徐佳莉 劉 斌 胡馨月 董亞楠 崔 穎

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河北 唐山 063000

·論著科研之窗·

N- 乙酰半胱氨酸對(duì)帕金森病模型大鼠黑質(zhì)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

徐佳莉 劉 斌△胡馨月 董亞楠 崔 穎

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河北 唐山 063000

目的觀(guān)察抗氧化劑N- 乙酰半胱氨酸(N- acetylcysteine，NAC)對(duì)帕金森病(Parkinson's disease，PD)模型大鼠黑質(zhì)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響。方法36只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、帕金森病模型組(PD組)和抗氧化劑NAC組(NAC組)，每組又分為模型制備成功后4 d和8 d兩個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。采用頸背部皮下注射魚(yú)藤酮制作帕金森病大鼠模型，微量酶標(biāo)法檢測(cè)大鼠黑質(zhì)谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH- Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量。結(jié)果(1)與sham組相比，PD組各時(shí)間點(diǎn)大鼠黑質(zhì)中GSH、GSH- Px、SOD含量降低(均P<0.01)，8 d組低于4 d組(均P<0.05)；與PD組相比，NAC組大鼠黑質(zhì)中GSH、GSH- Px、SOD含量增多(均P<0.01)，8 d組高于4 d組(均P<0.05)。(2)與sham組相比，PD組大鼠黑質(zhì)中MDA含量增多(均P<0.01)，8 d組高于4 d組(P<0.05)；與PD組相比，NAC組大鼠黑質(zhì)中MDA含量降低(均P<0.01)，8 d組低于4 d組(P<0.05)。結(jié)論N- 乙酰半胱氨酸可減輕帕金森病模型大鼠的氧化應(yīng)激損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

帕金森?。籒- 乙酰半胱氨酸；氧化應(yīng)激；谷胱甘肽；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶；超氧化物歧化酶；丙二醛；黑質(zhì)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性退變和路易小體形成為主要病理特征的一種常見(jiàn)于中老年人的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，目前帕金森病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但有證據(jù)顯示氧化應(yīng)激在PD的發(fā)病中起關(guān)鍵作用[2- 3]，所以針對(duì)PD抗氧化治療的研究越來(lái)越受重視。N- 乙酰半胱氨酸(N- acetylcysteine，NAC)是一種含巰基的硫醇類(lèi)復(fù)合物，為臨床常用的祛痰劑，還用于對(duì)急性乙酰氨基酚中毒的解毒治療。隨著對(duì)該藥認(rèn)識(shí)的不斷深入，發(fā)現(xiàn) NAC是一種新型的氧自由基清除劑，具有抗氧化清除氧自由基，抗細(xì)胞凋亡等作用[4- 5]。本研究采用頸背部皮下注射魚(yú)藤酮制備帕金森病模型大鼠，觀(guān)察帕金森病模型大鼠黑質(zhì)中谷胱甘肽(glutathione，GSH)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH- PX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量的變化及N- 乙酰半胱氨酸對(duì)其變化的影響，探討N- 乙酰半胱氨酸對(duì)帕金森病的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康雄性Sprague- Dawley(SD)大鼠36只，鼠齡3～4個(gè)月，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2015- 0038。在華北理工大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室自由進(jìn)食喂養(yǎng)，室溫(23±2)℃，相對(duì)濕度45%～55%，每日光照12 h，飼養(yǎng)2周熟悉環(huán)境后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、帕金森病模型組(PD組)和抗氧化劑NAC組(NAC組)，每組又分為模型制備成功后4 d和8 d兩個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。

1．2主要試劑及儀器魚(yú)藤酮、葵花油購(gòu)于北京博奧森生物工程有限公司。NAC購(gòu)于日本MBL公司。谷胱甘肽、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶及丙二醛試劑盒購(gòu)于南京建成科技股份有限公司。腦立體定位儀購(gòu)于日本Narishige公司。NANODROP 2000超微量分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1．3帕金森病模型制備采用頸背部皮下注射魚(yú)藤酮制備帕金森病大鼠模型[6]。魚(yú)藤酮以葵花油配制成2 mg/mL的乳液，充分震蕩混勻后避光保存，PD組及NAC組大鼠稱(chēng)體質(zhì)量后每只大鼠每日給予魚(yú)藤酮2 mg/kg頸背部皮下注射，假手術(shù)組每日頸背部皮下注射等量葵花油，待模型制備成功后停止注射。以出現(xiàn)行為學(xué)改變作為判定模型成功的指標(biāo)[7]，選擇得分2～6分者作為實(shí)驗(yàn)大鼠。

