張方博 許 淼 張 毅 李德鳳 趙海譽 楊洪軍 邊寶林

(1 中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京，100700； 2 國家知識產(chǎn)權局專利局醫(yī)藥部，北京，100088)

黃連解毒湯對大鼠上火牙齦炎的治療作用

張方博1許 淼2張 毅1李德鳳1趙海譽1楊洪軍1邊寶林1

(1 中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京，100700； 2 國家知識產(chǎn)權局專利局醫(yī)藥部，北京，100088)

目的：采用牙齦黏膜下注射內(nèi)毒素法構建大鼠上火牙齦炎模型，觀察黃連解毒湯對大鼠上火牙齦炎的治療作用。方法：雄性SD大鼠隨機分為7組：正常對照組、溶劑對照組、上火牙齦炎模型組、黃連解毒湯低(0.25 g/kg)、中(0.50 g/kg)、高劑量組(1.00 g/kg)和甲硝唑芬布芬膠囊組。代謝籠喂養(yǎng)觀測飲水量和尿量；LC-ESI-MS/MS法檢測牙齦組織蛋白表達；生化試劑盒結合酶標儀檢測牙齦組織氧化應激相關分子總超氧化物歧化酶(Total Superoxide Dismutase，T-SOD)和過氧化氫酶(Hydrogen Peroxidase，Catalase，CAT)的表達；Western Blotting法檢測牙齦組織能量代謝相關信號通路TSC的表達。結果：上火牙齦炎時，大鼠飲水量和尿量減少，T-SOD和CAT表達水平降低，果糖二磷酸醛縮酶C、磷酸甘油醛異構酶1和TSC2均表達升高。黃連解毒湯可增加飲水量和尿量，升高T-SOD和CAT的水平，降低果糖二磷酸醛縮酶C和磷酸甘油醛異構酶1的表達，抑制能量代謝相關通路分子TSC2的表達。結論：黃連解毒湯可通過TSC信號通路和糖酵解相關分子抑制能量代謝，并抑制氧化應激，發(fā)揮治療上火牙齦炎的作用。

黃連解毒湯；上火；牙齦炎；糖酵解；能量代謝；氧化應激

牙周病是發(fā)生于牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，細菌感染是主要致病因素，已成為口腔疾病的常見病和多發(fā)病。根據(jù)炎性反應的輕重和波及范圍，分為牙齦炎和牙周炎。若得不到及時治療，將導致牙周組織不可逆損傷，牙齒松動脫落，嚴重者影響咀嚼功能，威脅著患者的生命質量。目前治療方法除常規(guī)的潔治和刮治外，應用抗生素仍然是牙周病治療的重要輔助手段，然而抗生素濫用導致細菌耐藥和菌群失衡以及多種不良反應，因此開發(fā)天然藥物越來越受到關注[1]。

黃連解毒湯(Huanglian Jiedu Decoration，HLJD)出自唐代名醫(yī)王燾《外臺秘要》，是中醫(yī)治療火熱毒癥的經(jīng)典方劑，由黃連、黃芩、黃柏和梔子組成，具有清熱、瀉火、解毒之功效，主治實熱火毒合三焦熱盛之證。現(xiàn)代藥理研究表明，黃連解毒湯具有抗炎、抗菌、抗內(nèi)毒素、抗氧化、抗腦缺血、抗腫瘤、降血壓、降血糖、降血脂、抑制脂肪細胞分化、抑制肝損害等作用[2-5]。

中醫(yī)認為“上火”的產(chǎn)生，乃維持正常生命之氣(火)相對發(fā)生偏盛，不管實熱、陽虛、氣虛、陰虛而生的火，均可稱為“邪火”[6]?！吧匣稹比巳吼つっ庖呦到y(tǒng)異常，且“上火”損傷部位以頭面部黏膜為主?！吧匣稹倍啾憩F(xiàn)為口瘡、牙宣、鼻衄、目赤、咽痛、口干等頭面部黏膜病變[7]。本研究采用牙齦黏膜下注射內(nèi)毒素法，基于中醫(yī)“上火”理論模式，構建大鼠上火牙齦炎模型，觀察黃連解毒湯對大鼠上火牙齦炎的療效和作用機制[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性SPF級SD大鼠，體重(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物質量合格證號為SCXK2006-0009。

1.1.2 藥物 將黃連、黃芩、黃柏和梔子按3∶2∶2∶3比例混合，中藥粉粹機打粉。取定量粉末，加入10倍體積水，加熱回流2 h。循環(huán)水式真空泵及布氏漏斗減壓抽濾，得濾液1。濾渣加入10倍體積雙蒸水再加熱回流2 h，抽濾得濾液2，合并濾液1和2，減壓濃縮至干，得黃連解毒湯粉末，每1 g粉末相當于原粉5 g[9]。

