張淑靜 王 謙 李姝玉 趙福建 王巖飛 高譽(yù)珊 李奕萱 張 達(dá)

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對(duì)2型糖尿病動(dòng)物KKAy小鼠心臟組織IRE1α和XBP1表達(dá)的影響

張淑靜 王 謙 李姝玉 趙福建 王巖飛 高譽(yù)珊 李奕萱 張 達(dá)

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

目的：探討黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對(duì)2型糖尿病動(dòng)物KKAy小鼠的心臟保護(hù)作用機(jī)制,為中醫(yī)藥治療糖尿病心肌病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：將造模成功的KKAy小鼠按血糖隨機(jī)分為模型組和觀察組(黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液),同周齡雄性C57BL/6J小鼠作為正常對(duì)照組,并于20周齡、24周齡、28周齡分別處死小鼠。熒光定量PCR測(cè)小鼠心臟組織中IRE1α、XBP1U、XBP1S的表達(dá)，蛋白免疫印跡檢測(cè)小鼠心臟組織中IRE1α、XBP1蛋白的表達(dá)。結(jié)果：模型組小鼠20、24、28周齡心臟組織IRE1α的 mRNA和蛋白表達(dá)比正常組明顯增加(P<0.01)，觀察組20周齡IRE1α蛋白表達(dá)較正常組增加(P<0.01)，但觀察組各周齡IRE1αmRNA和蛋白表達(dá)均低于模型組(P<0.01或P<0.05)；模型組小鼠各周齡XBP1S mRNA和XBP1蛋白表達(dá)、28周齡XBP1U的mRNA表達(dá)比正常組增加(P<0.01或P<0.05)，觀察組各周齡XBP1蛋白表達(dá)和20、24周齡的XBP1S mRNA表達(dá)較模型組降低，而28周齡XBP1S和XBP1U的mRNA表達(dá)均分別比模型組和正常組增加(P<0.05)。結(jié)論：黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液可在一定程度上抑制2型糖尿病動(dòng)物KKAy小鼠心臟組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)分子IRE1α和XBP1的表達(dá),減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，保護(hù)2型糖尿病KKAy小鼠的心臟功能。

黃芪注射液；葛根素注射液；糖尿病心肌病；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

我國2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年顯著升高的趨勢(shì)。糖尿病心肌病是糖尿病的重要慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病與糖尿病的代謝紊亂密切相關(guān)?；颊咝募〖?xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、心肌肥大和心肌纖維化等原發(fā)性損傷，從而引起廣泛的心肌結(jié)構(gòu)異常，最終可導(dǎo)致心肌收縮和(或)舒張障礙[1-3]。目前研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)參與了糖尿病心臟病變的發(fā)生發(fā)展過程，并且起著非常關(guān)鍵的作用[4-6]。

黃芪注射液，是中藥黃芪全提取物的水溶液，經(jīng)滅菌制成，主要成分有多糖、皂苷、黃酮、氨基酸及其他微量元素。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪可以增強(qiáng)免疫功能，具有保肝、利尿；降壓、調(diào)脂、降糖等作用。葛根素是葛根注射液的有效成分，它是從葛根中分離提取出來的一種異黃酮類單體化合物，據(jù)現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能改善微循環(huán)、心腦血管循環(huán)，降血壓，保護(hù)心肌細(xì)胞，抗血小板聚集等作用。中藥組方在防治糖尿病及其并發(fā)癥方面具有很大優(yōu)勢(shì)，有著標(biāo)本兼顧的優(yōu)勢(shì)，已有許多中藥組方成功開發(fā)并應(yīng)用于臨床糖尿病的治療，取得良好的效果[7]。我們?cè)谇捌谘芯恐衃8]，發(fā)現(xiàn)黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對(duì)T2DM動(dòng)物KKAy小鼠腎臟過強(qiáng)的ERS反應(yīng)有很好的抑制作用，本研究以此小鼠為模型，探討黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對(duì)糖尿病心臟病變發(fā)生發(fā)展過程中有關(guān)的ERS有關(guān)因IRE1α和XBP1表達(dá)的影響，為探討黃芪葛根注射液通過IRE1途徑抵抗ERS，保護(hù)糖尿病心肌病小鼠心臟功能，為臨床新藥的研發(fā)與應(yīng)用提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)KKAy小鼠和C57BL/6J小鼠，雄性，鼠齡8～10周，體重22～25 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2013-0002，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由飲水和進(jìn)食。高脂飼料(10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉+67%基礎(chǔ)飼料)購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，普通飼料購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心。

