劉 洋，郝若伊，夏儷寧，潘錦鋒

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；2.海洋食品教育部工程研究中心，遼寧 大連 116034 )

鮭魚肉和飼料中類胡蘿卜素的分析方法

劉 洋1,2，郝若伊1,2，夏儷寧1,2，潘錦鋒1,2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；2.海洋食品教育部工程研究中心，遼寧 大連 116034 )

魚肉和飼料中的蝦青素分析方法對于研究鮭魚肉色質(zhì)量及飼料對其影響至關(guān)重要。本研究建立了北極紅點(diǎn)鮭魚肉類胡蘿卜素的正相高效液相色譜分析方法。該方法采用正己烷與異丙醇等度洗脫(93∶7，體積比)，流速 1.1 mL/min，可實(shí)現(xiàn)18 min內(nèi)4種常見鮭魚類胡蘿卜素包括蝦青素、角黃素、β-胡蘿卜素和玉米黃素的有效分離。研究結(jié)果顯示，蝦青素的回收率和變異系數(shù)值分別為 97%和1.5%。正己烷和異丙醇復(fù)合溶劑提取的魚肉樣品與丙酮提取并經(jīng)氨基固相萃取小柱純化后的魚肉樣品的蝦青素含量接近，但比丙酮提取樣品中蝦青素含量略低。正相高效液相色譜法和分光光度法測定魚肉蝦青素含量分別為1.43 mg/L和2.43 mg/L。研究同時(shí)建立了鮭魚飼料蝦青素分析方法。研究結(jié)果表明，-80 ℃冷凍結(jié)合氨基固相萃取小柱純化可去除飼料樣品中的大部分脂肪。飼料中蝦青素酯皂化的最佳條件為：0.10 mol/L 甲基化氫氧化鈉，22 ℃，20 min；或者0.12 mol/L甲基化氫氧化鈉，4 ℃，3 h。研究結(jié)果表明，兩種方法可用于鮭魚肉和飼料中的蝦青素分析，為相關(guān)研究帶來方便。

鮭魚；蝦青素；高效液相色譜；皂化；固相萃??；分光光度計(jì)

鮭魚肌肉顏色是鮭魚質(zhì)量的重要方面，鮭魚肌肉的紅色源于其沉積的類胡蘿卜素，很多研究表明蝦青素是其中最重要的一種[1-3]。不少魚類營養(yǎng)研究專注于鮭魚飼料對肉色的影響，而針對二者的快速有效的類胡蘿卜素分析方法顯得尤為重要。常用的類胡蘿卜素分析方法有分光光度法和高效液相色譜法。前者簡便易行，但測定結(jié)果不準(zhǔn)確，準(zhǔn)確定量還需依靠高效液相色譜法。目前，大部分類胡蘿卜素的高效液相色譜法主要針對植物類樣品，并且大都是反相高效液相色譜法，而有關(guān)動(dòng)物組織類胡蘿卜素的高效液相色譜測定法相對較少。

鮭魚營養(yǎng)對肌肉品質(zhì)影響相關(guān)研究往往同時(shí)關(guān)注魚肉色素和脂肪酸組成的品質(zhì)。由于類胡蘿卜素是脂溶性色素，提取時(shí)易引入脂肪，在后期反相高效液相色譜分析中易引起分析柱堵塞。正己烷和異丙醇混合物對類胡蘿卜素和脂肪都有較好的提取效果，且正己烷和異丙醇混合物通常用作正相高效液相色譜的流動(dòng)相。若能實(shí)現(xiàn)蝦青素的正相高效液相色譜分析，則正己烷和異丙醇混合物提取樣品還可用于脂肪分析，這會(huì)給此類研究帶來極大方便并降低成本。另一方面，近年來蝦青素的高成本使得圓紅酵母(Rhodosporidrumtoruloides)[4]、綠藻[5-6]、甲殼類[7-8]、磷蝦[9]等新型資源受到鮭魚養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)注。這些原料中的蝦青素多以蝦青素酯的形式存在，其定量需采用酶或化學(xué)方式進(jìn)行水解或皂化，而此過程易導(dǎo)致蝦青素的氧化損失。同時(shí)，鮭魚飼料脂肪含量高，會(huì)妨礙蝦青素酯的皂化，因此需要優(yōu)化脂肪去除方法和皂化反應(yīng)條件，建立安全高效的蝦青素酯水解方法。

