楊佳敏，沈小雨，張玲，羅麗，許詠思，任曉暄，郭孟瑋，趙雅芳，申松希，朱世鵬，齊丹丹，嵇波，李曉泓，朱江，張露芬*

(1.北京勞動保障職業(yè)學院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,北京 100029)

針灸經(jīng)絡(luò)

針刺不同穴位對寒凝證類痛經(jīng)大鼠子宮收縮程度及疼痛相關(guān)機制的影響

楊佳敏1，沈小雨2，張玲2，羅麗2，許詠思2，任曉暄2，郭孟瑋2，趙雅芳2，申松希2，朱世鵬2，齊丹丹2，嵇波2，李曉泓2，朱江2，張露芬2*

(1.北京勞動保障職業(yè)學院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,北京 100029)

目的：比較針刺三陰交穴、關(guān)元穴對寒凝證類痛經(jīng)大鼠子宮平滑肌收縮程度及脊髓、子宮組織中κ-受體、μ-受體含量的影響，探討不同穴位介入的效應(yīng)差異及部分機制。方法：將64只雌性SD大鼠隨機分為鹽水組、寒凝證類痛經(jīng)模型組、針刺三陰交組、針刺關(guān)元組，每組16只。采用皮下注射苯甲酸雌二醇和低溫冷凍的方法制備寒凝證類痛經(jīng)模型，末次給藥1 h后，麻醉大鼠，運用BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)記錄子宮的收縮程度。采用Real Time-PCR檢測大鼠脊髓及子宮組織中κ-受體、μ-受體的含量。結(jié)果：1.子宮平滑肌收縮程度：與鹽水組比較，模型組子宮收縮波的個數(shù)顯著增加(P<0.01)、子宮收縮波峰峰值顯著升高(P<0.05)、子宮活動度顯著增強(P<0.01)，三陰交組、關(guān)元組子宮活動度顯著增強(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，三陰交組與關(guān)元組子宮收縮波的個數(shù)及子宮活動度均顯著下降(P<0.05)。2.脊髓及子宮組織中κ-受體、μ-受體水平：(1)脊髓中的κ-受體及μ-受體水平：各組間比較無統(tǒng)計學差異；(2)子宮組織中的κ-受體水平：各組間比較無統(tǒng)計學差異；(3)子宮組織中μ-受體水平：與鹽水組比較，關(guān)元組子宮組織中μ-受體水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，三陰交組、關(guān)元組子宮組織中μ-受體水平均顯著升高(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：針刺三陰交穴、關(guān)元穴均可降低子宮收縮波個數(shù)和子宮活動度，抑制子宮平滑肌的異常收縮反應(yīng)。分析其效應(yīng)的部分機制是通過調(diào)節(jié)子宮靶器官組織的阿片肽受體水平，進而達到針刺鎮(zhèn)痛的作用。

寒凝證類痛經(jīng)模型；子宮收縮程度；κ受體；μ受體；三陰交穴；關(guān)元穴

原發(fā)性痛經(jīng)是婦科常見疾病，以經(jīng)期或行經(jīng)前后周期性小腹疼痛或痛引腰骶為主要癥狀，具有較高的臨床發(fā)病率。原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病主要是子宮平滑肌的收縮痙攣，局部缺血缺氧引起疼痛，既往很多研究證實了針刺的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，且不同經(jīng)穴效應(yīng)之間存在一定的差異，本研究擬觀察針刺不同經(jīng)穴對寒凝證類痛經(jīng)模型大鼠子宮平滑肌收縮程度及疼痛相關(guān)物質(zhì)的影響，探討經(jīng)穴間的效應(yīng)差異及其作用機制，以期為指導臨床選穴提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康Sprague-Dawley(SD)品系雌性大鼠，3月齡，64只，性成熟未交配，體質(zhì)量(240±20)g，由北京軍事醫(yī)學科學研究院提供，合格證號,SCXK2007-004(軍)。動物置于清潔柜中，喂以大鼠普通飼料，自由飲水，實驗室溫度保持在(23±1)℃，濕度(45±5)%，標準的12 h晝夜交替(每日早上8點開燈)。實驗在白天進行，實驗開始前，動物至少適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本動物實驗過程均遵守美國國立衛(wèi)生院倡導的實驗動物關(guān)懷、使用指導原則，及以減少、替代和優(yōu)化為核心的動物實驗“3R”原則。

