何 亞，劉曉穎，鄧慶華，鄭小紅，蔣紅艷，蘇湲淇，彭 蘭

(1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院麻醉科 401120；2.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校 400030)

低溫復(fù)合丙泊酚對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡蛋白表達(dá)及超微結(jié)構(gòu)變化的影響*

何 亞1，劉曉穎2△，鄧慶華2，鄭小紅2，蔣紅艷2，蘇湲淇2，彭 蘭2

(1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院麻醉科 401120；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 400030)

目的觀察低溫復(fù)合丙泊酚對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡蛋白Caspase-3、自噬相關(guān)蛋白Beclin 1 和LC3-Ⅱ及其神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化的影響，探討丙泊酚對低溫所致大鼠海馬神經(jīng)元自噬與凋亡的干預(yù)作用。方法將大鼠分為空白對照組(A組)、低溫丙泊酚組(B組)和低溫水合氯醛組(C組)，B、C兩組低溫干預(yù)30 min，各組進(jìn)行心臟灌注，斷頭取腦，制備大鼠海馬神經(jīng)元組織標(biāo)本，用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測Caspase-3的表達(dá)，用Western blot檢測Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)，透射電鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果3組Caspase-3、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；透射電鏡結(jié)果顯示B、C組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元均有不同程度的改變，尤其是C組神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯。結(jié)論低溫狀態(tài)下海馬神經(jīng)元仍有一定的自噬與凋亡現(xiàn)象，而丙泊酚則可減少這種損害，具有較好的神經(jīng)元保護(hù)作用。

低溫；異丙酚；海馬;神經(jīng)元；細(xì)胞凋亡

國內(nèi)外大量研究都把低溫當(dāng)做一種器官保護(hù)措施，因其可通過降低機(jī)體基礎(chǔ)代謝率，減少心臟做功，減少腦組織的耗氧量,增加細(xì)胞對缺氧的耐受力，從而保護(hù)大腦及其他基礎(chǔ)代謝率較高的器官免受缺血缺氧的損害[1]。丙泊酚作為一種靜脈全身麻醉藥，已廣泛應(yīng)用于臨床各科的手術(shù)麻醉，其腦保護(hù)作用也得到越來越多的研究證實(shí)[2]。然而卻很少有研究注意到低溫同時帶來的不良反應(yīng)，包括細(xì)胞的自噬與凋亡及在全身低溫狀態(tài)下丙泊酚對大腦神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡的干預(yù)。本研究通過建立大鼠丙泊酚和水合氯醛全身麻醉的亞低溫模型，檢測海馬神經(jīng)元Caspase-3、Beclin-1 和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)及透射電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，探討丙泊酚對低溫所致大鼠海馬神經(jīng)元自噬與凋亡的干預(yù)作用,以便使低溫和丙泊酚在臨床上得到更好的應(yīng)用，提高疾病治愈率。

1 材料與方法

1.1材料 丙泊酚(西安力邦制藥有限公司，產(chǎn)品批號1107292)；10%水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司，產(chǎn)品批號20141001)。一抗Caspase-3、二抗(Daro公司)，一抗Beclin-1、LC3(Abcam公司)，內(nèi)參GAPDH一抗、HRP二抗(Western Biotechnology公司)；DAB顯色試劑盒(Sigma公司)；玻璃勻漿器(寧波新芝DY89-1)、分光光度儀(上海欣茂UV-7504)、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置(上海天能)、電泳儀(北京君意JY300C)、透射電子顯微鏡(第三軍醫(yī)大學(xué)生物測試分析中心)。

1.2方法

1.2.1大鼠全身低溫模型制作 2個月齡SD健康雄性大鼠60只，清潔級，體質(zhì)量150～200 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供。大鼠共分為3組(n=20)，即空白對照組(A組)、低溫丙泊酚麻醉組(B組)和低溫水合氯醛麻醉組(C組)。其中每組15只大鼠用于測定海馬神經(jīng)元Caspase-3、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)，其余5只大鼠用于觀察海馬神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。A組大鼠普通實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng),不進(jìn)行特殊處理，B組和C組分別用丙泊酚(150 mg/kg)和10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射，然后均采用冰袋使大鼠肛溫在32 ℃保持30 min[3]。低溫過程中用微量注射泵以16 mL·kg-1·h-1的速度腹腔注射平衡鹽液，并觀察大鼠生理機(jī)能狀況。

