蘇陽 秦廣啟 廖秋明 Stig Steen 喬晨暉

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 心外科 河南 鄭州 450052；2.隆德大學醫(yī)院 心胸外科 瑞典 22594)

熱缺血時間對循環(huán)停止豬心供體冠狀動脈內皮功能的影響

蘇陽1秦廣啟2廖秋明2Stig Steen2喬晨暉1

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 心外科 河南 鄭州 450052；2.隆德大學醫(yī)院 心胸外科 瑞典 22594)

目的探究熱缺血時間對循環(huán)停止豬心供體(DCD)冠狀動脈內皮細胞功能的影響。方法將18頭健康瑞典家豬隨機分為對照組、熱缺血30 min組、熱缺血40 min組，每組6只。將對照組冠狀動脈前降支遠端血管截成血管環(huán)進行器官浴槽實驗；另外兩組采用腔靜脈插管將循環(huán)血液排空建立失血DCD模型，將心臟遺留在胸腔內，分別在30 min和40 min后進行器官浴槽實驗(方法同對照組)。比較3組內皮依賴性舒張功能(EDR)。結果對照組、熱缺血30 min組和熱缺血40 min組最大內皮依賴性舒張百分數(EDRmax)分別為(95.72±0.95)%、(95.09±0.85)% 和(94.41±1.06)%，3組EDRmax比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對照組、熱缺血30 min組和熱缺血40 min組P物質半最大效應濃度負對數(pEC50)分別為(6.53± 0.07)%、(6.43±0.02)%和(6.38±0.04)%，3組pEC50比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論在實驗條件下，熱缺血30 min及40 min對豬循環(huán)停止豬心供體冠狀動脈內皮細胞功能無顯著影響。

循環(huán)停止供體；熱缺血；內皮細胞；心臟移植

器官移植是各器官終末期疾病的有效治療手段，然而供體器官的缺乏仍舊是制約器官移植發(fā)展的主要問題。為了填補器官需求與供體數量的缺口，循環(huán)停止供體(donation after circulatory death，DCD)又重新回歸醫(yī)學視野。Ali等[1]使用豬心進行循環(huán)停止實驗，結果顯示DCD供心移植術后心室功能恢復正常；Tolboom等[2]通過體外灌注裝置研究證實DCD供心的熱缺血損傷可以恢復。DCD供體可作為肝、腎來源已得到臨床證實和應用[3-4]。由于心臟生理代謝的特殊性及DCD供體引起的不可避免性熱缺血損傷，DCD供心的臨床可行性需要進一步研究[5]。本研究通過探討不同熱缺血時間對冠狀動脈內皮功能的影響，為DCD供心的臨床可行性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物雌雄不限的健康家豬18頭，體質量為25～30 kg，由瑞典隆德大學醫(yī)院實驗中心提供。本實驗通過了隆德大學實驗動物倫理委員會批準，在隆德大學心胸外科實驗室完成。

1.2藥品和溶液Krebs-Ringer緩沖液(含NaCl 119 mmol/L，NaHCO315 mmol/L，KCl 4.6 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl21.5mmol/L，葡萄糖11 mmol/L)；高K+的Krebs-Ringer緩沖液(含KCl 127mmol/L，NaHCO315 mmol/L，KCl 4.6 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L)；血栓烷A2受體激動劑U-46619；P物質；罌粟堿。

1.3主要儀器7E型Grass polygraph及FT03D型張力傳感器(美國Grass Instrument公司)；手術顯微鏡(德國Zeiss公司)；手術器械。

1.4實驗方法

1.4.1實驗分組 按照隨機數表法將18頭豬隨機分為3組，對照組、DCD 30 min組、DCD 40 min組，每組6頭。

1.4.2冠狀動脈切取 麻醉后，將氣管切開進行氣管插管，機械通氣，吸入氧濃度50%，頻率20次/min，潮氣量250～300 ml，呼氣末正壓5 cm H2O。游離一側頸內動靜脈，穿刺置管行血壓監(jiān)測及建立靜脈通路。正中開胸，打開心包，充分暴露心臟，全身肝素化。對照組直接切取帶周圍組織的冠狀動脈后放入4 ℃ Krebs-Ringer緩沖液中，立即在顯微鏡下分離冠狀動脈并行器官浴槽實驗。DCD 30 min組和DCD 40 min組行下腔靜脈插管，排空血液后不做任何操作，待30 min和40 min后分別切取帶周圍組織的冠狀動脈放入4 ℃ Krebs-Ringer緩沖液中，并立即使用同樣的方法分離冠狀動脈進行器官浴槽實驗。

