莫芳芳 劉海霞 華 靜 趙丹丹 田 甜 高思華

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京，100029)

實(shí)驗(yàn)研究

降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細(xì)胞FoxO1表達(dá)的影響

莫芳芳1劉海霞1華 靜2趙丹丹1田 甜1高思華1

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京，100029)

目的：通過研究降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細(xì)胞FoxO1因子表達(dá)的影響，探討降糖消渴顆粒含藥血清保護(hù)胰島β細(xì)胞的分子機(jī)制。方法：通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法制備FoxO1高表達(dá)INS-1穩(wěn)定細(xì)胞株，以2.5 μg/mL四環(huán)素干預(yù)12 h誘導(dǎo)FoxO1高表達(dá)以成模。以10%的降糖消渴顆粒含藥血清干預(yù)細(xì)胞模型24 h，正常鼠血清作對照。高倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法計(jì)算細(xì)胞存活率，全自動生化儀檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量以計(jì)算葡萄糖消耗量，Elisa法檢測細(xì)胞胰島素分泌量，Western blot檢測細(xì)胞中FoxO1總蛋白表達(dá)水平及其磷酸化水平，以qRT-PCR檢測FoxO1mRNA表達(dá)情況。結(jié)果：高倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。降糖消渴顆粒含藥血清組葡萄糖消耗量與細(xì)胞胰島素分泌量均顯著升高(P<0.01)。Western-blot結(jié)果顯示FoxO1總蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而p-FoxO1蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示FoxO1mRNA表達(dá)量稍有降低，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：降糖消渴顆粒含藥血清不能降低INS-1細(xì)胞FoxO1蛋白表達(dá)水平，但能促進(jìn)FoxO1磷酸化，進(jìn)而達(dá)到改善胰島β細(xì)胞功能的作用。

降糖消渴顆粒；FoxO1；INS-1細(xì)胞；2型糖尿病

Forkhead(Fox)因子是一類蛋白質(zhì)家族，其在生物體內(nèi)起著重要作用，已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[1]。目前發(fā)現(xiàn)Fox有17個(gè)亞族，F(xiàn)oxO是其中之一。FoxO主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號傳導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)動物的生長發(fā)育、細(xì)胞分化、代謝、凋亡、炎性反應(yīng)和免疫等[2]。FoxO1是FoxO家族中發(fā)現(xiàn)最早的成員，它能促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化[3-4]、負(fù)調(diào)控骨骼肌的生成和Ⅰ型肌纖維基因的表達(dá)[5]，且對肝細(xì)胞、胰島β細(xì)胞及脂肪細(xì)胞中胰島素作用的發(fā)揮起重要作用[6]?！禖ELL》發(fā)表的研究結(jié)果表明FoxO1與胰島β細(xì)胞去分化相關(guān)，是維持β細(xì)胞身份的最主要作用因子[7]。

2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)是一種復(fù)雜的遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致的內(nèi)分泌代謝性疾病。胰島β細(xì)胞數(shù)目減少及功能受損是T2DM發(fā)生發(fā)展的最重要病理生理基礎(chǔ)之一。降糖消渴顆粒是在導(dǎo)師肝脾腎同調(diào)辨治糖尿病大法指導(dǎo)下所組方劑，其臨床療效確切[8]。實(shí)驗(yàn)研究也已經(jīng)證實(shí)降糖消渴顆粒含藥血清可抑制大鼠胰島β細(xì)胞瘤株INS-1凋亡[9]。為進(jìn)一步研究降糖消渴顆粒治療T2DM的作用機(jī)制，本研究擬從FoxO1切入，通過體外培養(yǎng)INS-1細(xì)胞，慢病毒轉(zhuǎn)染制備FoxO1高表達(dá)模型，再以降糖消渴顆粒含藥血清干預(yù)，探討其對β細(xì)胞FoxO1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性8周齡SD大鼠30只，體重(300±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號：SCXK(京)2012-0001)。INS-1細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 藥物 降糖消渴顆粒的成藥顆粒劑型由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥科技發(fā)展部生產(chǎn)及提供，已經(jīng)過質(zhì)量鑒定，每克顆粒含5.01 g生藥，藥物樣品均保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)糖尿病研究中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)(4 ℃保存)，以備未來參考。臨用時(shí)用蒸餾水配成相應(yīng)濃度的混懸液[10]。

