增加筒柱藻的總脂含量。Reitan等[6]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三角褐指藻和角毛藻在磷饑餓條件下，總脂含量增加，但效果沒有氮饑餓那么顯著，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。而刁永芳等[26]對筒柱藻B169的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，磷限制并未提高該藻的總脂含量，原因可能與筒柱藻的不同品系及培養(yǎng)條件不同有關(guān)。刁永芳等[26]是從低密度(7.33×104個/mL)接種時開始進(jìn)行磷饑餓試驗(yàn)，本試驗(yàn)是采用“兩步法”培養(yǎng)筒柱藻，磷饑餓試驗(yàn)開始時的最初細(xì)胞密度較高(3.42×106個/mL)，試驗(yàn)方法的不同導(dǎo)致了結(jié)果的差異。此外，對于生物柴油下游加工成本而言，生物量和總脂含量起著同等重要的作用，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在氮、磷饑餓的第4、6、8 d，筒柱藻的總脂含量沒有發(fā)生顯著變化，基于生物量和總脂含量兩方面的考慮，筒柱藻最佳氮限制時間為6 d，最佳磷限制時間為8 d。

3.4 氮、磷饑餓時間對筒柱藻脂肪酸組成的影響

營養(yǎng)鹽限制對微藻脂肪酸組成也有顯著影響。石偉杰[41]采用“兩步法”研究了氮饑餓時間對海綠球藻和微綠球藻(Nannochlorisoculata)脂肪酸組成的影響，結(jié)果表明，總單不飽和脂肪酸含量隨氮饑餓時間的延長逐漸升高，總多不飽和脂肪酸含量隨氮饑餓時間的延長逐漸降低，氮饑餓時間對總飽和脂肪酸含量沒有顯著影響。本試驗(yàn)得出的氮饑餓時間對筒柱藻總單不飽和脂肪酸和總多不飽和脂肪酸含量影響的結(jié)果與石偉杰[41]的研究結(jié)果一致，但本試驗(yàn)中總飽和脂肪酸含量隨氮饑餓時間的延長逐步升高，與石偉杰[41]得出的結(jié)論不同。兩個試驗(yàn)都是采用“兩步法”進(jìn)行氮饑餓試驗(yàn)，氮饑餓對總飽和脂肪酸含量影響不同的原因可能與微藻種類的不同有關(guān)。刁永芳[42]對筒柱藻B169的研究結(jié)果表明，總飽和脂肪酸在缺氮和缺磷條件下含量較高，總多不飽和脂肪酸在缺氮和缺磷條件下含量較低，總單不飽和脂肪酸含量的變化則與受限營養(yǎng)鹽種類有關(guān)，缺氮時總單不飽和脂肪酸含量較高，而缺磷對總單不飽和脂肪酸含量的影響差異不顯著。本試驗(yàn)研究氮磷饑餓時間對筒柱藻B200脂肪酸組成的影響得出了與刁永芳[42]基本一致的結(jié)論，但刁永芳[42]對筒柱藻B192的研究結(jié)果則與上述結(jié)果有所不同，不同之處是缺氮和缺磷條件均能促進(jìn)該藻總單不飽和脂肪酸含量的增加，這可能與微藻的不同品系有關(guān)。因此，氮磷饑餓對微藻脂肪酸組成的影響與微藻種類、受限營養(yǎng)鹽種類、限制時間等因素相關(guān)，可根據(jù)不同的目的選擇合適的微藻品系以及營養(yǎng)鹽限制方法，以獲取不同的脂肪酸組成。此外，有研究表明[43]，富含總飽和脂肪酸和總單不飽和脂肪酸的原料更適合生產(chǎn)生物柴油。由脂肪酸分析可以看出，筒柱藻中總飽和脂肪酸和總單不飽和脂肪酸含量均隨氮、磷饑餓時間的延長達(dá)到較高值，而且該藻的主要脂肪酸是16碳鏈，與生物柴油分子15個左右的碳鏈極其相似，因此從脂肪酸組成來看，該藻是1株十分有潛力的產(chǎn)油微藻。