本研究以北極紅點(diǎn)鮭魚(Salvelinusalpinus)和含有磷蝦粉的鮭魚飼料為研究對象，采用正相高效液相色譜法分析鮭魚魚肉蝦青素，所得結(jié)果與反相高效液相色譜和分光光度法結(jié)果比較。進(jìn)一步研究建立鮭魚飼料的脂肪去除方法和蝦青素酯皂化條件，建立一整套適合鮭魚魚肉和飼料的蝦青素分析方法，為鮭魚肌肉品質(zhì)分析和飼料作用研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

北極紅點(diǎn)鮭魚(100±12) g和鮭魚飼料均由瑞典農(nóng)業(yè)科學(xué)大學(xué)K?larne魚站提供。蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品購于德國Dr. Ehrenstorfer公司，角黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品購于美國Fluka-Sigma公司。固相萃取小柱TELOS silica購于英國Kinesis公司，ISOLUTE NH2和ISOLUTE C18 購于英國International Sorbent Technology 公司。正己烷、丙酮、甲醇、異丙醇、氫氧化鈉等試劑均由德國Merck公司提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

分光光度計(jì)[UV-2401 (PC)，Shimadzu公司]；高效液相色譜(Merck-Hitachi公司)；離心機(jī)組織勻漿機(jī)(T25DS25 IKA公司)；Thermo Fisher冷凍離心機(jī)(賽默飛公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚肉和飼料中蝦青素的提取

分別采用丙酮法與正己烷和異丙醇混合物法提取鮭魚魚肉中的蝦青素。丙酮法如下：5 g魚肉與40 mL丙酮?jiǎng)驖{3×30 s ，加入2 g 硫酸鈉，振蕩提取，離心5 min，取上清液，以上操作重復(fù)3次，直至丙酮提取液顏色不變，所得提取物用氮?dú)獯蹈桑⒉捎帽獜?fù)溶。正己烷和異丙醇混合物法參考文獻(xiàn)[10]方法。采用丙酮法提取飼料中蝦青素酯，提取方法與魚肉相同。

1.3.2 魚肉中蝦青素含量分析

分別采用分光光度法和高效液相色譜法分析魚肉中蝦青素含量。采用文獻(xiàn)[11]中分光光度法分析總蝦青素含量，測定樣品在480 nm下吸光值。蝦青素含量計(jì)算公式如下:

蝦青素質(zhì)量濃度/mg·L-1= 吸光值×10000/2100

式中，2100為蝦青素溶于正己烷和異丙醇混合物的吸光常數(shù)(1%蝦青素于1 cm比色杯中吸光值)，10000為稀釋倍數(shù)。

采用正相高效液相色譜法分析正己烷和異丙醇混合物提取魚肉蝦青素樣品，分離條件：Alltech SI 4.6×250 mm 5 μm 硅膠色譜柱；正己烷∶異丙醇(93∶7，體積比)流動(dòng)相，1.1 mL/min等度洗脫；柱溫40 ℃；上樣量10 μL；測定波長480 nm。采用反相高效液相色譜法分析丙酮提取蝦青素含量，方法參照文獻(xiàn)[1]略作修改。分離條件: 反相色譜柱LiChrospher?100RP-18 (5 μm，250 mm×4 mm)；流動(dòng)相甲醇∶水(94∶6，體積比)，0.5 mL/min等度洗脫；柱溫、上樣量同正相液譜法。以蝦青素、角黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素為標(biāo)準(zhǔn)品，采用峰面積與含量比例做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品蝦青素含量。

