劉昌銘 毛連根 楊 粟 江婷婷 陳鐘梁 屠慧惠 陳 靜 胡玉婷 甘 霖 李仲杰 李繼承，

(1 浙江大學(xué)細胞生物學(xué)研究所，杭州，310058； 2 華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州，510006)

基于iTRAQ技術(shù)研究滋陰降火方藥知柏地黃丸對陰虛“上火”SD大鼠血清蛋白組的影響

劉昌銘1毛連根1楊 粟1江婷婷2陳鐘梁1屠慧惠1陳 靜1胡玉婷2甘 霖2李仲杰1李繼承1，2

(1 浙江大學(xué)細胞生物學(xué)研究所，杭州，310058； 2 華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州，510006)

目的：研究知柏地黃丸治療陰虛“上火”的生物學(xué)機制。方法：應(yīng)用iTRAQ-2DLC-MS/MS蛋白組學(xué)技術(shù)檢測陰虛“上火”大鼠在知柏地黃丸治療前后的血清蛋白組學(xué)表達譜，篩選并鑒定與知柏地黃丸治療作用相關(guān)的蛋白質(zhì)群，并應(yīng)用生物信息學(xué)對差異表達的蛋白進行功能富集分析，揭示知柏地黃丸對陰虛“上火”治療作用的生物學(xué)機制。結(jié)果：與正常大鼠比較，陰虛“上火”對照組大鼠血清中有47個差異蛋白，其中有20個表達上調(diào)，27個表達下調(diào)。知柏地黃丸治療后，有19個差異蛋白恢復(fù)至正?；蚪咏Ｋ健Ｍㄟ^生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要集中在免疫反應(yīng)與物質(zhì)代謝過程。其中參與免疫反應(yīng)的蛋白主要有有補體成分4(C4)、凝血因子X(F10)、激酶相關(guān)磷蛋白2(Skap2)；參與代謝作用的蛋白有L乳酸脫氫酶A鏈(Ldha)、果糖二磷酸醛縮酶A(Aldoa)、花生四烯酸脂肪氧合酶(Alox12)、GDP分解酶抑制劑1(Arhgdia)、肌球蛋白輕鏈(Myl6)。結(jié)論：陰虛“上火”主要表現(xiàn)為機體免疫反應(yīng)與物質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，知柏地黃丸可以通過調(diào)節(jié)免疫與物質(zhì)代謝反應(yīng)治療陰虛“上火”。

陰虛“上火”；知柏地黃丸；蛋白組學(xué)；iTRAQ；免疫；代謝

陰虛“上火”常表現(xiàn)為口干舌燥、目干澀痛、心煩等“上火”癥狀，或伴有復(fù)發(fā)性口舌生瘡、牙齦腫痛、咽喉腫脹等黏膜炎性病變，多見于勞損久病或熱病之后而致陰液內(nèi)耗的患者。當(dāng)今社會，隨著生活節(jié)奏的加快以及工作壓力的增加，人們勞神較多，陰津虧損，“陰虛生內(nèi)熱”，從而導(dǎo)致“上火”。陰虛“上火”越來越受到關(guān)注，逐漸成為一個不容忽視的問題。據(jù)報道，目前陰虛“上火”較多的發(fā)生在學(xué)業(yè)或工作壓力大的人群[1]，而且在不斷年輕化，15～34歲年齡段的人群“上火”的比例明顯高于其他年齡段[2]。陰虛“上火”雖然尚未達到疾病的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，但是作為一種亞健康狀態(tài)已經(jīng)影響到人的正常生活狀態(tài)，嚴(yán)重降低生命質(zhì)量。

陰虛“上火”又稱虛火，與實火不同，它是由陰津損耗導(dǎo)致機體不能制陽，引起陽亢的狀態(tài)，因此陰虛“上火”的治療應(yīng)該以滋陰為主。知柏地黃丸是一種滋陰降火的經(jīng)典中藥方劑，由知母、黃柏、熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉八種成分組成[3]。知柏地黃丸處方最早源于明代著名醫(yī)學(xué)家張景岳所著《景岳全書》，治療陰虛“上火”證已有上千年的歷史，不僅在治療陰虛“上火”方面有顯著療效，對于陰虛火旺相關(guān)的甲狀腺功能亢進、腎病綜合征、尿路感染、前列腺炎、更年期綜合征等疾病均有明顯的治療和改善作用。但是，知柏地黃丸作為中藥復(fù)方制劑，由多種成分構(gòu)成，而且中藥治療疾病往往作用于體內(nèi)多個靶點[4]，其治療機制一直未能明確。闡明知柏地黃丸治療陰虛“上火”的作用機制不僅能夠豐富“上火”的生物學(xué)內(nèi)涵，而且可以提高知柏地黃丸臨床應(yīng)用中的科學(xué)性，對中藥的臨床應(yīng)用與優(yōu)化起到指導(dǎo)作用。