4 結(jié) 論

微藻因含油量高、易培養(yǎng)、單位面積產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)，被視為新一代生物柴油原料，但從經(jīng)濟(jì)方面來講，生產(chǎn)成本是目前制約微藻應(yīng)用的主要因素，因此，要想使其工業(yè)化生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本非常關(guān)鍵。對微藻生產(chǎn)生物柴油的深入研究發(fā)現(xiàn)，提高微藻的產(chǎn)油能力、優(yōu)化產(chǎn)油條件等下游工程可有效地降低生物成本，提高生物柴油的產(chǎn)量與質(zhì)量[2]。有研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，氮、磷脅迫雖是一種提高總脂含量的有效方法，但會使微藻的生物量下降。針對以上問題，本試驗(yàn)通過兩步培養(yǎng)法，即先在最適條件下培養(yǎng)筒柱藻，至指數(shù)生長末期時，將其離心轉(zhuǎn)接到氮饑餓和磷饑餓的培養(yǎng)基中使其積累大量的脂類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該藻在氮饑餓的第6 d和磷饑餓的第8 d均可獲得較高的生物量和總脂含量，從而為上述問題的解決提供了一定的理論依據(jù)。另外，該藻的脂肪酸16:0和總飽和脂肪酸含量均隨氮磷饑餓時間的延長達(dá)到較高含量，16:1n-6和總單不飽和脂肪酸含量在氮饑餓的第8 d達(dá)到最大值，這些都有利于生物柴油的生產(chǎn)。因此，可以利用上述指標(biāo)找出最佳的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)工藝，為筒柱藻的大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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EffectsofNitrogenandPhosphorusStarvationTimeonGrowthandTotalLipidContentofMarineDiatomCylindrothecasp.

LIANG Ying, MENG Xiangrong, SUN Minghui, TIAN Chuanyuan, HUANG Xulin

( The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China )

In this experiment, the chlorophyll fluorescence parameters, cell densities, chlorophyll contents, dry weights, total lipid contents and fatty acid compositions of marine diatomCylindrothecasp.B200 were studied under different nitrogen and phosphorus starvation time (0 d, 1 d, 2 d, 4 d, 6 d, and 8 d). The results showed that the maximal photochemical efficiency of PSⅡ, photochemical quenching, non-photochemical quenching, the maximum efficiency of photosynthesis, initial slope of rapid light curve and the half saturation light intensity were all decreased significantly with the increase in nitrogen and phosphorus starvation time, indicating that the photosynthesis of marine diatom was inhibited. Under nitrogen and phosphorus starvation conditions, the maximal values of the cell density were recorded at the 6th day and the 8th day, respectively, but increased slightly. The dry weight and total lipid content were increased gradually with the increasing nitrogen and phosphorus starvation time, with the maximum total lipid occurring on the day 8 (35.3%) in nitrogen starvation treatment and that on day 6 in phosphorus starvation treatment (28.9%). Nitrogen and phosphorus starvation time also had significant effects on the fatty acid compositions of the marine diatom. The contents of 16:0 and the total saturated fatty acids were increased while those of 20:4n-6, 20:5n-3 and the total polyunsaturated fatty acids decreased as nitrogen and phosphorus starvation time increased. For the 16:1n-7 and the total monounsaturated fatty acids, the values increased with the increasing nitrogen starvation time, whereas there was no significant variation in the above fatty acids related to the phosphorus starvation time. The trend of these indicators changing with nitrogen and phosphorus starvation time provides the reference for the large-scale cultivation and exploitation of marine diatom.

Cylindrothecasp.; nitrogen and phosphorus starvation time; chlorophyll fluorescence parameter; growth; total lipid content; fatty acid composition

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.001

Q945.79

A

1003-1111(2017)03-0249-10

2016-07-01；

2016-08-29.

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD14B01)；國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2014AA022001).

梁英(1967-)，女，教授，博士；研究方向：微藻生理生化．E-mail: yliang@ouc.edu.cn.