1.1.2 藥物 葛根注射液(批號(hào)：1009056，成都地奧九泓制藥廠)，黃芪注射液(批號(hào)：1404163，湖南五洲通藥業(yè)有限責(zé)任公司)，TRIzol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega生物技術(shù)有限公司，Power Sybrgreen購自ABI公司，引物設(shè)計(jì)應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計(jì)并交由寶生物工程(大連)有限公司合成；蛋白裂解液、電泳液，電轉(zhuǎn)液等試劑購置北京普利萊基因技術(shù)有限公司，兔抗IRE1α、XBP1抗體購自Abcam公司，二抗購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 T2DM動(dòng)物KKAy小鼠模型的建立 用高脂飼料喂養(yǎng)KKAy小鼠，用普通飼料喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠，全部給予普通飲水。待12周齡時(shí)，將隨機(jī)血糖≥13.9 mmol/L的KKAy小鼠視為糖尿病模型建立成功[9]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組、觀察組，將C57BL/6J小鼠作為對(duì)照組，將造模成功的KKAy小鼠按隨機(jī)血糖隨機(jī)分為模型組和觀察組，具體分組情況如下：對(duì)照組：C57BL/6J小鼠，18只，給予普通飼料飼喂。模型組：KKAy小鼠，18只，給予高脂飼料飼喂，每日給予與觀察組相同劑量的生理鹽水(4.3 mL/kg)，腹腔注射。觀察組：KKAy小鼠，18只，給予高脂飼料，每日腹腔注射黃芪注射液(3 mL/kg)和葛根素注射液(1.3 mL/kg)，2種藥物先后注射。以上各組動(dòng)物均為單籠飼養(yǎng)，均自由飲食，普通飲水，每日換墊料，分別于20周齡、24周齡、28周齡各處死6只，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 心肌組織樣品采集和制備 分別于20周齡、24周齡、28周齡時(shí)分批處死各組小鼠，用剪刀打開小鼠胸腔，將心臟剪下，以冰生理鹽水沖洗殘留血液，去除大血管，快速切留心尖組織，保存于液氮罐中備用。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè) 用TRIzol試劑提取心臟組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄后，用熒光染料POWER SYBRGREEN進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，PCR反應(yīng)體系為20 μL：其中SYBRGREEN 10 μL、上游、下游引物(10 μM)各0.4 μL，cDNA為反轉(zhuǎn)錄原液(20 μg RNA)稀釋后2 μL、ddH2O 7.6 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s(讀取熒光數(shù)值)，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線：擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，95 ℃，15 s，60 ℃(讀取熒光數(shù)值)，1 min，然后從60 ℃至95 ℃，每增加0.3 ℃，讀取一次吸光值，最后95 ℃，15 s。讀取Ct值，計(jì)算△Ct值(Ct目的基因-Ct內(nèi)參actin)、△△Ct值(△Ct處理-△Ct對(duì)照)、2-△△Ct值(相對(duì)表達(dá)量RQ，Relative Qualification)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)心臟組織IRE1α、XBP1蛋白的表達(dá) 提取心臟組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取等量變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，120 V，100 min電泳，80 V，70 min轉(zhuǎn)膜，然后于5%脫脂奶粉/TBST中，室溫封閉至少1 h，加入一抗稀釋液稀釋的兔抗小鼠IRE1α、XBP1抗體(1∶1 000)，孵育、洗滌，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)，于暗室中顯影。膠片蛋白質(zhì)條帶用Quantity One成像分析系統(tǒng)分析。以吸光度值代表蛋白的強(qiáng)度，以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白β-actin的吸光度值的比值作為目的蛋白表達(dá)相對(duì)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心臟組織中IRE1α、XBP1U、XBP1S的mRNA表達(dá)水平 IRE1α的mRNA表達(dá)，20周齡、24周齡、28周齡，模型組與正常組比較，均顯著增加，觀察組比模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。XBP1U的mRNA表達(dá)，在20周齡和24周齡，模型組與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在28周齡時(shí)，模型組與正常組比較，表達(dá)明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在20周齡、24周齡、28周齡時(shí)，觀察組比正常組、模型組都增加，都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。XBP1S的mRNA表達(dá)，在20周齡時(shí)，模型組比正常組增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，觀察組與正常組、模型組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在24周齡時(shí)，模型組比正常組增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，觀察組與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比模型組明顯較少(P<0.01)；在28周齡時(shí)，模型組與觀察組比正常組均顯著增加(P<0.01)，而觀察組與模型組比較表達(dá)顯著增高(P<0.05)。

