王新慧 李 偉 張燕蕓 呂麗靜 曲曉蘭

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東 泰安 271016)

Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化泰山紫草中總萘醌提取工藝

王新慧 李 偉 張燕蕓 呂麗靜 曲曉蘭

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東 泰安 271016)

目的 優(yōu)選泰山紫草總萘醌的提取工藝。方法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken效應(yīng)面法，以總萘醌的提取率為指標(biāo)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比等的影響，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總萘醌的含量。結(jié)果 確定泰山紫草中總萘醌的最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時(shí)間30 min，料液比1∶18，提取2次，總萘醌的提取率為3.384%。結(jié)論 Box-Behnken效應(yīng)面法用于泰山紫草中總萘醌提取工藝條件的優(yōu)選是可行的，模型預(yù)測(cè)效果較好。

泰山紫草；總萘醌；Box-Behnken效應(yīng)面法；提取工藝

泰山紫草為泰山“四大名藥”之一，為紫草科植物紫草(Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc.)的干燥根，具有活血、涼血、清熱解毒、消炎殺菌等功效[1]。紫草藥理作用廣泛, 具有抗炎抗菌、抗腫瘤、抗艾滋病、抗炎、保護(hù)肝臟、抗氧化、降血糖、改善微循環(huán)系統(tǒng)功能等作用[2]。萘醌類(lèi)化合物是泰山紫草主要有效成分之一, 易溶于氯仿、石油醚,可溶于乙醇,微溶于水，對(duì)熱不穩(wěn)定[3]。綜合考慮各方面因素,本實(shí)驗(yàn)采用超聲法提取泰山紫草中總萘醌類(lèi)成分，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken效應(yīng)面法，優(yōu)化泰山紫草總萘醌的提取工藝，為泰山紫草中總萘醌的提取工藝提供技術(shù)參數(shù)。

1 儀器與試劑

KQ-5200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-2550型紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；FC-104電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)。泰山紫草(購(gòu)自于泰山四大名藥開(kāi)發(fā)有限公司),經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院蘇延友教授鑒定為為紫草科植物紫草的干燥根。左旋紫草素對(duì)照品(批號(hào)110769-200405，中國(guó)藥品生物制品檢定所),水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1供試液的制備

2.1.1對(duì)照品溶液的制備 精確稱取左旋紫草素對(duì)照品0.0025 g,置于容量瓶中,用無(wú)水乙醇溶解,定容至50 ml,得到濃度為0.05 mg·ml-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.1.2泰山紫草總萘醌的提取 稱取干燥后的泰山紫草粗粉(10目)樣品粉末10.00 g，置圓底燒瓶中，在一定的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比條件下，超聲法提取總萘醌，提取液冷卻濃縮，離心，取上清液置于量瓶中，乙醇定容至50 ml，作為待測(cè)液。

2.2總萘醌的測(cè)定

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取左旋紫草素對(duì)照品液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml分別置于的容量瓶中,用無(wú)水乙醇定容至10 ml,搖勻。在516 nm處測(cè)定吸光度,并以吸光度為縱坐標(biāo)(Y),左紫草素對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X),做回歸曲線,得回歸方程Y=24.946X-0.0059,r=0.9994,結(jié)果表明，左旋紫草素的質(zhì)量濃度在5～25 mg·ml-1的范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.2.2泰山紫草中總萘醌的含量測(cè)定 精密量取上述樣品供試液2 ml，按“2.2.1”項(xiàng)下的操作方法，再計(jì)算出樣品中總萘醌的量。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗(yàn) 精密量取左旋紫草素對(duì)照品液2 ml，置于10 ml的容量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻，按“2.2.1”項(xiàng)下的方法測(cè)定待測(cè)溶液在516 nm處的吸光度，RSD=2.32%(n=6)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液2.0 ml，按“2.2.1”項(xiàng)下方法操作，于0 h,0.5 h,1.0 h,2.0 h,4.0 h,6.0 h，8.0 h測(cè)定吸光度，計(jì)算 RSD=1.71%，結(jié)果表明供試液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn) 取同一泰山紫草提取液6份，每份2 ml，按“2.2.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定溶液在516 nm處的吸光度，計(jì)算RSD=2.89%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.4加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的泰山紫草提取液6份，每份加入左旋紫草素對(duì)照品液1 ml，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定溶液在516 nm處的吸光度，測(cè)得平均回收率為98.92%，計(jì)算RSD=1.53%。