1.4.3冠狀動脈環(huán)的制作 各組均應用手術顯微鏡及顯微器械，遵循無創(chuàng)分離的原則，游離冠狀動脈前降支遠端1/3血管(外徑1.0～1.5 mm)，截成2～3 mm的血管環(huán)。

1.4.4冠狀動脈功能測定 ①器官浴槽的容積為5 ml，內盛有37.0 ℃的Krebs-Ringer緩沖液，持續(xù)通以體積分數95%的O2和體積分數5%包含CO2的混合氣體，維持Krebs-Ringer緩沖液的pH在7.4左右。浴槽周圍空腔持續(xù)循環(huán)37.0 ℃恒溫水浴鍋加熱的蒸餾水以維持系統(tǒng)恒溫。浴槽內的溶液每15 min更換1次。②將血管環(huán)懸掛于浴槽內的兩個L型金屬掛鉤上，一端連接7E型Grass polygraph與張力傳感器在電腦上記錄數據，另一端可反復移動調節(jié)冠狀動脈環(huán)位置以調節(jié)其張力維持在基礎張力。③待血管張力穩(wěn)定后，先以高K+Krebs-Ringer緩沖液置換浴槽內液體，待收縮達峰值后，用Krebs-Ringer緩沖液洗滌血管環(huán)到基礎張力。重復上述步驟1次。待血管環(huán)基礎張力穩(wěn)定后，向浴槽內加入50 μl濃度為5.7×10-7mol/L的U-46619誘導血管環(huán)預收縮，待收縮達到平臺期后，用Krebs-Ringer緩沖液換洗浴槽內的液體，至血管環(huán)恢復基礎張力。再次加入同劑量、同濃度的U-46619誘導第2次收縮，記錄穩(wěn)定時的張力值，即預收縮值。④當血管環(huán)收縮達預收縮值并穩(wěn)定后，依次加入50 μl濃度從10-10～10-4mol/L梯度遞增的P物質誘導EDR。觀察并記算各濃度下P物質誘導舒張值占預收縮值百分比、EDRmax、pEC50。最后加入50 μl的罌粟堿(10-4mmol/L)誘導完全舒張。

2 結果

2.1冠狀動脈環(huán)內徑基礎張力下，對照組、熱缺血30 min組和熱缺血40 min組冠狀動脈內徑分別是(1.37±0.08)、(1.43±0.07)、(1.35 ±0.12)mm，3組冠狀動脈內徑比較，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.837，P>0.05)。

2.2EDR3組EDRmax以及pEC50比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組EDRmax、pEC50比較

3 討論

近年來，可用于移植的器官數量相對穩(wěn)定而等待移植患者數量的持續(xù)增加使DCD供體可行性成為新的研究熱點[6]。相關實驗研究對DCD供心可行性給出了肯定的答案，但是心臟耐受熱缺血時間的上限仍無定論[7-10]。Dhital等[7]成功地使用DCD供心完成3例移植手術，供體熱缺血時間分別為28、25、22 min，術后心功能恢復正常；Iyer等[8]對DCD供心體外灌注保存液，觀察到熱缺血時間30 min的供心功能可完全恢復，熱缺血時間40 min的供心功能部分恢復；Osaki等[9]證實熱缺血時間低于40 min的DCD供心具有和腦死亡供心一樣的恢復潛能。這些實驗研究都給DCD供心的臨床使用可能性提供了依據。

DCD供心的損傷主要來自于熱缺血，在器官獲取時不可避免的熱缺血過程對供心損傷的程度及損傷能否被修復等方面的擔憂是阻礙DCD供體應用的原因[10]。暴露在熱缺血過程中的心臟由于缺氧、低灌注及能量代謝紊亂等，可對心肌功能和冠狀動脈內皮功能產生損傷。在器官移植及移植后一段時期內，血管內皮功能對移植物的存活和功能恢復起決定性的作用[11]。通過浴槽實驗測定EDR可以實現對冠狀動脈內皮功能的評估。本研究通過失血法建立DCD模型，3組EDRmax以及pEC50比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示熱缺血30 min和40 min對循環(huán)死亡豬心冠狀動脈內皮細胞功能無明顯影響。

DCD實驗模型常用失血法或缺氧法建立，并且兩種模型均可用來研究DCD供心熱缺血過程的功能損傷。雖然缺氧法模擬臨床情況，但是由于實驗動物對缺氧的耐受能力不同，缺氧法誘導循環(huán)停止的時間會有所差異，可導致心臟的損傷程度不同，實驗變量無法得到控制，而失血法誘導的循環(huán)停止供體采用迅速排空血液的方法，使心臟不經歷負荷超載相關的損傷，所以對移植后心功能的恢復更有利，但是目前臨床接受度不高。另外，本研究僅關注了冠狀動脈內皮的功能，未關注熱缺血是否導致心肌功能的損傷，需開展進一步相關的研究。