1.2 主要試劑

苯甲酸雌二醇注射液(寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號：120207)；縮宮素注射液(上海禾豐制藥廠生產(chǎn)，批號：120302)；自制美蘭染色液；氨基甲酸乙酯(批號T20080530)；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(美國應(yīng)用生物公司，批號：0604226)；瓊脂糖(西班牙Biowest公司，批號：051363)。

1.3 主要實驗儀器

BC/BD-379HB臥式冰柜(青島海爾集團)；BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限責任公司)；FT-100 型張力換能器(成都泰盟科技有限責任公司)；MDF-u50A型超低溫冰箱(日本三洋公司)；PRISM 7700型熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物公司)；DYCP-31D型瓊脂糖水平電泳槽(北京市六一儀器廠)；Image master VDS掃描儀(瑞典Pharmacia Biotech 公司)。

1.4 動物分組

通過陰道涂片法，即每日定時用細棉簽蘸以等滲鹽水，濕潤后輕輕插入大鼠陰道約0.5 cm，稍微轉(zhuǎn)動后取出，將帶有陰道內(nèi)容物的棉簽在載玻片上均勻轉(zhuǎn)動后涂片，在顯微鏡下觀察陰道涂片的組織學變化，根據(jù)細胞形態(tài)、種類及數(shù)量篩選出處于動情間期的大鼠64只。按照隨機數(shù)字表法分為鹽水組、寒凝證類痛經(jīng)模型組、針刺三陰交組、針刺關(guān)元組，每組16只。

1.5 模型的制備

將陰道涂片法篩選的處于動情間期的大鼠，除鹽水組外，其余各組大鼠均皮下注射苯甲酸雌二醇，連續(xù)10天，于第1天及第10天皮下注射0.5 mg/只，于第2～9天皮下注射0.2 mg/只，末次給藥1 h后，腹腔注射縮宮素2 U/只。造模第1～5天，將大鼠放入-25℃的冰柜中，持續(xù)受凍4 h左右，中間間隔2 h，開蓋通氣5 s。待大鼠出現(xiàn)寒顫停止，畏寒喜暖，蜷縮少動，朦朧欲睡，反應(yīng)遲鈍，呼吸微弱，毛發(fā)蓬松、豎立、無光澤，小便色淡，大便濕爛，耳色暗紅，爪甲及尾部紫暗、腫脹等癥狀和體征時，將大鼠取出冰柜。鹽水組每日注射同等劑量的生理鹽水，不冷凍。

1.6 取穴[1]

三陰交穴：后肢內(nèi)踝尖直上10 mm處；關(guān)元穴：大鼠臍下約25 mm。

1.7 針刺方法

手針操作，使用0.25 mm×40 mm的一次性無菌針灸針(中研太和牌，無錫，中國)。針刺三陰交組直刺入三陰交穴4 mm～5 mm，針刺關(guān)元組直刺入關(guān)元穴4 mm～5 mm，針刺即刻及針刺10 min時行平補平瀉的捻轉(zhuǎn)手法30 s，留針20 min后取針。模型組和鹽水組不予針刺處理。