在本研究中，我們應(yīng)用目前蛋白組學(xué)iTRAQ-2DLC-MS/MS研究知柏地黃丸治療前后大鼠血清蛋白組的變化，篩選并鑒定和知柏地黃丸治療相關(guān)的血清蛋白質(zhì)，通過對差異表達的蛋白進行多重生物信息學(xué)分析，進行蛋白的生物學(xué)功能以及信號通路富集，確定知柏地黃丸治療陰虛“上火”的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 實驗用清潔級雌性SD大鼠60只，體重(200±20)g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動物合格證號：SCXK(浙)2014-0001。辛熱藥物水煎劑(附子、干姜、肉桂按1∶1∶1比例常規(guī)制成2 g/mL濃度煎劑)，藥物從杭州胡慶余堂購買。知柏地黃丸從浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二門診部購買。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 所有動物均喂養(yǎng)在恒溫(21～23 ℃)，12 h光照與12 h黑暗循環(huán)更替的動物房，自由進食飲水。實驗開始之前在該環(huán)境飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。大鼠隨機分為正常對照組(20只)、陰虛“上火”組(40只)。陰虛動物模型參照前人方法建立[6]：對照組大鼠每天定時灌胃熱性中藥煎劑，劑量為2 mL/100 g；對照組大鼠給予等量無菌生理鹽水，連續(xù)給藥21 d。實驗第12天，用濾紙片在40%冰醋酸中浸泡24 h后貼于陰虛“上火”組大鼠口腔兩側(cè)頰部黏膜上燒灼60 s造成口腔潰瘍，獲得陰虛“上火”大鼠模型。

1.2.2 給藥方法 從第22天起，模型大鼠隨機分為陰虛“上火”組和知柏地黃丸觀察組，每組20只。觀察組大鼠給予知柏地黃丸8.64 g/(kg·d)(根據(jù)人與大鼠體表面積換算)，連續(xù)給藥7 d，其余2組給予等量無菌生理鹽水。實驗過程中觀察大鼠的外貌體征以及行為變化，每3天記錄1次體重。最后一次給藥后2 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，劑量為0.2 mL/100 g，采用頸總動脈留置針的方法收集大鼠血液。血液4 ℃靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，取血清，分裝，-80 ℃保存。脊椎脫臼法處死大鼠，留取大鼠胸腺、腎上腺、脾臟并稱重。動物實驗嚴(yán)格按照浙江大學(xué)動物保護與使用委員會相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

1.2.3 iTRAQ-2DLC-MS/MS技術(shù)檢測大鼠血清差異蛋白 樣品處理及iTRAQ標(biāo)記：iTRAQ標(biāo)記按照iTRAQ試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster city，CA,USA)說明書進行操作。每組各100 μg蛋白質(zhì)加入預(yù)冷的丙酮(丙酮:樣品體積比=5∶1)，-20 ℃沉淀1 h。12 000 r/min離心15 min，棄上清，用試劑盒中自帶的溶解液Dissolution Buffer(20 μL)和1% SDS(1 μL)充分混懸溶解樣品。加入還原試劑，60 ℃反應(yīng)1 h。將還原的蛋白樣品烷基化，胰蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO,USA)37 ℃消化過夜，然后進行iTRAQ標(biāo)記。對照組樣本用報告標(biāo)簽118標(biāo)記，陰虛“上火”組樣本用報告標(biāo)119標(biāo)記，觀察組樣本121標(biāo)記。室溫下反應(yīng)60 min。將標(biāo)記的肽段混合，脫鹽、干燥。

1.2.4 第一維強陽離子柱(SCX)分離 標(biāo)記后的混合肽段用強陽離子交換柱(SCX)進行分餾。將樣本混合物溶于A相緩沖液(10 mM KH2PO4，25% ACN，pH2.6)上柱，然后用B相緩沖液(350 mM KCl，10 mM KH2PO4，25%ACN，pH 2.6)以0-80%的濃度梯度、200 μL/min的流速洗脫1 h。洗脫后的樣品濃度在波長214 nm/280 nm處OD值讀數(shù)獲得。接著進行第二維反向液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析。