由于豬心的解剖結構和生理功能與人具有很大的相似性，所以本研究所得結果對于DCD供心的臨床使用具有一定的指導意義。DCD供心的臨床推廣不僅需要新技術如體外灌注技術的發(fā)展，還要協(xié)同心肌保護技術和移植后藥物治療等的進一步研究。

綜上，熱缺血30 min及40 min對豬心冠狀動脈內皮功能無明顯損傷，對循環(huán)停止供體心臟的使用提供了相應的實驗依據。

[1] Ali A A,White P,Xiang B,et al.Hearts From DCD Donors Display Acceptable Biventricular Function After Heart Transplantation in Pigs[J].Am J Transplant,2011,11(8):1621-1632.

[2] Tolboom H,Makhro A,Rosser B A,et al.Recovery of donor hearts after circulatory death with normothermic extracorporeal machine perfusion[J].Eur J Cardiothorac Surg,2015,47(1):173-179.

[3] Summers D M,Watson C J,Pettigrew G J,et al.Kidney donation after circulatory death (DCD): state of the art[J].Kidney Int,2015,88(2):241-249.

[4] Schlegel A,de Rougemont O,Graf R,et al.Protective mechanisms of end-ischemic cold machine perfusion in DCD liver grafts[J].J Hepatol,2013,58(2):278-286.

[5] Dhanani S,Hornby L,Ward R,et al.Variability in the determination of death after cardiac arrest: a review of guidelines and statements[J].J Intensive Care Med,2012,27(4):238-252.

[6] Bendorf A,Kelly P J,Kerridge I H,et al.An international comparison of the effect of policy shifts to organ donation following cardiocirculatory death (DCD) on donation rates after brain death (DBD) and transplantation rates[J].PLoS One,2013,8(5):e62010.

[7] Dhital K K,Iyer A,Connellan M,et al.Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series[J].Lancet,2015,385(9987):2585-2591.

[8] Iyer A,Gao L,Doyle A,et al.Normothermic ex vivo perfusion provides superior organ preservation and enables viability assessment of hearts from DCD donors[J].Am J Transplant,2015,15(2):371-380.

[9] Osaki S,Locher M R,Lushaj E B,et al.Functional evaluation of human donation after cardiac death donor hearts using a continuous isolated myocardial perfusion technique: Potential for expansion of the cardiac donor population[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2014,148(3):1123-1130.

[10] Bernat J L,Capron A M,Bleck T P,et al.The circulatory-respiratory determination of death in organ donation[J].Crit Care Med,2010,38(3):963-970.

[11] Christie J D,Edwards L B,Kucheryavaya A Y,et al.The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: twenty-eighth adult lung and heart-lung transplant report-2011[J].J Heart Lung Transplant,2011,30(10):1104-1122.

Effectsofdifferentwarmischemiatimeoncoronaryendothelialfunctionofdonorheartsaftercirculatorydeathinpigs

Su Yang1, Qin Guangqi2, Liao Qiuming2, Stig Steen2, Qiao Chenhui1

(1.DepartmentofCardiacSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China; 2.DepartmentofCardiothoracicSurgery,LundUniversityHospital, 22594,Sweden)

ObjectiveTo investigate the effects of different warm ischemia time on coronary endothelial function of donor hearts after circulatory death in pigs.MethodsEighteen healthy swedish domestic pigs were randomized into control group, warm ischemia 30 min group, and warm ischemia 40 min group. In the control group, the coronary artery was harvested immediately after sternotomy and pericardiotory. The DCD model was induced by rapid exsanguination and left in situ for 30min in the warm ischemia 30 min group, 40min in the warm ischemia 40 min group. Then endothelium-dependent relaxation of the left anterior descending coronary arteries in the three groups was investigated in organ bath.ResultsThe ratio of maximal EDR to the maximal contraction in control group, warm ischemia 30min group and warm ischemia 40 min group were (95.72±0.95)%, (95.09±0.85)% and (94.41±1.06)%, respectively(P>0.05). The negative logarithm of negative logarithm of half effect concentration (pEC50) were (6.53± 0.07)%, (6.43±0.02)% and (6.38±0.04)%, respectively(P>0.05).ConclusionUnder the circumstances of this experiment, there was no coronary EDR caused by either 30 minutes or 40 minutes warm ischemia injury.

donation after circulatory death; warm ischemia time; endothelial cell; heart transplantation

喬晨暉，E-mail：qchenhui@hotmail.com。

R 654.1

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.22.002

2017-05-09)