1.3.3 樣品脂肪去除

魚肉和飼料的丙酮提取樣品經(jīng)-80 ℃ 冷凍30 min，取出于4 ℃，4000 r/min離心去除大部分脂肪。采用硅膠小柱，氨基小柱和C18小柱進(jìn)一步去除脂肪。其中硅膠小柱和氨基小柱采用1∶1丙酮和正己烷混合液活化，上樣后采用正己烷洗脫脂肪，再用1∶1丙酮甲醇混合液洗脫蝦青素。C18 小柱則采用甲醇活化，再用1∶1的丙酮甲醇混合液洗脫蝦青素。收集洗脫樣品，氮?dú)獯蹈?，?fù)溶于丙酮。

1.3.4 皂化反應(yīng)

采用文獻(xiàn)[12]方法，以甲基化氫氧化鈉為皂化試劑對飼料樣品中的蝦青素酯進(jìn)行皂化反應(yīng)。考察22 ℃和4 ℃下，0.12、0.10、0.08、0.06 mol/L甲基化氫氧化鈉的蝦青素酯皂化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)變化。采用上述正相高效液相色譜法測定皂化反應(yīng)后樣品中游離蝦青素的含量，優(yōu)化飼料樣品蝦青素酯的最佳皂化條件。

2 結(jié) 果

2.1 4種鮭魚色素的正相高效液相色譜分析

β-胡蘿卜素在2.3 min 出峰(峰1)，角黃素在5.4 min 出峰(峰 2)，蝦青素在7.9 min出峰(峰3) ，玉米黃素在15.6 min 出峰(峰4)，整個(gè)分離過程正相高效液相色譜法在 18 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了4種色素的完全分離(圖1a)。

2.2 提取方法對蝦青素測定結(jié)果影響

正己烷和異丙醇混合物提取魚肉樣品和丙酮提取魚肉樣品的正相液譜法蝦青素分離色譜圖見圖1b、1c，角黃素和蝦青素的加標(biāo)分離色譜圖見圖1e。結(jié)果表明，鮭魚魚肉中含有大量蝦青素和少量β-胡蘿卜素，在正己烷和異丙醇混合物提取魚肉樣品中還檢測到極低含量的玉米黃素。丙酮提取魚肉樣品中蝦青素含量略高于正己烷和異丙醇混合物提取魚肉樣品中蝦青素含量(1.81 mg/L>1.43 mg/L) (圖1b、1c，表1)。丙酮提取魚肉樣品經(jīng)固相小柱純化并采用反相高效液相色譜分析其中蝦青素含量為1.52 mg/L，與正己烷和異丙醇混合物的正相高效液相色譜分析結(jié)果(1.43 mg/L)相近。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色素正相HPLC分析色譜圖a，40 mg/L的蝦青素、角黃素、β-胡蘿卜素和玉米黃素混合標(biāo)準(zhǔn)品；b，正已烷和異丙醇混合物提取北極斑點(diǎn)鮭魚肉色素；c，丙酮提取北極斑點(diǎn)鮭魚肉色素；d，丙酮提取北極斑點(diǎn)鮭魚肉色素樣品的蝦青素加標(biāo)樣(20 mg/L)；e，丙酮提取北極斑點(diǎn)鮭魚肉色素樣品的角黃素加標(biāo)樣(20 mg/L).峰1為β-胡蘿卜素，峰2為角黃素，峰3為蝦青素，峰4為玉米黃素.

注：HIPs為正己烷和異丙醇混合物提取魚肉樣品,ACEs為丙酮提取魚肉樣品，ACEs-SPE為丙酮提取魚肉經(jīng)固相小柱純化樣品，下同.