2.4單因素試驗(yàn)

2.4.1提取時(shí)間對(duì)泰山紫草總萘醌提取率的影響 稱取泰山紫草粗粉5份，每份5.0 g，分別加入10倍量的80%乙醇溶液，分別超聲輔助提取5 min、10 min、15 min、30 min和45 min，按“2.2.1”項(xiàng)下操作，于516 nm處測(cè)定提取液吸光度，并計(jì)算出總萘醌的含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。如圖所示隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總萘醌提取量隨之增加，當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)達(dá)到最大值，之后，總萘醌的提取量趨于穩(wěn)定，故選取提取時(shí)間為30 min。

表1 因素與水平表

表2 設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

圖1 提取時(shí)間與提取率的關(guān)系

2.4.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)泰山紫草總萘醌提取率的影響 稱取泰山紫草粗粉6份，每份5.0 g，分別加入10倍量的50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液超聲提取15 min，按“2.2.1”項(xiàng)下操作，于516 nm處測(cè)定提取液吸光度，并計(jì)算出總萘醌的含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高泰山紫草總萘醌的提取率也增大,當(dāng)乙醇得體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，總萘醌的提取率為最大值，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增高，總萘醌的提取率開(kāi)始下降。因此, 確定提取時(shí)選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)在80%左右。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取率的關(guān)系

2.4.3料液比對(duì)泰山紫草總萘醌提取率的影響 稱取泰山紫草粗粉5份，每份5.0 g，分別用5、10、15、20、30倍體積的80%乙醇溶液，分別超聲提取15 min，按“2.2.1”項(xiàng)下操作，于516 nm處測(cè)定提取液吸光度，并計(jì)算出總萘醌的含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著料液比體積的增加，總萘醌提取率也隨之增加，當(dāng)溶劑達(dá)到一定量之后，再增加溶劑的量，對(duì)總萘醌提取率影響不大，由于加大溶劑的量，會(huì)提高提取的成本，故料液比選擇15倍體積。

圖3 料液比與提取率的關(guān)系

2.4.4提取次數(shù)對(duì)泰山紫草總萘醌提取率的影響 稱取泰山紫草粗粉3份，每份5.0 g，分別用15倍體積的80%乙醇溶液，分別超聲輔助提取20 min，分別提取1,2,3次，按“2.2.1”項(xiàng)下操作，于516 nm處測(cè)定提取液吸光度，并計(jì)算出總萘醌的含量。隨著提取次數(shù)的增加，總萘醌提取率也隨之增加，提取次數(shù)為2次和3次的總萘醌提取率非常相近，說(shuō)明總萘醌提取率已經(jīng)接近最高，考慮到隨著提取次數(shù)的增加，溶劑的使用量也增加,溶劑回收成本增高,且隨著提取次數(shù)增加,雜質(zhì)成分也隨之增多,會(huì)影響泰山紫草總萘醌的提取效果，綜合考慮,確定提取2次較為合理。

2.5工藝優(yōu)化試驗(yàn)

2.5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)效應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以泰山紫草總萘醌提取率為響應(yīng)值，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和液料比為考察因素，每個(gè)因素設(shè)三個(gè)水平，試驗(yàn)水平因素安排見(jiàn)表1，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5.2模型擬合[4]以泰山紫草總萘醌提取率為響應(yīng)值，采用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和液料比對(duì)總萘醌提取率影響的二項(xiàng)式方程，擬合后，得到回歸模型方程為：Y=3.2720+0.2038 A+0.2163 B+0.2450 C+0.1100 AB-0.0325 AC+2.500 BC-0.3435 A2-0.2835 B2-0.1260 C2。