1.8 子宮收縮程度的檢測

于造模第10天，注射苯甲酸雌二醇后，肌肉注射20%氨基甲酸乙脂溶液麻醉大鼠，手術(shù)切開腹部，尋找“Y”型子宮，在一側(cè)子宮，于子宮角分叉上1 cm處將鉤橫穿子宮肌層，線的另一端連接于張力傳感器上，加0.1 g負荷，采用BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)記錄子宮的收縮程度，首先記錄其在5 min內(nèi)的基礎(chǔ)波形，然后將縮宮素滴在子宮上，標記這一時間點，10 min后，施以平補平瀉的捻轉(zhuǎn)手法30 s，標記此時間點，再留針10 min，標記時間點，取針，停止記錄。記錄子宮收縮波個數(shù)、子宮收縮波峰峰值以及子宮活動度(子宮收縮波個數(shù)×峰峰值)。

1.9 Real Time-PCR檢測脊髓及子宮中κ-受體、μ-受體

本實驗采用去冠法處死大鼠，在冰盤上迅速取下大鼠的子宮及脊髓(剝離周圍附屬組織)，經(jīng)液氮迅速降溫后移至超低溫冰箱中保存待測。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的κ阿片受體、μ阿片受體基因序列，以Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成(κ受體引物上游5′-CTGACGCTGATTTGGGAAGG-3′，下游5′-AGCACTGGGAGCACAGGTAG-3′，產(chǎn)物長度151 bp；μ受體引物上游5′-GAACATCCCTCCACGGCTAA-3′，下游5′-TGCACGCGATTTCAAAGACC-3′，產(chǎn)物長度177 bp；內(nèi)參β-actin上游5′-AATCGTGCGTGACATTAAAGAG-3′，下游5′-CATTGCCGATAGTGATGACCT-3′，產(chǎn)物長度137 bp)。在ABI的PRISM 7700型熒光定量PCR儀進行實時定量PCR反應(yīng)，按以下反應(yīng)體系進行：20 μL PCR反應(yīng)體系中含2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL。擴增條件為95℃ 3 min變性，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min；共40個循環(huán)，最后是72℃ 7 min延伸。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)測得的樣品CT值，以2-△△CT表示目的基因的相對值。

1.10 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析，若各組均正態(tài)且方差齊，采用One-Way ANOVA分析，繼以LSD進行多組間比較；若各組均正態(tài)而方差不齊，采用Welch檢驗；若各組不服從正態(tài)性檢驗，則采用非參數(shù)檢驗，繼以兩兩組間比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。

2 結(jié)果

2.1 針刺不同穴位對寒凝證類痛經(jīng)模型大鼠子宮收縮程度的影響

2.1.1 各組間子宮收縮波個數(shù)的比較

與鹽水組比較，模型組收縮波個數(shù)顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，三陰交組及關(guān)元組收縮波個數(shù)均顯著下降(P<0.05),見表1。

2.1.2 各組間子宮收縮波幅度的比較

與鹽水組比較，模型組子宮收縮波變化幅度(峰峰值)顯著升高(P<0.05),見表1。

2.1.3 各組間子宮活動度的比較

與鹽水組比較，模型組、三陰交組、關(guān)元組子宮活動度(收縮波個數(shù)×峰峰值)均顯著增加(P<0.01，P<0.05)，與模型組比較，三陰交組、關(guān)元組子宮活動度均顯著下降(P<0.05),見表1。

表1 針刺不同穴位對寒凝證類痛經(jīng)大鼠模型子宮收縮程度的影響

注：與鹽水組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05

2.2 針刺不同穴位對寒凝證類痛經(jīng)模型大鼠脊髓及子宮組織中κ-受體、μ-受體水平的影響

2.2.1 各組間脊髓組織中κ-受體、μ-受體水平的比較

各組間比較，脊髓組織中κ-受體、μ-受體水平均無顯著性差異,見表2。

表2 針刺不同穴位對寒凝證類痛經(jīng)大鼠脊髓組織中κ-受體、μ-受體水平的影響

2.2.2 各組間子宮組織中κ-受體水平的比較

各組間比較，子宮組織中κ-受體水平無顯著性差異,見表3。

2.2.3 各組間子宮組織中μ-受體水平的比較

與鹽水組比較，關(guān)元組子宮中μ-受體水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，三陰交組、關(guān)元組子宮組織中μ-受體水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，見表3。