2.3 蝦青素高效液相色譜法與分光光度法分析結(jié)果

采用加標(biāo)回收法考察正相高效液相色譜法對蝦青素和角黃素的分析精準(zhǔn)度。結(jié)果顯示，二者標(biāo)準(zhǔn)曲線(0.625，1.25，2.5，5.0，10.0 mg/L)具有良好的線性關(guān)系(r2>0.9993)。最低檢出限(3倍空白信號(hào))和最低定量限(10倍空白信號(hào))分別為蝦青素0.06 mg/L和0.2 mg/L，角黃素0.07 mg/L和0.2 mg/L。以魚肉樣品做加標(biāo)回收試驗(yàn)，采用正相高效液相色譜和反相高效液相色譜(經(jīng)小柱純化)分析蝦青素和角黃素含量(表2)，正相高效液相色譜法所得蝦青素和角黃素回收率分別為97% 和96%，反相高效液相色譜法則為82%和77%。正相和反相高效液相色譜分析結(jié)果RSD值分別為蝦青素1.5%、角黃素2.1%，蝦青素1.4%、角黃素2.5%。不同提取方法和測定方法所得蝦青素含量見表1。無論是分光光度法還是正相高效液相色譜法，測定的丙酮提取樣品中蝦青素含量均高于正己烷和異丙醇混合物與丙酮提取魚肉經(jīng)固相小柱純化樣品中蝦青素含量，而正己烷和異丙醇混合物與丙酮提取魚肉經(jīng)固相小柱純化樣品分析結(jié)果無顯著差異。丙酮提取魚肉樣品的蝦青素正相高效液相色譜分析結(jié)果最高的，且所有高效液相色譜分析所得蝦青素含量均低于分光光度法測定含量。

2.4 飼料樣品脂肪的去除和蝦青素酯皂化

飼料提取樣品于-80 ℃放置30 min后離心所得脂肪沉淀(試管底部絮狀物較多)，大部分脂肪被去除(圖2)。采用固相小柱清除殘留脂肪，第3道為NH2小柱處理樣品的脂肪分布情況，其游離脂肪和甘油三酯含量比其他類型固相小柱處理樣品低(圖3)。

研究考察了皂化試劑甲醇化氫氧化鈉于22 ℃和4 ℃下水解飼料樣品蝦青素酯的過程，分析皂化樣品中游離蝦青素含量隨時(shí)間的變化規(guī)律。22 ℃下0.12、0.10、0.08 mol/L和0.06 mol/L氫氧化鈉水解樣品中蝦青素質(zhì)量濃度分別在20、25、30、40 min 時(shí)達(dá)到最高值，即17.0、18.1、18.0、16.2 mg/L(圖4a)。隨著水解時(shí)間的延長，蝦青素質(zhì)量濃度在120 min內(nèi)降至起始質(zhì)量濃度以下。4 ℃皂化(圖4b)，氫氧化鈉濃度為0.12 mol/L和0.10 mol/L 時(shí)樣品蝦青素最高質(zhì)量濃度出現(xiàn)在3 h，分別是 15.0 mg/L和14.9 mg/L，而使用0.06 mol/L和0.08 mol/L氫氧化鈉時(shí)樣品最高質(zhì)量濃度則出現(xiàn)在4 h 和7 h，質(zhì)量濃度分別是14.4 mg/L和13.9 mg/L。蝦青素質(zhì)量濃度的ln[1-(x/CAE0)] 和皂化時(shí)間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖4c, 4d)。另外，22 ℃皂化所得蝦青素質(zhì)量濃度略高于4 ℃下皂化所得含量。

圖2 飼料提取樣品于-80 ℃放置30 min后離心所得脂肪沉淀

圖3 不同固相小柱處理的樣品脂肪薄層色譜圖1道，標(biāo)準(zhǔn)品；2道，無固相小柱處理樣品；3道，NH2 小柱處理樣品；4道，C18小柱處理樣品；5道，硅膠小柱處理樣品.FAME，脂肪酸甲酯；TAG，甘油三酯；FFA，游離脂肪酸；CLR, 膽固醇.

圖4 游離蝦青素質(zhì)量濃度在不同皂化溫度下隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)分析a為22 ℃，b為4 ℃；不同濃度甲醇—?dú)溲趸c對蝦青素皂化速率的一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(n=3)；c為22 ℃，d為4 ℃.