對(duì)該模型進(jìn)行回歸方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，該模型P<0.0001，表明實(shí)驗(yàn)所得的回歸模型方程極顯著。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的區(qū)域范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和料液比的P值均<0.001，對(duì)總萘醌得率的影響極顯著。乙醇體積分?jǐn)?shù)二次項(xiàng)和提取時(shí)間二次項(xiàng)和的P值均<0.0001，料液比二次項(xiàng)P值<0.01，整體模型P值<0.0001達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型擬合性較好。

2.5.3效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測(cè) 根據(jù)回歸模型方程，將乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間對(duì)泰山紫草總萘醌提取率的影響繪制成響應(yīng)面圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間對(duì)總萘醌提取率的響應(yīng)面圖

由圖4可知，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總萘醌提取率的影響最為顯著，其次是提取時(shí)間，料液比對(duì)總萘醌提取率的影響最小。根據(jù)模型分析結(jié)果及相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高線圖，確定總萘醌提取的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為82.76%，料液比為1∶17.73(g·ml-1)，提取時(shí)間為 32.25 min，提取2次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作的可行性，將提取工藝修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，料液比為1∶18(g·ml-1)，提取時(shí)間為30 min，超聲提取2次。 在此條件下，測(cè)得總萘醌提取率為3.384%(n=5，RSD=1.09%)，與理論預(yù)測(cè)值3.371%接近，說(shuō)明該模型能較真實(shí)地反映各因素對(duì)總萘醌提取率的影響，模型方程可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素分別考察了提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取次數(shù)對(duì)總萘醌提取率的影響，確定了影響得率的主要因素。由于星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法是采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，并在中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，可以提高實(shí)驗(yàn)精確度，更好地體現(xiàn)各因素、指標(biāo)與效應(yīng)值的關(guān)系等特點(diǎn)[5]，故本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken效應(yīng)面法設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，建立了模型，并通過(guò)方差分析，得出各個(gè)因素之間的交互作用都較強(qiáng)，影響泰山紫草總萘醌得率的因素依次為主次關(guān)系依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取時(shí)間，料液比。實(shí)驗(yàn)確定了提取總萘醌的最佳工藝條件，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，料液比為1∶18(g·ml-1)，提取時(shí)間為30 min，提取2次。該模型準(zhǔn)確有效。

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Optimization of extraction technology for total naphthoquinones from lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc. by Box-Behnken design

WANGXin-huiLIWeiZHANGYan-yunLIULi-jingQUXiao-lan

(Pharmacy College,Taishan Medical University,Taian 271016,China)

Objective: To optimize the extraction technology for total naphthoquinones from Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc by Box-Behnken design.Methods:Based on the results of single-factor experiment, Box-Behnken experimental design combined with response surface methodology was employed, investigatine the ethanol concentration, solid-liquid ratio,and extraction time affecting the extraction process,the extraction rate of total naphthoquinones indicators. The total naphthoquinone content by UV spectrophotometer.Results: The optimization processing parameters was as follows: ultrasonic extracted 30min with 18 times the amount of 80% ethanol and extract twice, respectively. The extraction rate of total naphthoquinones was 3.384%. Conclusion:Box-Behnken experimental designis feasible, and highly predictive.

Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc;total naphthoquinones;Box-Behnkend-design; extraction process

山東省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：J16LM10)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2013255)；泰山地產(chǎn)中藥研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心基金(編號(hào)：zd099)。

王新慧，女，2013級(jí)中藥學(xué)專業(yè)在校本科生。

曲曉蘭，女，碩士，副教授，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

R931.6

A

1004-7115(2017)12-1324-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.002

2017-08-05)