A:A組；B：B組； C：C組

圖1 3組海馬神經(jīng)元Caspase-3的表達(dá)

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測Caspase-3蛋白的表達(dá) 各組大鼠觀察24 h后分別進(jìn)行水合氯醛腹腔麻醉開胸，暴露心臟經(jīng)心尖將自制的灌注針插入主動脈，右心耳剪一小切口，依次用生理鹽水250 mL，4 ℃ 4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液250 mL通過主動脈灌注固定。斷頭取腦[4]，將固定6 h后的海馬組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋制作成石蠟塊，將石蠟組織塊進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測Caspase-3。按說明書操作，DAB顯色，光鏡高倍鏡視野連續(xù)計(jì)數(shù)200個神經(jīng)元，陽性產(chǎn)物為棕黃色或棕褐色，背景為藍(lán)色。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定陽性細(xì)胞的平均光密度值(average optical density,AOD)，用AOD半定量Caspase-3蛋白的表達(dá)，AOD越大，表示Caspase-3表達(dá)越強(qiáng)。反之表達(dá)越弱。計(jì)算出3個視野的AOD的平均值，代表該組神經(jīng)元的AOD值。

1.2.3蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá) 取海馬組織于無菌的EP管中，用Western blot及IP細(xì)胞裂解液(含1%的PMSF)浸泡，提取組織蛋白質(zhì)樣品，電泳轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，分別加入兔抗LC3單克隆抗體(1∶300)，兔抗Beclin-1多克隆抗體(1∶1 000),內(nèi)參一抗的稀釋終濃度為1∶3 000，然后4 ℃孵育過夜。洗膜后用封閉液將HRP二抗稀釋(1∶5 000)，然后溫育(37 ℃) 1.5 h，加ECL試劑，X射線膠片顯像，掃描。應(yīng)用Image J分析軟件分析目的條帶和內(nèi)參的灰度值，以目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度比值對Beclin-1、LC3-Ⅱ進(jìn)度半定量分析。

1.3大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察 各組隨機(jī)選擇5只大鼠，取小塊海馬組織快速用PBS沖洗組織周圍的血液等污物后立刻放入2.5%的戊二醛固定液；2～3 min后修整樣品為1 mm3，并放入新鮮的3%戊二醛固定液。按常規(guī)透射電鏡樣品制備方法漂洗、鋨酸固定、漂洗、脫水、浸透、Spon812包埋，上機(jī)、拍照。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)元Caspase-3及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) A組極少見到caspase-3陽性顆粒,與A組比較,B、C組則可見神經(jīng)元細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色或棕褐色顆粒。C組Capase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白水平高于A、B組，B組各蛋白水平高于A組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、2，表1。

圖2 3組海馬神經(jīng)元Western blot 結(jié)果

A:A組;B:B組;C：C組

圖3 3組海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化

2.2各組大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化 A組大鼠海馬神經(jīng)元多為圓形，結(jié)構(gòu)正常，核圓，核仁居中，細(xì)胞膜完整，各種細(xì)胞器豐富，排列整齊無水腫(圖3A);B組超微結(jié)構(gòu)損傷較輕，神經(jīng)元可見輕度破壞，核固縮，細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化(圖3B)。 C組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯,可見細(xì)胞皺縮、核固縮、核內(nèi)染色質(zhì)分布欠均勻，核仁消失，細(xì)胞質(zhì)濃縮,細(xì)胞核裂解，產(chǎn)生凋亡小體(圖3C)。

表1 3組海馬神經(jīng)元Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ 蛋白表達(dá)比較

a:P<0.05，b：P<0.01，與A組比較；c：P<0.05，與B組比較；*：AOD值；#：相對灰度值

3 討 論

細(xì)胞凋亡是受各種基因調(diào)控的程序化死亡過程，而激活后的Caspase-3是細(xì)胞凋亡的特征性標(biāo)志之一,為凋亡途徑的最終執(zhí)行者。自噬現(xiàn)象是一種高度保守的細(xì)胞行為[5]，在維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝和細(xì)胞器的更新方面起著非常重要的作用。但過度激活的自噬則可導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，從而引起一系列疾病。因此檢測凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)及透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的變化，可以探索低溫下海馬神經(jīng)元自噬與凋亡的發(fā)生情況。