3 討 論

3.1 4種常見色素的正相高效液相色譜分析法

蝦青素和角黃素是鮭魚魚肉中最常見的兩種色素，但在Ando等[13-14]之前的鮭魚色素研究中也發(fā)現(xiàn)有β-胡蘿卜素、玉米黃素存在，因此本研究建立的正相高效液相色譜法涵蓋了這4種色素。本研究正相高效液相色譜法中4種色素出峰順序依次為β-胡蘿卜素、角黃素、蝦青素、玉米黃素，而Yuan等[15]采用C18 柱分離以上4種色素時(shí)出峰順序?yàn)槲r青素6.0 min、玉米黃素7.2 min、角黃素14.1 min、β-胡蘿卜素44.0 min。正相高效液相色譜與反相高效液相色譜分離所用的流動(dòng)相和柱子性質(zhì)截然相反，蝦青素和玉米黃素非極性較強(qiáng)，故在正相中容易被洗脫，而β-胡蘿卜素、角黃素極性較弱，因而在反相色譜中較早被洗脫。已有的報(bào)道中反相高效液相色譜法分離蝦青素的保留時(shí)間出現(xiàn)在3.0～8.3 min[1,16]，本文正相高效液相色譜法的蝦青素保留時(shí)間為7.9 min，兩種高效液相色譜法相近。但對整個(gè)分離過程，本文的正相高效液相色譜法18 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了4種色素的完全分離，目前所查詢到的反相高效液相色譜法均需45 min以上[12,15]，可見本研究建立的鮭魚色素正相高效液相色譜分析法時(shí)間更短，具有優(yōu)勢。

3.2 不同提取方法對蝦青素測定結(jié)果的影響

本研究發(fā)現(xiàn)北極紅點(diǎn)鮭魚肉中含有的主要色素是蝦青素和β-胡蘿卜素，正己烷和異丙醇混合物提取樣中發(fā)現(xiàn)有玉米黃素。鮭魚魚肉最重要的色素是蝦青素、角黃素，其他類型色素較少見。由于鮭魚自身不能合成以上色素，因此飼料是決定魚肉色素種類的關(guān)鍵因素，對此很多研究已經(jīng)證實(shí)[14,17]。本研究發(fā)現(xiàn)的胡蘿卜素和玉米黃素可能來源于鮭魚攝入飼料中的磷蝦粉和貽貝粉，后二者攝食海洋中的藻類，可沉積各種類胡蘿卜素。高效液相色譜法測定的丙酮提取魚肉樣品蝦青素含量高于正己烷和異丙醇混合物提取魚肉樣品含量，分光光度法測定結(jié)果亦是如此，表明丙酮對蝦青素的提取效果優(yōu)于正己烷和異丙醇混合物。丙酮極性適中，常用于類胡蘿卜素的提取，而正己烷和異丙醇混合物極性較強(qiáng)，常用于脂類提取，該結(jié)果符合提取溶劑的性質(zhì)。值得注意的是，經(jīng)固相小柱純化后的丙酮提取樣品采用反相高效液相色譜分析時(shí)，蝦青素含量與正己烷和異丙醇混合物提取的樣品的正相高效液相色譜分析結(jié)果相近，這表明，研究建立的正己烷和異丙醇混合物蝦青素提取法結(jié)合正相高效液相色譜可以取代丙酮提取法和反相高效液相色譜法用于蝦青素的提取與定量分析。如前所述，鮭魚營養(yǎng)研究往往同時(shí)關(guān)注魚肉色素和脂肪品質(zhì)。采用丙酮提取類胡蘿卜素易引入脂肪，引起反相色譜分析柱的堵塞。本研究中正己烷和異丙醇混合物提取蝦青素樣品實(shí)現(xiàn)了正相高效液相色譜分析，同時(shí)該正己烷和異丙醇混合物提取樣品亦可用于脂肪分析，這給鮭魚營養(yǎng)管理對肉質(zhì)的影響相關(guān)研究帶來了方便、降低了成本。

3.3 蝦青素的正相和反相高效液相色譜與分光光度法比較

加標(biāo)回收法的結(jié)果顯示兩種高效液相色譜分析法均具有良好的線性穩(wěn)定性，RSD值則表明兩種方法均具有良好精度，因此兩種高效液相色譜法適用于蝦青素的檢測。最低檢出限和最低定量限結(jié)果表明，兩種高效液相色譜法對于蝦青素的檢測比角黃素更靈敏。魚肉樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)中正相高效液相色譜法的蝦青素和角黃素回收率高于反相高效液相色譜法結(jié)果，這可能由于樣品在小柱純化過程中時(shí)間較長被氧化，也可能由于色素洗脫過程中未完全洗脫，導(dǎo)致結(jié)果偏低?？梢娬喔咝б合嗌V法操作簡單，無需過多前處理步驟，可避免蝦青素的損失風(fēng)險(xiǎn)。