1.1.3 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基，購自INVITROGEN公司；胰蛋白酶，購自SOLARBIO公司；胎牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司；青/鏈霉素，購自HYCLONE公司；RIPA裂解緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；MTT購自Sigma公司；大鼠胰島素(INS)ELISA kit，購自武漢華美生物工程有限公司；FoxO1(C29H4)Rabbit mAb購自CST公司；Anti-FOXO1A(phospho S256)antibody購自ABCAM公司，RNeasy Mini Kit，購自QIAGEN公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，購自FERMENTAS公司；FG，POWER SYBR GREEN PCR，購自INVITROGEN公司；PCR引物購自上海生工生物工程有限公司。CO2培養(yǎng)箱、熒光定量PCR儀：美國Thermo公司；超凈臺工作：香港Heal Force公司；酶標(biāo)儀：瑞士Tecan全波長多功能酶標(biāo)儀；顯微鏡、AU400全自動生化分析儀：日本OLYMPUS公司；電泳和轉(zhuǎn)膜裝置、XRS凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備方法 雄性8周齡SD大鼠30只，體重(300±20)g，按體質(zhì)量隨機(jī)分組如下：空白對照組10只，降糖消渴顆粒組20只，給藥劑量為52.8 g生藥/(kg體重·d)(相當(dāng)于臨床人公斤體質(zhì)量用量的60倍)進(jìn)行灌胃，每天上、下午各灌胃1次，共5次?？瞻讓φ战M只灌胃等量的蒸餾水。末次灌胃后1 h，乙醚麻醉大鼠，無菌條件下經(jīng)腹主動脈取血，4 ℃靜置1 h，3 000 r/min離心20 min，分離含藥血清。合并同組大鼠含藥血清，56 ℃水浴30 min滅活，微孔濾膜過濾除菌，凍存管分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.2.2 INS-1細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞以含10%胎牛血清(FBS)，100 IU/mL青霉素，100 IU/mL鏈霉素，50 μmol/Lβ-巰基乙醇的RPMI-1640完全培養(yǎng)基置于37 ℃，5% CO2條件下無菌培養(yǎng)24 h更換培養(yǎng)基一次，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%后進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.3 INS-1細(xì)胞FoxO1高表達(dá)模型的建立及鑒定 構(gòu)建含有FoxO1基因片段的質(zhì)粒載體，應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)入INS-1細(xì)胞，經(jīng)puromycin篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)FoxO1細(xì)胞株(OE)和陰性對照細(xì)胞株(NC)，2.5 μg/mL Doxycycline干預(yù)12 h誘導(dǎo)FoxO1表達(dá)。用qRT-PCR檢測NC、OE 2種細(xì)胞株FoxO1基因的表達(dá)情況，以對模型進(jìn)行鑒定。

圖1 FoxO1相對基因的表達(dá)

注：與NC組比較，**P<0.01

OE組FoxO1基因的表達(dá)豐度是NC組的2.05倍，NC組相對RNA水平是(1.003±0.089)，OE是(2.050±0.213)，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明FoxO1基因轉(zhuǎn)染成功，模型建立成功。

1.2.4 藥物干預(yù)及指標(biāo)檢測 以10%的降糖消渴顆粒含藥血清[9]干預(yù)細(xì)胞模型24 h，正常鼠血清作對照。分別檢測正常組、模型組、藥物組細(xì)胞培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，計(jì)算葡萄糖消耗量，MTT法檢測吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，Elisa法檢測細(xì)胞胰島素分泌量，Western blot檢測細(xì)胞中FoxO1總蛋白表達(dá)水平及其磷酸化水平，以qRT-PCR檢測FoxO1mRNA表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以Mean±SE表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 在高倍鏡下觀察，正常組、模型組和降糖消渴顆粒組的細(xì)胞呈梭形或多邊形，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞形態(tài)基本相似(如圖2)。結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染造模和10%降糖消渴顆粒含藥血清干預(yù)細(xì)胞均不會造成細(xì)胞形態(tài)的變化。

圖2 細(xì)胞形態(tài)(200×)