1.2.5 第二維反相液質(zhì)聯(lián)用(RPLC-MS) 混合樣品真空干燥后重懸在20 μL HPLC Buffer A(5%ACN,0.1%甲酸)中，注入ZORBAX 300SB-C18 RP column(5 μm，300 A，0.1 mm×150 mm;Microm，Auburn，CA，USA)，然后用Buffer B(95%ACN,0.1%甲酸)以濃度梯度為5%～35%的濃度梯度、0.3 μL/min的流速洗脫90 min。然后用Q-STAR XL(Applied Biosystem,USA)系統(tǒng)一級質(zhì)譜(MS)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)分析。質(zhì)譜分析設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)：MS掃描范圍m/s為400～1 800；MS/MS掃描范圍m/s為100～2 000。IDA采集模式：1個圖譜選擇20個最強的母離子進行串級掃描[7]。iTRAQ報告離子的峰面積的比值反映了樣品中蛋白質(zhì)的相對豐度和蛋白質(zhì)[8]。應(yīng)用ProteinPilot軟件(Version 3.0，revision 114732,Applied Biosystems)，在International Protein Index(IPI)數(shù)據(jù)庫中查詢MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)，進行差異蛋白的鑒定和定量。參數(shù)設(shè)置包括：消化酶為trypsin，半胱氨酸修飾為甲基甲烷巰基磺酸，樣品采用iTRAQ標(biāo)記賴氨酸和氨基端，檢測蛋白閾值>1.3，即報告置信度要在95%以上，至少1條肽段匹配，而且該肽段對該蛋白質(zhì)置信度在95%以上。差異倍數(shù)大于1.25或小于0.8認(rèn)為2者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義[9]。

表1 陰虛上火SD大鼠陰虛“上火”組、知柏地黃丸觀察組和對照組體重比較

注：與對照組比較，*P<0.05

表2 陰虛上火SD大鼠陰虛“上火”組、知柏地黃丸觀察組 和對照組體重增長率比較(%)

注：與對照組比較，*P<0.05

1.2.6 生物信息學(xué)分析 差異蛋白的分子生物學(xué)功能、細胞成分和生物學(xué)過程分析參閱GO數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)。蛋白信號通路查閱Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)。蛋白與蛋白之間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)借助STRING軟件完成(http://string.embl.de/)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體征變化 造模過程中發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠出現(xiàn)毛色枯黃、大便干結(jié)等“上火”癥狀。第12天用冰醋酸誘導(dǎo)口腔潰瘍后，對照組大鼠口腔兩側(cè)頰部黏膜上出現(xiàn)直徑約4 mm的近圓形潰瘍，邊界較清晰，表面輕度充血，提示潰瘍模型成功。第14天建模完成時，觀察組大鼠體重(277.50±32.93)顯著低于對照組(330.39±3.84),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)。知柏地黃丸治療1周后，觀察組組大鼠與對照組大鼠比較，口腔潰瘍炎性癥狀緩解、毛發(fā)變光滑，體重有回升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 知柏地黃丸治療前后差異蛋白中有恢復(fù)趨勢的蛋白質(zhì)

注：C，正常對照組；M，陰虛“上火”陰虛“上火”組；T，知柏地黃丸觀察組

2.2 臟器稱重結(jié)果 對3組大鼠重要臟器進行稱重，肝臟、脾臟和腎上腺重量在3組大鼠之間均無顯著性差異。陰虛“上火”組、觀察組大鼠胸腺重量顯著低于對照組大鼠。見圖1。