分光光度法和正相高效液相色譜法測定的丙酮提取魚肉樣品蝦青素含量均高于正己烷和異丙醇混合物提取魚肉樣品和丙酮提取魚肉經(jīng)固相小柱純化樣品結(jié)果。正己烷和異丙醇混合物常用于脂肪的提取，而丙酮?jiǎng)t主要用于類胡蘿卜素的提取，丙酮的提取效果略高于正己烷和異丙醇混合物，對此Yin等[18]已有報(bào)道。需要指出的是，丙酮提取魚肉樣品的蝦青素正相高效液相色譜分析結(jié)果是所有分析樣品中最高的，這證實(shí)固相小柱處理會(huì)導(dǎo)致部分蝦青素的損失。另外，所有高效液相色譜分析結(jié)果均低于分光光度法測定結(jié)果，Li等[19]在雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)的蝦青素含量測定中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。Young等[20]認(rèn)為分光光度法測定結(jié)果包含了β-胡蘿卜素、玉米黃素、葉綠素等非蝦青素物質(zhì)，不能代表蝦青素的準(zhǔn)確含量，精準(zhǔn)測定仍需依靠高效液相色譜，本文研究結(jié)果與以上結(jié)論一致。

3.4 飼料中脂肪的去除和蝦青素酯的皂化

Turchini等[21]總結(jié)了多種常見鮭魚飼料的脂肪含量，發(fā)現(xiàn)鮭魚飼料脂肪含量大都高于40%。陳興才等[22]指出皂化反應(yīng)是一個(gè)界面反應(yīng)，高含量的脂肪會(huì)妨礙蝦青素酯和酶或皂化試劑的接觸，抑制皂化反應(yīng)，因此皂化前需去除脂肪。本文結(jié)果表明，采用的-80 ℃低溫冷凍結(jié)合離心法實(shí)現(xiàn)了大部分脂肪的去除。進(jìn)一步采用固相小柱清除殘余脂肪，發(fā)現(xiàn)氨基小柱對飼料樣品的脂肪有較好清除效果。以上兩種方法相結(jié)合去除脂肪方便可行，為后續(xù)水解皂化提供了良好條件。本研究所用鮭魚飼料中引入了南極磷蝦粉、貝類粉，該類蝦青素資源多以酯的形式存在，因此采用皂化將其轉(zhuǎn)為游離態(tài)才能被高效液相色譜準(zhǔn)確測定。Goto等[23]指出蝦青素具有紫羅酮和共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的色素易被氧化。因此為避免皂化中的氧化損失，需對皂化條件進(jìn)行優(yōu)化。甲醇?xì)溲趸c是常用溫和皂化試劑，Weissenberg等[24]報(bào)道該試劑可實(shí)現(xiàn)室溫下葉綠素酯的安全皂化，Yuan等[12]隨后采用甲醇化氫氧化鉀進(jìn)行了雨生紅球藻中蝦青素酯的皂化，取得了良好效果。筆者采用甲醇?xì)溲趸c對飼料中的蝦青素酯進(jìn)行皂化。4 ℃和22 ℃下蝦青素含量達(dá)到最高峰時(shí)間隨著堿濃度的增加而減少，4 ℃達(dá)到蝦青素最高峰需要的時(shí)間遠(yuǎn)長于22 ℃所需時(shí)間，這表明堿的濃度和溫度都顯著影響了水解速度，濃度和溫度越高，速度越快。蝦青素含量在120 min和12 h后降低到了起始含量以下，表明長時(shí)間的皂化會(huì)導(dǎo)致蝦青素的損失。22 ℃皂化所得蝦青素含量略高于4 ℃下皂化所得含量，這可能是由于操作不均一性引起的。另外，蝦青素含量的ln[1-(x/CAE0)] 和皂化時(shí)間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖4c, 4d)，表明蝦青素酯的皂化反應(yīng)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)規(guī)律，該結(jié)果與Yuan等[12]的結(jié)論一致。綜上結(jié)果可得蝦青素的最佳皂化條件為：22 ℃下，堿濃度0.10 mol/L，皂化時(shí)間 20 min，或 4 ℃下，堿濃度0.12 mol/L，皂化時(shí)間3 h。