1.1.3 試劑與儀器 陽性對照藥甲硝唑芬布芬膠囊(Metronidazole and Fenbufen Capsules，MFC，石藥集團歐意藥業(yè)有限公司產(chǎn)品生產(chǎn)，國藥準字號H13024465)，用于牙齦炎和牙周炎等疾患。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn))，臨用時用生理鹽水配成1 mg/mL濃度。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制作 將大鼠按體重隨機分為7組，每組10只，如下：正常對照組(Control)：大鼠自由飲食，不做任何處理；溶劑對照組(Saline)：大鼠牙齦組織注射等體積生理鹽水，然后口服生理鹽水；上火牙齦炎模型組(Model)：牙齦黏膜下組織注射LPS，然后口服生理鹽水；黃連解毒湯組(HLJD)：分為低(0.25 g/kg)、中(0.50 g/kg)、高劑量組(1.00 g/kg)，牙齦黏膜下組織注射LPS，然后口服不同劑量的黃連解毒湯；陽性對照藥組：牙齦黏膜下組織注射LPS，然后口服甲硝唑芬布芬膠囊溶液(MFC，甲硝唑31.25 mg/kg，芬布芬7.80 mg/kg)。

1.2.2 給藥方法 大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，用胰島素注射器(美國BD，0.3×13 mm)在上下牙齦左、中、右黏膜下各3點注射脂多糖(LPS，1 mg/mL)10 μL，共注射6點，連續(xù)注射3 d。給藥方式模型制作算為第1天，黃連解毒湯和對照藥均為第1天給藥，即模型制作完成后2 h灌胃給藥，連續(xù)給藥3 d，第4天處死動物，刮取牙齦組織。

1.2.3 檢測指標和方法 1)飲水量和尿量的觀測：模型制作前所有大鼠禁食禁水，按模型制作算為第1天，將大鼠裝入代謝籠喂養(yǎng)，自由攝食和飲水，每天早10點裝入200 mL飲用水，并計數(shù)飲水量和尿量，嚴格收集各組尿液和尿量，連續(xù)觀察3 d。2)LC-ESI-MS/MS法：檢測大鼠牙齦組織蛋白表達利用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜(LC-ESI-MS/MS)法檢測黃連解毒湯使用前后大鼠牙齦炎組織蛋白的表達。胰蛋白酶水解肽段，液質分析條件如下。液相條件：色譜柱為C18柱，(內(nèi)徑75 μm，外徑360 μm，顆粒直徑3 μm，流速350 nL/min。質譜條件：質譜儀為LTQ-OrbitrapVelos(Thermo)，離子源為納米電噴霧離子源，噴霧電壓為1 800V，無鞘氣，離子傳輸管溫度350 ℃，掃描范圍m/z375至1 600(m/z400時，分辨率為60 000)，碰撞能量35%，激活時間5 ms，掃描閾值500。蛋白鑒定軟件Proteome Discovery(V1.3)，搜索工具MASCOT，搜索數(shù)據(jù)庫RefSeq protein database(更新于2014年11月17日)，質譜誤差設置為20 ppm，母離子為0.5 Data，選擇氧化和乙酰化可變修飾，氨基甲?；潭ㄐ揎?，蛋白鑒定假陽性率控制在1%。3)生化試劑盒結合酶標儀檢測氧化應激相關分子：總超氧化物歧化酶(T-SOD)和過氧化氫酶(CAT)的表達取各組大鼠牙齦組織，加入裂解液，16 000 g離心15 min，取上清，按照試劑盒操作說明，酶標儀(Molecular Devices，USA)檢測樣品吸光值(OD)，按說明書公式換算成有效單位(U/mL)。4)Western Blotting法檢測大鼠牙齦組織能量信號通路TSC的表達：取各組牙齦組織，加入裂解液提取總蛋白，Pierece蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取各樣品20 μg上樣，以10% SDS-PAGE膠分離蛋白，濕轉法將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上。封閉液室溫封閉2 h，加入一抗，4度過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫輕搖2 h，充分洗滌后，用ECL顯影曝光。

2 結果

2.1 黃連解毒湯對飲水量和尿量的影響 連續(xù)3 d觀察對照組以及各用藥組大鼠的飲水量和尿量，結果表明第1天各組大鼠飲水量無差異，模型組與正常對照組比較，尿量減少；第2天和第3天，各組大鼠飲水量和尿量都逐漸減少，模型組減少量最大；服用黃連解毒湯后，與對應的模型組比較，飲水量和尿量均有不同程度增加，并有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 黃連解毒湯對上火牙齦炎大鼠飲水量和尿量的影響