1．4給藥方法NAC組，待模型制備成功后，麻醉大鼠，將大鼠俯臥位固定于立體定位儀上，切開(kāi)頭皮，分離皮下組織，蘸少量3%雙氧水擦試顱骨以充分暴露前囟的“十字交叉”骨性結(jié)構(gòu)。側(cè)腦室立體定位：以前囟點(diǎn)為中心，旁開(kāi)1.5 mm，向后囟方向0.8 mm，用20 mL注射器針頭緩慢鈍性鉆孔，有明顯穿透感后拔出。用已固定好位置的裝有NAC 5 μL的微量進(jìn)樣器緩慢注射，進(jìn)針深度達(dá)3.5 mm，在5 min內(nèi)勻速緩慢注完，留針5 min后緩慢拔針。假手術(shù)組和PD組大鼠進(jìn)行側(cè)腦室注射生理鹽水5 μL。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素8萬(wàn)U/d預(yù)防感染。

1．5微量酶標(biāo)法用10%水合氯醛(0.3 mL/100g)對(duì)大鼠進(jìn)行深度麻醉，快速斷頭取腦，在冰臺(tái)上分離出新鮮黑質(zhì)，用4 ℃ PBS沖洗除去殘余血液，在干冰上用濾紙拭干，立即置于-80 ℃超低溫冰箱。取組織塊用4 ℃預(yù)冷的PBS漂洗，除去血液，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱(chēng)質(zhì)量，放入到冰上的15 mL的離心管內(nèi)，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，按重量(g)：體積(mL)=1：9的比例，加入4 ℃預(yù)冷的生理鹽水，組織勻漿器充分勻漿，3 000 r/min，4 ℃離心15 min，將離心好的勻漿取上清棄下面沉淀。谷胱甘肽、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶及丙二醛測(cè)定的具體操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

與sham組相比，PD組各時(shí)間點(diǎn)大鼠黑質(zhì)中GSH、GSH- Px、SOD含量降低(均P<0.01)，8 d組低于4 d組(均P<0.05)；與PD組相比，NAC組大鼠黑質(zhì)中GSH、GSH- Px、SOD含量增多(均P<0.01)，8 d組高于4 d組(均P<0.05)。與sham組相比，PD組大鼠黑質(zhì)中MDA含量增多(均P<0.01)，8 d組高于4 d組(P<0.05)；與PD組相比，NAC組大鼠黑質(zhì)中MDA含量降低(均P<0.01)，8 d組低于4 d組(P<0.05)。見(jiàn)表1、2和圖1、2。

表1 各組大鼠黑質(zhì)GSH、GSH- Px檢測(cè)結(jié)果

注：與sham組比較，＊P<0.01；與PD組比較，△P<0.01；與4 d亞組比較，☆P<0.05，☆☆P<0.01

圖1 各組大鼠黑質(zhì)GSH、GSH- Px檢測(cè)結(jié)果

組別SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)4d8d4d8dSham組402786±34732376195±312474559±07854963±0745PD組259284±26967＊247923±15260＊☆8498±1243＊9913±0655＊☆NAC組282905±21414△305788±18818△☆6514±0640△6226±1051△☆F32581381922775061761P值0000000000000000