表3 針刺不同穴位對寒凝證類痛經(jīng)大鼠子宮組織中κ-受體、μ-受體水平的影響

注：與鹽水組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

3 討論

本研究采用低溫冰柜冷凍的方法制備寒凝證動物模型，在此基礎(chǔ)上基于苯甲酸雌二醇可以增強子宮活動度，提高子宮平滑肌對縮宮素的敏感性，而縮宮素可使子宮平滑肌收縮，引起疼痛，從而運用苯甲酸雌二醇和縮宮素聯(lián)合的方法來制備類痛經(jīng)大鼠模型，符合人類原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病機制，本研究對寒凝證動物模型制備方法進行中醫(yī)證型的綜合評價后，將寒凝證模型制備方法與類痛經(jīng)模型制備方法相結(jié)合制備寒凝證類痛經(jīng)大鼠模型。[2-7]

中醫(yī)學認為，穴位乃是“神氣之所游行出入”之處，它外絡(luò)肢節(jié)，內(nèi)屬臟腑，是人體臟腑、經(jīng)絡(luò)之氣輸注于體表的部位。穴位作為一個感受裝置，在針刺作用下，通過相應(yīng)的神經(jīng)通路，引起各種相應(yīng)的機能活動，同時穴位又作為一個效應(yīng)裝置，在神經(jīng)、體液或內(nèi)臟活動的影響下，表現(xiàn)出某些機能或理化特性，即經(jīng)穴-臟腑相關(guān)性[8]。卜彥青等[9]對近十年關(guān)于針灸治療原發(fā)性痛經(jīng)的穴位使用頻次進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)使用頻次最多的前十位依次是三陰交、關(guān)元、足三里、氣海、中極、地機、太沖、次髎、腎俞、血海。故本研究選取臨床治療原發(fā)性痛經(jīng)最常用的兩個穴位-三陰交穴和關(guān)元穴，并通過檢測子宮平滑肌的收縮程度，脊髓和子宮組織中κ-受體、μ-受體的水平，觀察不同經(jīng)脈的腧穴效應(yīng)是否存在差異，進而探討產(chǎn)生其效應(yīng)的部分生物學機制。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠子宮平滑肌收縮波的個數(shù)、子宮收縮變化幅度以及子宮活動度均顯著增加，證明寒凝證類痛經(jīng)模型大鼠子宮平滑肌收縮紊亂，而針刺三陰交穴、關(guān)元穴均可明顯抑制寒凝證類痛經(jīng)模型大鼠的子宮平滑肌痙攣性收縮。研究結(jié)果顯示三陰交穴、關(guān)元穴均具有對大鼠子宮平滑肌的調(diào)節(jié)效應(yīng)，進而達到止痛的作用。

相關(guān)研究報道證實阿片肽及其受體不僅廣泛的分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦、脊髓)中，在外周組織中也有分布，大鼠子宮平滑肌上分布著μ、δ受體，而以前者為主。外源性阿片類物質(zhì)對子宮平滑肌的影響隨性周期而變化，嗎啡對妊娠子宮平滑肌收縮無影響，而高于臨床用藥劑量時，阿片類藥物可直接作用于子宮平滑肌，抑制平滑肌的收縮[10]。

本研究采用低溫冷凍的方法及藥物制備寒凝證類痛經(jīng)大鼠模型，首先，苯甲酸雌二醇及縮宮素的刺激可引起子宮局部的炎癥反應(yīng)；其次，大鼠受到寒冷的刺激，使炎癥局部釋放β-內(nèi)啡肽，作用于局部組織的μ受體，因此局部靶器官保護性應(yīng)激反應(yīng)明顯，針刺介入后進一步大量激活局部靶器官組織中的鎮(zhèn)痛物質(zhì)而發(fā)揮止痛作用，因此局部組織中μ-受體水平的變化，更直觀證實了針刺的調(diào)節(jié)效應(yīng)。