4 結(jié) 論

所建立的類胡蘿卜素正相高效液相色譜法可實(shí)現(xiàn)18 min內(nèi)β-胡蘿卜素、角黃素、蝦青素和玉米黃素的有效分離。采用正己烷和異丙醇混合物提取的鮭魚肌肉樣品可用于蝦青素分析。深度冷凍和離心結(jié)合NH2固相小柱可去除飼料中脂肪。采用堿濃度0.10 mol/L，22 ℃皂化20 min，或者堿濃度0.12 mol/L，4 ℃皂化時(shí)間3 h 可保證飼料中蝦青素酯的安全水解。本文建立的鮭魚肌肉和飼料中蝦青素提取、分離、皂化方法可實(shí)現(xiàn)二者蝦青素的安全有效分析。

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AnalysisMethodsofCarotenoidsinMuscleandFeedinSalmonids

LIU Yang1,2, HAO Ruoyi1,2, XIA Lining1,2, PAN Jinfeng1,2

( 1.National Engineering Research Center of Seafood, School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. Engineering Research Center for Marine Food, Ministry of Education, Dalian 116034, China )

The carotenoind content in muscle and feed of Arctic charr (Salvelinusalpinus) was analyzed by normal-phase and revers-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) as well as spectrometric method. Muscle sample extracted by hexane: isopropanol (HIP) or acetone was detected for astaxanthin (AST) contents by the methods above. Results showed that a good separation of AST, canthaxanthin (CAN), β-carotene and lutein was achieved in 18 min by a normal-phase high-performance liquid chromatography (NHPLC) method, isocratic elution with hexane: isopropanol (HIP) (93:7,V/V) as mobile phase at a flow rate of 1.1 mL/min. Average AST recovery of 97% and AST coefficient value (CV) 1.5% were observed in fish muscle samples by NHPLC method. By the method, HIP-extraction showed similar muscular AST content (1.43 mg/L) to acetone-extracted sample cleaned with NH2-SPE column (ACEs-SPE) (1.60 mg/L), slightly lower than that in acetone-extracted sample (ACEs, 1.81 mg/L). It was found that the NPLHC method combined with HIP extraction was used to substitute the RHPLC and acetone extraction for AST in salmonids muscle, which brings many conveniences to lipid measurement as well. However, AST content analyzed by NHPLC (1.43 mg/L) was lower than that by spectrophotometric method (2.43 mg/L). For feed including algae, crustaceans and krill, AST appears as ester style requires a saponification reaction before measurement, and this usually is inhibited by the high content of lipid in feed. The study succeeded in using deep freezing coupled with NH2-SPE column treatment for removal of most fat and in establishment of optimal saponifcaition condition. There was the maximal AST content in 20 min saponifizion with 0.10 mol/L methic NaOH at 22 ℃ or 3 h and with 0.12 mol/L methic NaOH at 4 ℃. The findings suggest that two systematic methods involving sample extraction, fat removing and NHPLC method could be used for AST analysis in salmonid muscle and feed.

salmon; astaxanthin; HPLC; saponification; solid-phase extraction; spectrophotometer

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.004

S986

A

1003-1111(2017)03-0274-08

2016-07-01；

2016-09-06.

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAD04B09).

劉洋(1989-)，女，碩士研究生；研究方向：水產(chǎn)品加工. E-mail：1239015238@qq.com.通訊作者： 潘錦鋒(1984-)，男，副教授，博士；研究方向：水產(chǎn)品加工理論與技術(shù).E-mail：pjf613@163.com.