注：與Sham組比較，＊P<0.01；與PD組比較，△P<0.01；與4 d亞組比較，☆P<0.05，☆☆P<0.01

圖2 各組大鼠黑質(zhì)SOD、MDA檢測(cè)結(jié)果

3 討論

氧化應(yīng)激是體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧族超過(guò)了內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的一種失平衡狀態(tài)[8]，過(guò)多的氧自由基和過(guò)氧化合物超過(guò)了機(jī)體自身的抗氧化能力，導(dǎo)致了蛋白及脂質(zhì)的氧化損傷及細(xì)胞損傷。研究表明，氧化應(yīng)激在PD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9- 10]。谷胱甘肽(GSH)是機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)最主要的成員，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH- PX)是在抗氧化防御系統(tǒng)中起重要作用的一類(lèi)功能蛋白質(zhì)，它能夠清除多種過(guò)氧化物并保護(hù)組織細(xì)胞免受過(guò)氧化損傷[11- 12]。超氧化物歧化酶(SOD)是一類(lèi)能夠?qū)⒊蹶庪x子催化為過(guò)氧化氫和氧氣的金屬結(jié)合酶，是機(jī)體重要的抗氧化酶之一，其活性反映機(jī)體對(duì)氧自由基清除能力的高低[13]。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，也是常用的反映氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)之一，測(cè)定MDA的含量可以間接反映抗氧化酶功能[14]。N- 乙酰半胱氨酸(N- acetylcysteine，NAC)是一種含巰基化合物，它能夠促進(jìn)谷胱甘肽(GSH)的合成，提高組織內(nèi)GSH含量，增強(qiáng)組織的抗自由基能力，是一種強(qiáng)有力的抗氧化劑[15]。基于NAC的抗氧化作用，本實(shí)驗(yàn)選擇NAC作為抗氧化劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PD組大鼠黑質(zhì)中GSH、GSH- Px、SOD表達(dá)降低，且隨時(shí)間延長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，MDA表達(dá)增多，隨時(shí)間延長(zhǎng)有上升趨勢(shì)，說(shuō)明PD模型大鼠的氧化應(yīng)激水平增加，氧化應(yīng)激在PD 的發(fā)病中具有重要作用。與PD組相比，NAC組大鼠黑質(zhì)中GSH、GSH- Px、SOD表達(dá)增多，且隨時(shí)間延長(zhǎng)有上升趨勢(shì)，MDA表達(dá)降低，隨時(shí)間延長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，說(shuō)明N- 乙酰半胱氨酸可減輕帕金森病模型大鼠氧化應(yīng)激損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用。這為臨床上對(duì)PD患者進(jìn)行抗氧化治療提供了理論依據(jù)。

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EffectsofN-acetylcysteineontheoxidativestresscorrelationindexinsubstantianigraofParkinson'sdiseasemodelrats

XUJiali，LIUBin，HUXinyue，DONGYanan，CUIYing

DepartmentofNeurologyFirst，theAffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology，Tangshan063000，China

ObjectiveTo observe the effects of N- acetylcysteine on the oxidative stress correlation index in substantia nigra of Parkinson's disease model rats．Methods36 SD rats were randomly divided into sham- operated group(sham group)，PD model group(PD group) and antioxidant NAC group (NAC group)，Each group was divided into 4 days and 8 days subgroups after the success of model preparation．PD rat model was established by injecting rotenone in subcutaneous．The content of SOD，GSH，GSH- Px and MDA in the substantia nigra were detected by Micro- enzyme．Results(1)Compared with the sham group ，the content of GSH，GSH- Px and SOD in the PD group were significantly reduced (allP<0.01)，and in the 8 d group was lower than that in the 4 d group(allP<0.05)；Compared with the PD group，the content of GSH，GSH- Px and SOD in NAC group was increased (allP<0.05)，and in the 8 d group was higher than that in the 4 d group (allP<0.05)．(2)Compared with the sham group，the content of MDA in the PD group was significantly increased (allP<0.05)，and in the 8 d group was higher than that in the 4 d group (P<0.05)．Conclusionwith the PD group，the content of MDA in NAC group was significantlydecreased (allP<0.05)，and in the 8 d group was lower than that in the 4 d group (P<0.05)．Conclusions N- acetylcysteine can attenuate oxidative stress injury in Parkinson's disease model rats，and has a protective effect on the nerve．

Parkinson's disease；N- acetylcysteine；Oxidative stress；Glutathione；Glutathione peroxidase；Superoxide dismutase；Malonaldehyde；Substantia nigra

10.3969/j.issn.1673- 5110.2017.20.002

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號(hào)：20130064)

△通信作者：劉斌，碩士，主任醫(yī)師，教授，研究生導(dǎo)師。 Email：liubintsh@126.com

R- 332

A

1673- 5110(2017)20- 0006- 04

(收稿2017- 01- 23)

關(guān)慧