本實驗結(jié)果顯示針刺三陰交穴、關(guān)元穴均使子宮中μ-受體水平顯著升高，而κ-受體水平未見明顯變化，說明針刺可激活μ阿片受體，與內(nèi)源性阿片肽結(jié)合。因此，μ阿片肽受體在子宮中有顯著變化，而在中樞中未見明顯變化，可能與針刺的時間效應(yīng)有一定的關(guān)系，今后的研究中有待進一步觀察。

綜上所述，針刺三陰交穴、關(guān)元穴后，可緩解寒凝證類痛經(jīng)模型大鼠的子宮平滑肌的異常收縮狀態(tài)，其效應(yīng)機制是通過調(diào)節(jié)子宮靶器官組織的阿片肽受體水平，進而達到針刺鎮(zhèn)痛的作用。

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EffectandtheMechanismofAcupunctureatDifferentAcupointsfortheUterusContractionsinDysmenorrheaRatswithColdCongealing

YANG Jia-min1, SHEN Xiao-yu2, ZHANG Ling2, LUO Li2, XU Yong-si2, REN Xiao-xuan2, GUO Meng-wei2, ZHAO Ya-fang2, SHEN Song-xi2, ZHU Shi-peng2, QI Dan-dan2, JI bo2, LI Xiao-hong2, ZHU Jiang2, ZHANG Lu-fen2

(1.BeijingVocationalCollegeofLabourandSocialSecurity,Beijing100029,China;2.CollegeofAcupunctureandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective: To compare the different effect of needling SP6 and CV4 on dysmenorrhea rats of cold congealing type, by observing the uterus contraction level, and the changes of κ opioid receptor and μ opioid receptor in the spinal cord and uterus tissues. Methods: 64 female SD rats were randomly divided into the saline control group, the model group, SP6 group (needling acupoint SP6), and CV4 group(needling acupoint CV4), with 16 rats in each group. The models were established by subcutaneously injecting Estradiol Benzoate and being exposed to freezing environment. One hour later after the injection of Estradiol Benzoate on the 10th day, 0.7 ml/100 g Urethane was given by intramuscular injection for anesthesia. BL-420F was used to record the uterus contraction. Real Time - PCR was applied to test the amount of κ opioid receptor and μ opioid receptor in the spinal cord and uterus tissues. Results: In terms of uterine contraction: compared to saline control group, the amount of the uterine contraction waves, peak wave values, and uterine activities were increased significantly in the model group, group SP6, and group CV4(P<0.05 orP<0.01); in which the needling groups improved significantly compared to the model group(P<0.05 orP<0.01). In terms of the changes of κ opioid receptor and μ opioid receptor, there was no significant difference on κ and μ opioid receptors in the spinal cord among the four groups; There was no significant difference on the κ opioid receptor in the uterus among the groups; compared to the saline control group, μ opioid receptor in the uterus increased significantly in group CV4 (P<0.05); compared to the model group, μ opioid receptor in the uterus increased significantly in both group SP6 and group CV4(P<0.05 orP<0.01). Conclusion: Needling on SP6 and CV4 can both reduce the amount of uterus contraction waves and contraction degree to alleviate abnormal uterus contraction. The mechanism may be achieved by regulating the endogenous opioid receptor in uterus tissues.

Dysmenorrhea model of cold congealing type; Uterus contraction degree; κ opioid receptor; μ opioid receptor; SP6; CV4

R245.2;R271.11+3

A

1002-2392(2017)06-0073-04

2017-03-08

2017-07-10

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2012CB518506)；國家中醫(yī)藥管理局針灸生物學三級實驗室

楊佳敏(1987-)，女，博士研究生，研究方向：針灸的神經(jīng)生物學機制研究。

*通訊作者：張露芬(1953-)，女，教授，博士研究生導師，研究方向：針灸的神經(jīng)生物學機制研究。