圖1 陰虛“上火”組、對照組、知柏地黃丸觀察組大鼠重要臟器重量比較

2.3 蛋白組學(xué)結(jié)果 iTRAQ結(jié)果顯示，對照組大鼠與對照組大鼠血清中共有47個差異表達蛋白，其中上調(diào)蛋白有20個，下調(diào)蛋白有27個。對差異性蛋白進行生物信息學(xué)分析，GO功能富集結(jié)果表明，差異蛋白主要參與生物調(diào)節(jié)、刺激應(yīng)答、代謝過程；KEGG分析顯示差異蛋白集中在神經(jīng)信號通路、補體與凝血通路。見圖2-3。知柏地黃丸治療前后血清中共出現(xiàn)42個差異蛋白，其中19個蛋白恢復(fù)正常水平或存在恢復(fù)趨勢(表3)，主要分為2大類：1)是與免疫反應(yīng)相關(guān)，分別是補體成分4(C4)、激酶相關(guān)磷蛋白2(Skap2)、凝血因子X(F10)；2)是參與物質(zhì)代謝過程的蛋白，分別是(Ywhah)、L乳酸脫氫酶A鏈(Ldha)、果糖二磷酸醛縮酶A(Aldoa)、花生四烯酸脂肪氧合酶(Alox12)、肌球蛋白輕鏈(Myl6)、抑制致瘤性18蛋白(St18)。

圖2 陰虛“上火”組與對照組血清差異蛋白GO分析

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為“上火”是一種應(yīng)激反應(yīng)，而且與神經(jīng)-內(nèi)分沁-免疫網(wǎng)絡(luò)失衡相關(guān)，可引起機體免疫功能失調(diào)[10]。大量研究發(fā)現(xiàn)，陰虛“上火”可能與機體免疫功能失調(diào)有關(guān)，當(dāng)陰虛“上火”發(fā)生時，機體免疫物質(zhì)生成不足，免疫功能低下，易出現(xiàn)各種類型的免疫缺陷病[11]。與平和質(zhì)人群比較，陰虛“上火”者血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高，IL-2水平降低，表明機體炎性細胞因子表達出現(xiàn)異常[12-13]。此外，“上火”人群外周血中CD3、CD4細胞百分值低于正常人[14]，說明陰虛“上火”人群T細胞免疫功能發(fā)生紊亂。另有研究發(fā)現(xiàn)，陰虛“上火”可能與機體代謝過程紊亂有關(guān)。王召平等人發(fā)現(xiàn)，“上火”人群出現(xiàn)脂代謝與核酸代謝失常，體重指數(shù)、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、血尿酸高于非上火人群，而高密度脂蛋白膽固醇低于非上火人群。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，陰虛“上火”大鼠血清差異蛋白主要集中在生物學(xué)調(diào)節(jié)過程、刺激應(yīng)答過程與代謝過程，說明“上火”是機體對多種外界刺激做出應(yīng)答所產(chǎn)生的一種病理狀態(tài)。這些刺激通常是長期勞作、熬夜、久病勞損，或食辛辣食物，機體通過各種生物學(xué)功能上的調(diào)節(jié)對外界刺激做出應(yīng)答。通過對差異表達的血清蛋白進行KEGG pathway富集分析，我們發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要富集在神經(jīng)信號傳導(dǎo)、補體與凝血通路，說明機體對“上火”的調(diào)節(jié)可能通過神經(jīng)信號通路傳遞，在補體與凝血通路做出調(diào)節(jié)，也印證了前人提出的陰虛“上火”與神經(jīng)-內(nèi)分沁-免疫網(wǎng)絡(luò)失衡相關(guān)。

我們用知柏地黃丸治療陰虛“上火”大鼠，發(fā)現(xiàn)治療前后血清差異蛋白同樣集中在免疫反應(yīng)與代謝過程。C4與F10屬于補體與凝血信號通路的蛋白。F10具有促炎效應(yīng)，在體內(nèi)參與凝血酶(Thrombin)的合成，可誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6，IL-8等各種炎性細胞因子。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)F10在陰虛“上火”大鼠血清顯著高表達，表明體內(nèi)炎性反應(yīng)增強。知柏地黃丸治療后，血清F10水平降低，提示知柏地黃丸可能從緩解炎性反應(yīng)治療陰虛“上火”。C4是補體激活經(jīng)典途徑與凝集素途徑都存在的重要蛋白，C4表達水平的變化可以影響下游膜攻擊復(fù)合物(MAC)的功能，影響機體免疫功能。知柏地黃丸能夠使C4水平降低，說明可能從補體激活水平治療陰虛“上火”。此外，Skap2在知柏地黃丸治療后顯著升高，Skap2參與B淋巴細胞的活化過程，說明知柏地黃丸還可以促進B細胞活化，改善機體免疫功能。此外，知柏地黃丸治療也引起了物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的顯著性變化。果糖二磷酸醛縮酶A和L-乳酸脫氫酶α鏈均參與糖酵解和糖異生，是體內(nèi)葡萄糖代謝的重要途徑，也是機體提供能量的重要反應(yīng)。我們前期的研究也證實，陰虛“上火”大鼠血清差異蛋白中，碳水化合物代謝，尤其是糖酵解和糖異生途徑，在代謝途徑中占很大比例。有研究報道，“上火”大鼠的體內(nèi)能量生產(chǎn)與能量消耗均有一定程度的增強。因此，結(jié)合我們的結(jié)果，陰虛“上火”狀態(tài)下的能量代謝增強可能由于糖酵解與糖異生反應(yīng)在體內(nèi)出現(xiàn)異常。在知柏地黃丸治療后，參與糖酵解與糖異生的果糖二磷酸醛縮酶A和L-乳酸脫氫酶α鏈均恢復(fù)至正常水平，因此推斷知柏地黃丸治療陰虛“上火”還可能通過調(diào)節(jié)糖酵解與糖異生反應(yīng)來穩(wěn)定能量代謝過程。