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與模型組比較，△△P<0.01

2.2 黃連解毒湯對牙齦組織蛋白表達的影響 LC-ESI-MS/MS法共檢測2 997個蛋白，采用ANOVA分析法，結果表明54個蛋白差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。將這54個蛋白進行分析，與牙齦炎相關的蛋白靶點可能為Fructose-bisphosphatealdolase C(果糖二磷酸醛縮酶C)和Triosephosphateisomerase isoform 1(磷酸甘油醛異構酶1)。牙齦炎時此2種蛋白均表達升高，黃連解毒湯低、中、高劑量組可降低上述2種蛋白的表達，對照藥無該作用。

2.3 黃連解毒湯對牙齦組織氧化應激相關分子T-SOD和CAT表達的影響 生化試劑盒結合酶標儀對用藥前后各組牙齦組織氧化應激相關分子T-SOD和CAT進行檢測，結果表明上火牙齦炎時，對照組牙齦組織氧化應激相關分子T-SOD和CAT表達降低，服用黃連解毒湯后，T-SOD和CAT表達均升高，且具有量效關系。見圖1。

圖1 生化試劑盒結合酶標儀檢測黃連解毒湯對上火牙齦炎大鼠牙齦組織T-SOD和CAT表達的影響

注：**P<0.01 VS. 正常；#P<0.05 VS.模型；##P<0.01 VS. 模型。Control：正常對照組；Saline：溶劑對照組；Model：模型組；0.25、0.50、1.00 g/kg 分別代表黃連解毒湯低、中、高劑量組；MFC：陽性對照藥甲硝唑芬布芬組

2.4 黃連解毒湯對牙齦組織牙齦組織能量代謝相關通路TSC表達的影響 Western blotting檢測大鼠上火牙齦炎牙齦組織TSC1、TSC2、p-TCS2等多種蛋白的表達，GAPDH為內(nèi)參。結果表明上火牙齦炎時TSC2表達升高，其余蛋白表達無改變。黃連解毒湯低、中、高劑量組可抑制TSC2表達。見圖2。

圖2 Western blotting法檢測黃連解毒湯對上火牙齦炎大鼠牙齦組織TSC蛋白表達的影響

注：從左至右依次為：正常對照組(Control)，溶劑對照組(Saline)，模型組(Model)，黃連解毒湯低(0.25 g/kg)，中(0.50 g/kg)，高劑量組(1.00 g/kg)，對照藥組(MFC)

3 討論

上火屬于中醫(yī)熱證范疇，分為實火和虛火2類。實火指陽熱亢盛，臨床表現(xiàn)為面紅目赤、口唇干裂、舌紅苔黃、咽喉腫痛、牙齦出血、身熱煩躁、尿少便秘、尿血便血、脈數(shù)實等等[10]。虛火多因內(nèi)傷勞損所致，治療則以清熱瀉火、滋陰降火等方法[11]。本研究用LPS注射法構建上火牙齦炎大鼠模型，模型大鼠飲水量和尿量均減少：1)一方面可能由于大鼠處于上火狀態(tài)，體液失調；2)另一方面可能由于在牙齦黏膜下注射LPS，引起不適，影響進食和飲水。而黃連解毒湯可改善不適狀態(tài)，使牙齦炎大鼠飲水量和尿量增多。

果糖二磷酸醛縮酶存在于多種組織中，是生命代謝過程中重要的糖酵解同工酶。其還可調節(jié)細胞膜P-糖蛋白將藥物泵出，從而使DNA得以修復，還通過加快細胞內(nèi)糖或帶有糖支鏈物質的代謝，增加細胞解毒功能[12]。磷酸甘油醛異構酶能夠催化丙糖磷酸異構體在二羥丙酮磷酸和D型甘油醛-3-磷酸之間轉換。磷酸甘油醛異構酶在糖酵解中具有重要作用，對與有效的能量生成必不可少[13]。與牙齦炎相關的靶點主要為果糖二磷酸醛縮酶C和磷酸甘油醛異構酶1。上火牙齦炎時這2種蛋白均表達升高，表明牙齦組織的能量代謝有所改變，黃連解毒湯可通過能量代謝相關酶降低能量的產(chǎn)生。