表1 20周齡各組小鼠目的基因mRNA表達(dá)情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

表2 24周齡各組小鼠目的基因mRNA表達(dá)情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

表3 28周齡各組小鼠目的基因mRNA表達(dá)情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

2.2 各組小鼠心臟組織中IRE1α、XBP1蛋白的表達(dá)情況 IRE1α蛋白表達(dá)，20周齡時(shí)，模型組和觀察組均比正常組顯著增加(P<0.05)，觀察組比模型組減少(P<0.05)。24周齡、28周齡，模型組與正常組比較，均顯著增加(P<0.01)，觀察組比模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。XBP1蛋白表達(dá)，20周齡時(shí)，模型組比正常組顯著增加(P<0.01)，觀察組與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；24周齡、28周齡時(shí)，模型組比正常組顯著增加(P<0.01)，觀察組比模型組顯著增加(P<0.01)，但與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 20周齡、24周齡、28周齡各組小鼠目的基因mRNA表達(dá)情況

圖2 20周齡、24周齡、28周齡各組小鼠目的蛋白表達(dá)情況

3 討論

T2DM是一種由多種原因引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂綜合征，這種代謝的紊亂可引起心肌細(xì)胞的能量代謝障礙，最終導(dǎo)致心臟功能和結(jié)構(gòu)的異常。KKAy小鼠是一種理想的人類T2DM動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過高脂飼料喂養(yǎng)后，KKAy小鼠的血糖會(huì)持續(xù)維持較高水平，表明了該動(dòng)物模型的穩(wěn)定性。

糖尿病心肌病變于1974年由Hamby等首先提出，其作為糖尿病的一種獨(dú)特的心臟并發(fā)癥目前已得到公認(rèn)，其主要病理改變?yōu)樾募〖?xì)胞肥大、凋亡、壞死，肌絲纖維大量丟失，心肌細(xì)胞外間質(zhì)有不溶性膠原蛋白積聚和纖維化。代謝出現(xiàn)異常、左室增厚、細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生變化、心肌微血管的病變、氧化應(yīng)激反應(yīng)、形成胰島素抵抗、發(fā)生細(xì)胞凋亡均是重要的促進(jìn)因素，皆參與到了糖尿病心肌病變的發(fā)生、發(fā)展過程。研究顯示，ERS參與了糖尿病心臟病變的發(fā)生發(fā)展過程[10-12]，并且起著非常關(guān)鍵的作用。ERS主要效應(yīng)通路有IRE1通路、PERK通路、ATF6通路3條[13]，其中涉及到的因子更是繁多，共同調(diào)控ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。IRE1α是一種轉(zhuǎn)膜蛋白，未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚刺激IRE1α跨膜域寡聚化及位于細(xì)胞質(zhì)的C-端效應(yīng)域自身磷酸化?；罨腎RE1α在哺乳動(dòng)物中可以剪切XBP1的mRNA，IRE1α通過降解自身RNA對(duì)其自身表達(dá)也有調(diào)節(jié)作用。生理狀態(tài)下，XBP1蛋白與非折疊蛋白及ERAD基因的促進(jìn)子結(jié)合促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，具有保護(hù)細(xì)胞，避免凋亡的作用?；罨腎RE1通過非常規(guī)的剪接形式，切除非剪接型XBP1(XBP1U)上26個(gè)核苷酸使之轉(zhuǎn)化成剪接型XBPl(XBPlS)。XBPlS是XBP1的活性形式，它可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與未折疊蛋白反應(yīng)元件(Unfolded Protein Response Element，UPRE)相結(jié)合，激活大量目的基因表達(dá)[14-15]。有報(bào)道稱，許多基因是XBP1的目標(biāo)基因，它們的表達(dá)是通過細(xì)胞依賴方式或是條件依賴方式來調(diào)控的。這些目標(biāo)基因包括一系列與DNA損傷、修復(fù)有關(guān)(如氧化還原動(dòng)態(tài)平衡、氧化應(yīng)激反應(yīng))的基因。有研究發(fā)現(xiàn)，通過使XBP1發(fā)生高表達(dá)[16-17]，證實(shí)XBP1的下游基因大多為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體系統(tǒng)組成部分、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解系統(tǒng)(ER Associated Degralotion，ERAD)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶。有研究發(fā)現(xiàn)，染色體上XBP1的結(jié)合位點(diǎn)有407個(gè)，相關(guān)目的基因有545個(gè)，其中大量基因與UPR目的基因相關(guān)[18]，因此說明XBP1對(duì)恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能和維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊動(dòng)態(tài)平衡非常重要。