圖3 陰虛“上火”組與對照組血清差異蛋白KEGG分析

陰虛“上火”是由于在多種刺激下機體免疫功能與代謝過程發(fā)生異常所產(chǎn)生的一種病理狀態(tài)。知柏地黃丸治療后，與免疫反應(yīng)相關(guān)的補體成分4、凝血因子X和酶相關(guān)磷蛋白2恢復(fù)至正常，說明知柏地黃丸可能通過緩解炎性反應(yīng)、激活補體通路、促進B細胞活化治療陰虛“上火”。此外，知柏地黃丸的治療可以恢復(fù)陰虛“上火”大鼠血清果糖二磷酸醛縮酶A和L-乳酸脫氫酶α鏈的表達水平，說明知柏地黃丸還可以通過調(diào)節(jié)血清糖酵解與糖異生，改善陰虛“上火”大鼠能量代謝的異常。

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StudyonZiyinJianghuoFormulaZhibaiDihuangPillonSerumProteinofSDRatswithYin-deficiencyShanghuoBasedoniTRAQ

Liu Changming1, Mao Liangen1, Yang Su1, Jiang Tingting2, Chen Zhongliang1, Tu Huihui1, Chen Jing1, Hu Yuting2, Gan Lin2, Li Zhongjie1, Li Jicheng1, 2

(1InstituteofCellBiology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China; 2SchoolofMedicine,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China)

Objective:To explore the therapeutic mechanism of Zhibai Dihuang Granule (ZDG) in Yin-deficiency-heat (YDH) syndrome.MethodsITRAQ-2DLC-MS/MS technique was applied to screen the differentially expressed serum proteins between ZDG treated rats and YDH syndrome rats. The serum protein profiles were analyzed by bioinformatics tools, such as Gene Ontology (GO) database, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway database. Compared with normal rats, 47 differentially expressed proteins were shown in the serum of YDH syndrome rats, including 20 up-regulated proteins and 27 down-regulated proteins. Nineteen proteins returned to normal after ZDG treatment, which mostly involved in immune reaction and metabolism. Complement C4 (C4), coagulation factor X (F10), and Src kinase-associated phosphoprotein 2 (Skap2) participated in immune response, while L-lactate dehydrogenase A chain (Ldha), Fructose-bisphosphate aldolase A (Aldoa), Arachidonate 12-lipoxygenase (Alox12), Rho GDP-dissociation inhibitor 1 (Arhgdia), and Myosin light polypeptide 6 (Myl6) mainly related to metabolic process.ConclusionYDH syndrome is highly associated with the disturbance of immune function and metabolism, and ZDG treats YDH syndrome mostly through regulating immune activity and metabolic process.

YDH syndrome, Zhibai Dihuang Granule, Proteomics, iTRAQ, Immunity, Metabolism

R22

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.003

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2014CB543002)

劉昌銘(1990.05—)，男，博士研究生，研究方向：陰虛“上火”的血清生物學(xué)標(biāo)志物研究，E-mail：liucm523@126.com

李繼承(1957.12—)，男，碩士，教授，浙江大學(xué)細胞生物學(xué)研究所所長，研究方向：肺結(jié)核生物學(xué)標(biāo)志物及其中醫(yī)證候的生物學(xué)研究，E-mail：lijichen@zju.edu.cn

(2017-11-03收稿 責(zé)任編輯：張文婷)