氧化應激參與眾多疾病如中風、老年癡呆、帕金森病以及牙周病的發(fā)生發(fā)展[14-15]。氧化應激過程中產(chǎn)生大量活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)，可通過脂質過氧化、DNA和蛋白質損傷、激活炎性反應因子以及關鍵酶的氧化等途徑，造成牙齦組織損傷[16-17]。為研究牙周病患者體內(nèi)的氧化應激和炎性反應狀態(tài)，化學發(fā)光法檢測牙周病患者血清及唾液中超氧化歧化酶(SOD)水平，結果表明牙周病患者SOD含量顯著低于對照組，表明牙周病可能與體內(nèi)的氧化應激水平密切相關[18]。本研究中上火牙齦炎大鼠氧化應激相關分子T-SOD和CAT水平降低，黃連解毒湯可通過提高T-SOD和CAT的水平發(fā)揮保護牙齦組織的作用。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)是非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為磷脂酰肌醇激酶相關激酶(Phosphatidy-linositol kinase-related Kinase，PIKK)蛋白質家族成員。mTOR進化上相對保守，可整合營養(yǎng)、能量及生長因子等多種細胞外信號，參與基因轉錄、蛋白質翻譯、核糖體合成等生物過程，在細胞生長和凋亡中發(fā)揮極為重要的作用[19]。TSC1/TSC2是mTOR最重要的上游分子，mTOR活性主要受2種TSC-mTOR信號通路調節(jié)，即PI3K-Akt-TSC1/TSC2-mTOR信號通路和LKB1-AMPK-TSC1/TSC2-mTOR信號通路[20]。大鼠上火牙齦炎時TSC2表達升高，黃連解毒湯可抑制TSC2表達。

綜上所述，上火狀態(tài)時，牙齦炎時黏膜上皮組織糖酵解供能方式特別活躍，機體內(nèi)環(huán)境的變化加重黏膜上皮組織缺血缺氧狀態(tài)，使其糖酵解進一步活躍。能量代謝紊亂可導致黏膜損傷，使黏膜免疫系統(tǒng)供能紊亂，局部黏膜免疫力下降，易于繼發(fā)感染[4]。此研究結果表明黃連解毒湯可通過TSC信號通路和糖酵解相關分子抑制能量代謝，并抑制氧化應激，從而起到治療上火牙齦炎的作用，但其作用的具體機制還需要進一步研究。

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EffectsofHuanglianJieduDecoctioninRatShanghuoGingivitis

Zhang Fangbo1, Xu Miao2, Zhang Yi2, Li Defeng1, Zhao Haiyu1, Yang Hongjun1, Bian Baolin1

(1InstituteofChineseMateriaMedicaChinaAcademyofChineseMedicalScienses，Beijing100700，China；2StateIntellectualPropertyOfficeoftheP.R.C，Beijing100088，China)

Objective:To evaluate the effects of huanglianjiedu decoration (HLJD) on the treatment of rat Shanghuo gingivitis by injecting lipopolysaccharide (LPS) in tooth-supporting tissues.MethodsGingival inflammation was established by LPS injection. Adult male rats were divided into seven equal groups:control group (no treatment group), negative control group (sterile saline was injected into gingival tissue followed by oral gavage with saline), positive control group (LPS injection was followed by oral gavage with saline), HLID low-dose, middle-dose, high-dose group (LPS injection was followed by oral gavage with HLJD); metronidazole and fenbufencapsule (MFC) group (Oral gavage with MFC was followed by LPS injection). After 3 days, the rats were sacrificed and gingival tissue samples were randomly evaluated by biochemistry method, LC-ESI-MS/MS and western blotting.ResultsThe levels of water intake, urine volume, total superoxide dismutase (T-SOD) and hydrogen peroxidase (catalase, CAT) in the model group were apparently lower than those in the control group. Meanwhile, fructose-bisphosphate aldolase C, triosephosphate isomerase 1 and TSC2 in the model group were significantly increased than those in the control group. HLJD could reverse those effects. ANOVA was used for the statistical analyses, withP<0.05 regarded as significant.ConclusionHLJD treatment is effective in reducing energy metabolism and oxidative stress in induced rat gingivitis, resulting in a decreased level of fewer destructive effects.

Huanlian jiedu decoration; Shanghuo; Gingivitis; Glycolysis; Energy metabolism; Oxidative stress

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.004

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2014CB543003)；國家自然科學基金青年基金(81403207)

張方博(1980.12—)，女，博士，助理研究員，研究方向：中藥藥理，E-mail:fbzhang@icmm.ac.cn

楊洪軍(1972.07—)，男，博士，研究員，整合中藥學研究中心主任，研究方向：中藥藥理，E-mail:hjyang@icmm.ac.cn；邊寶林(1961.10—)，男，學士，研究員，副所長，研究方向：中藥化學及質量控制與中藥新藥開發(fā)，E-mail:blbian@icmm.ac.cn

(2017-11-03收稿 責任編輯：張文婷)