2.2 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細(xì)胞葡萄糖消耗量及細(xì)胞存活率的影響 檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量，與未接種細(xì)胞的空白復(fù)孔的葡萄糖濃度相減，算出各孔的葡萄糖消耗量。結(jié)果如圖3所示，與正常對照組比較，模型組的細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯減少(*P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型對照組比較，10%降糖消渴顆粒含藥血清能夠增加FoxO1高表達(dá)INS-1細(xì)胞模型的葡萄糖消耗量(**P<0.01)。

MTT法測定波長在570 nm各孔的吸光度,計(jì)算細(xì)胞存活率。如圖3所示，各組之間細(xì)胞存活率無顯著性差異(#P>0.05，##P>0.05)，說明慢病毒轉(zhuǎn)染制備FoxO1高表達(dá)模型與10%降糖消渴顆粒含藥血清干預(yù)細(xì)胞均未見明顯細(xì)胞毒性。

2.3 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的影響 如圖4所示，與正常組比較，INS-1細(xì)胞FoxO1高表達(dá)模型組的細(xì)胞胰島素分泌量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.01)，提示FoxO1高表達(dá)INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能受損。與模型組比較，10%降糖消渴顆粒含藥血清能夠明顯增加細(xì)胞胰島素分泌量(**P<0.01)。

圖3 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細(xì)胞葡萄糖消耗量及細(xì)胞存活率的影響

注：與正常組比較，*P<0.01，#P>0.05，與模型組比較，**P<0.01，##P>0.05

圖4 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的影響

注：與正常組比較，*P<0.01，與模型組比較，**P<0.01

2.4 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細(xì)胞FoxO1蛋白表達(dá)及其磷酸化水平的影響 如圖5所示，Western-blot結(jié)果顯示，與正常INS-1細(xì)胞比較，F(xiàn)oxO1高表達(dá)細(xì)胞模型組FoxO1總蛋白表達(dá)增加(#P<0.01)，p-FoxO1蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P>0.05)，提示模型穩(wěn)定。應(yīng)用10%降糖消渴顆粒含藥血清干預(yù)24 h后，與模型對照組比較，F(xiàn)oxO1總蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(##P>0.05)，而p-FoxO1蛋白表達(dá)增加(**P<0.05)。

圖5 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細(xì)胞FoxO1、P-FoxO1蛋白表達(dá)的影響

注：與正常組比較，*P>0.05，#P<0.01，與模型組比較，**P<0.05，##P>0.05

2.5 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細(xì)胞FoxO1 mRNA表達(dá)的影響 如圖6所示，qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常組比較，模型對照組FoxO1mRNA表達(dá)量明顯升高(*P<0.01)，提示細(xì)胞模型穩(wěn)定。以10%降糖消渴顆粒含藥血清干預(yù)FoxO1高表達(dá)INS-1細(xì)胞模型24 h，與模型對照組比較，F(xiàn)oxO1基因表達(dá)量稍有降低，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**P>0.05)。

圖6 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細(xì)胞FoxO1 mRNA表達(dá)的影響

注：與正常組比較，*P<0.01，與模型組比較，**P>0.05

3 討論

胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞受損是T2DM發(fā)病的重要病理機(jī)制，尤其β細(xì)胞數(shù)量減少和功能受損在T2MD發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。大量研究資料表明，F(xiàn)oxO1在胰島β細(xì)胞中表達(dá)豐富，F(xiàn)oxO1作用于協(xié)調(diào)β細(xì)胞的更新和功能之間的關(guān)系，是胰島β細(xì)胞應(yīng)激、增殖、凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵點(diǎn)[12-17]。

FoxO1的活性受胰島素的負(fù)性調(diào)節(jié)。FoxO1作為胰島素/胰島素樣生長因子1(INS/IGF-1)信號通路中的關(guān)鍵因子，其上游受磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)磷酸化級聯(lián)通路的調(diào)節(jié)。FoxO1分子中有三個(gè)保守的AKT/PKB蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)，PI3K/AKT途徑被激活后，使細(xì)胞核中的FoxO1磷酸化而發(fā)生核輸出，由核內(nèi)轉(zhuǎn)至胞質(zhì)中，失去轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制細(xì)胞的凋亡。當(dāng)胰島素信號減弱時(shí)，通過PI3K/AKT通路，AKT/PKB蛋白激酶活性降低，使FoxO1磷酸化水平降低而滯留在細(xì)胞核內(nèi)，失去活性，進(jìn)而通過誘導(dǎo)靶基因表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞功能的改變[18]。