本研究Real Time PCR檢測(cè)中擴(kuò)增曲線與溶解曲線顯示，各個(gè)目標(biāo)基因都進(jìn)行了正常轉(zhuǎn)錄，Real Time PCR檢測(cè)各目標(biāo)基因的RQ值統(tǒng)計(jì)分析顯示，IRE1α，20周時(shí)，模型組比正常組顯著增加，觀察組比正常組有所增加，但比模型組減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；24周和28周趨勢(shì)與20周一致，只是28周觀察組與正常組比較，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。XBP1S和IRE1α不同，它是ERS激發(fā)后繼而活化的因子，它們的mRNA的表達(dá)在20周時(shí)，觀察組與正常組和模型組基本無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明藥物在早期對(duì)ERS后續(xù)因子的抑制作用不明顯。早期主要是作用于IRE1α，從而抑制ERS的發(fā)展。當(dāng)24周和28周時(shí)，觀察組基因表達(dá)量相比模型組有了顯著減少，說明藥物對(duì)XBP1S也起到了很好的抑制作用，從而抑制了ERS，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。XBP1U是XBP1S的前體形式，被IRE1α剪切之后形成XBP1S，當(dāng)ERS發(fā)生激烈時(shí)，XBP1U大量轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也大量被剪切，所以基本與正常組水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但當(dāng)IRE1α受到藥物的抑制作用時(shí)，被剪切的前體就會(huì)減少，所以，觀察組的XBP1U就會(huì)增多，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)也顯示如此。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各目標(biāo)基因的蛋白表達(dá)量與PCR結(jié)果完全吻合，mRNA表達(dá)量增多/減少，蛋白的表達(dá)量也是增多/減少。

據(jù)以上討論分析，本實(shí)驗(yàn)用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)在糖尿病心臟病變過程中，發(fā)生了心肌細(xì)胞的凋亡，該凋亡過程與ERS的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。黃芪注射液與葛根素注射液聯(lián)用可能通過抑制ERS從而抑制心肌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而減緩糖尿病心臟病變的發(fā)展。

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EffectsofHuangqiInjectionCombinedwithPuerarinInjectiononKKAyMicewithDiabeticCardiomyopathyonEndoplasmicReticulumStress

Zhang Shujing, Wang Qian, Li Shuyu, Zhao Fujian, Wang Yanfei, Gao Yushan, Li Yixuan, Zhang Da

(SchoolofChineseMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To investigate the cardioprotective mechanism of Huangqi injection combined with puerarin injection on KKAy mice with diabetic cardiomyopathy, providing experimental evidence for the treatment of diabetic cardiomyopathy using traditional Chinese medicine. Methods KKAy mice were randomly divided into model group and treatment group (Huangqi injection combined with puerarin injection) according to blood glucose. The male C57BL/6J mice with same age were used as normal control group. The mice were sacrificed at 20, 24 and 28 weeks old, respectively. qRT-PCR was used for detecting the mRNA expression of IRE1α, XBP1U and XBP1S and Western blotting was used for assaying the expression of IRE1α and XBP1.ResultsThe mRNA and protein expression of IRE1α in the model group increased at 20, 24 and 28 weeks, while the increase of mRNA and protein expression of IRE1α reduced in the treatment group at 20, 24 and 28 weeks. The difference was statistically significant (P<0.05). The mRNA and protein expression of XBP1S at 20, 24 and 28 weeks and the mRNA expression of XBP1U at 28 weeks was increased in the model group; For the treatment group, the mRNA expression of XBP1S at 20 and 40 weeks and protein expression of XBP1 was down-regulated, whereas the expression of XBP1S and XBP1U mRNA increased. The difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionHuangqi injection combined with puerarin injection could inhibit the expression of IRE1α and XBP1, two stress signaling molecules of endoplasmic reticulum in the heart tissue of KKAy mice, and reduce the endoplasmic reticulum stress and exert cardioprotective effect on KKAy mice with type 2 diabetes.

Huangqi injection; Puerarin injection; Diabetic cardiomyopathy; Endoplasmic reticulum stress

R228

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.048

北京市高校教師青年英才計(jì)劃項(xiàng)目(YETP0794)

張淑靜(1984.09—),女,碩士,實(shí)驗(yàn)師，E-mail：zhangshujing@bucm.edu.com

李姝玉(1978.07—)，女，博士，副教授，研究方向:中醫(yī)藥對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的防治研究,E-mail：lishuyu0716@163.com

(2017-08-31收稿 責(zé)任編輯：徐穎)