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)FoxO1高表達(dá)的INS-1細(xì)胞的葡萄糖消耗量和胰島素分泌量均有所降低，提示FoxO1高表達(dá)導(dǎo)致了INS-1細(xì)胞分泌胰島素的功能受損。降糖消渴顆粒含藥血清能夠增加胰島β細(xì)胞的葡萄糖消耗量和胰島素分泌量，從而改善了細(xì)胞功能。進(jìn)一步研究分子機(jī)制，F(xiàn)oxO1高表達(dá)INS-1細(xì)胞中總的FoxO1蛋白水平和mRNA均顯著增加，說明慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型穩(wěn)定。經(jīng)降糖消渴顆粒含藥血清干預(yù)，細(xì)胞中總的FoxO1蛋白水平和mRNA含量均無顯著性變化，而P-FoxO1蛋白水平增加，說明降糖消渴顆粒含藥血清促進(jìn)了β細(xì)胞中FoxO1磷酸化出核，可能激活PI3K/AKT途徑，從而改善細(xì)胞胰島素分泌功能。這可能是降糖消渴顆粒含藥血清保護(hù)胰島β細(xì)胞、改善細(xì)胞功能的作用機(jī)制之一。

綜上所述，F(xiàn)oxO1因子在β細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用，本研究表明了降糖消渴顆粒不能降低FoxO1蛋白水平，但能促進(jìn)FoxO1磷酸化，進(jìn)而改善β細(xì)胞的胰島素分泌功能，然而降糖消渴顆粒是否通過激活PI3K/AKT通路而發(fā)揮作用，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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EffectsofJiangtangXiaokeGranuleContainedSerumonFoxO1ExpressioninINS-1Cell

Mo Fangfang1, Liu Haixia1, Hua Jing2, Zhao Dandan1, Tian Tian1, Gao Sihua1

(1BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2BeijingUniversityofChineseMedicineThirdAffiliatedHospital,Beijing100029,China)

Objective:To study the molecular mechanism of Jiangtang Xiaoke Granule contained serum in protecting β-cells through studying the effects of Jiangtang Xiaoke Granule (JTXK) contained serum on FoxO1 expression in INS-1 cell.MethodsLentivirus transfection was used to prepare FoxO1-overexpressing INS-1 stable cell line, and the overexpression was induced by 2.5 μg/mL doxycycline for 12 hours. The cells were treated with 10% JTXK granule containing serum for 24 h. And normal rat serum was used as control. The morphological changes of cells were observed under high power microscope. MTT analysis was used to calculate cell viability. The glucose concentration in cell culture was detected by automatic biochemical analyzer. And the glucose consumption was calculated. ELISA analysis was used to examine insulin secretion. The expression levels of FoxO1 and P-FoxO1 were evaluated by western blot. And the expression levels of FoxO1mRNA were evaluated by quantitative real-time PCR (qRT-PCR).ResultsThe cells did not have significant differences in size and shape. And there was no difference in cell viability among three groups. The glucose consumption and insulin secretion were increased in JTXK group (P<0.01). At the same time, the results of western-blot and qRT-PCR showed that the expression of FoxO1 and FoxO1mRNA had no difference (P>0.05). However, the expression of P-FoxO1 was increased (P<0.05).ConclusionJTXK granule cannot decrease the expression of FoxO1 of INS-1 cell, but can promote phosphorylation of FoxO1, so as to improve β-cell function.

Jiangtang Xiaoke (JTXK) granule, FoxO1, INS-1 cell, Type 2 diabetes mellitus (T2DM)

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.047

北京中醫(yī)藥大學(xué)中青年教師自主選題項(xiàng)目(2015-JYB-JSMS015)

莫芳芳(1982.03—)，女，博士，助理研究員，研究方向：臟腑相關(guān)理論研究與中醫(yī)藥防治糖尿病研究，E-mail：xiaofang.tcm@163.com

高思華(1957.07—)，男，博士，教授，研究方向：運(yùn)氣學(xué)說、臟腑相關(guān)理論研究與中醫(yī)藥防治糖尿病研究，Tel：(010)64286915，E-mail：sihuagaopaper@sina.com

(2017-07-21收稿 責(zé)任編輯：徐穎)