丙泊酚是短效靜脈麻醉藥，廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)麻醉和維持重癥監(jiān)護(hù)中患者的鎮(zhèn)靜，丙泊酚的神經(jīng)保護(hù)功能在許多體內(nèi)外研究模型中已得到證實(shí)[6-7]。本實(shí)驗(yàn)采用丙泊酚和水合氯醛作為誘導(dǎo)全身低溫時的全身麻醉藥，比較兩組大鼠低溫后海馬神經(jīng)元凋亡蛋白、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)和神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化的差異，求證丙泊酚對低溫所致大鼠海馬神經(jīng)元自噬與凋亡的干預(yù)作用。

實(shí)驗(yàn)中B、C兩組Caspase-3和Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性表達(dá)均高于A組，其神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的損害也較A組重，這表明低溫下海馬神經(jīng)元仍然存在一定的自噬與凋亡現(xiàn)象，這種變化有可能是低溫手術(shù)產(chǎn)生不良反應(yīng)的病理基礎(chǔ)，還有研究發(fā)現(xiàn)低溫對心肌缺血的改善并不明顯，還可導(dǎo)致外周血管痙攣，增加外周血管阻力，使周圍循環(huán)灌注降低[8],外周組織細(xì)胞缺血、缺氧及營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，這些不僅導(dǎo)致酸性物質(zhì)增加，也可能造成自噬與凋亡的發(fā)生。故利用低溫進(jìn)行缺血、缺氧性腦病[9]的治療時，其給神經(jīng)細(xì)胞帶來的損傷作用也不可忽視。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，C組Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)強(qiáng)于B組，其神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的損害也較B組重，透射電鏡還發(fā)現(xiàn)C組海馬神經(jīng)元有明顯的損害，可見凋亡小體形成。提示水合氯醛對海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡并無保護(hù)作用[10]。B組丙泊酚復(fù)合低溫后海馬神經(jīng)元的Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)與C組相比呈下調(diào)趨勢，表明自噬與凋亡程度減輕，神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷也輕，較好地表現(xiàn)出丙泊酚對低溫所致神經(jīng)元自噬與凋亡的干預(yù)作用，這可能因丙泊酚減少Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)拮抗神經(jīng)元凋亡所致，其機(jī)制與丙泊酚的抗自由基、抑制細(xì)胞內(nèi)的鈣超載[11]、抑制GABA再攝取[12]、拮抗Na+內(nèi)流、抑制經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)Ach和兒茶酚胺類的突觸傳遞、拮抗內(nèi)皮素等多個環(huán)節(jié)有關(guān)。當(dāng)然，低溫下出現(xiàn)的神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡現(xiàn)象是否為細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，還需對低溫持續(xù)時間、不同的藥物劑量、不同的時相對海馬神經(jīng)元自噬與凋亡的影響作進(jìn)一步研究，以便將低溫與丙泊酚合理應(yīng)用于臨床手術(shù)中，達(dá)到更好的腦保護(hù)效應(yīng)，減少全身低溫給術(shù)后帶來的不良反應(yīng),增加手術(shù)的成功率。

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Effectsoflowtemperaturecompoundpropofolonexpressionandultrastructuralchangesofhippocampalneuronsapoptosisproteininrats*

HeYa1,LiuXiaoying2△,DengQinghua2,ZhengXiaohong2,JiangHongyan2,SuYuanqi2,PengLan2

(1.DepartmentofAnesthesiology,thePeople′sHospitalinYubeiDistrictofChongqingcity,Chongqing401120,China;2.ChongqingMedicalandPharmaceuticalCollege,Chongqing400030,China)

ObjectiveTo observe the effect of low temperature compound propofol on the changes of apoptosis protein Caspase-3,autophagy-related proteins Beclin-1 and LC3-Ⅱ and thier changes of hippocampal neurons.MethodsThe rats were randomly divided into blank control group (Group A),propofol group at low temperature (Group B) and chloral hydrate group at low temperature (Group C),Group B and C were treated with low temperature for 30 min.Then,each group was subjected to cardiac perfusion and decapitated brain to prepare rat hippocampal neuronal tissue samples.The expression of Caspase-3 was detected by immunohistochemistry,Beclin-1 and LC3-Ⅱ protein was detected by immunoblotting.The ultrastructural changes of neurons were observed by transmission electron microscopy.ResultsThe expression of Caspase-3,Beclin-1 and LC3-Ⅱ protein in each group were statistically significant differences(P<0.05).The results of transmission electron microscopy showed that the neurons in group B and C were changed in different degrees,especially in group C neuronal apoptosis is obvious.ConclusionAutophagy and apoptosis in existence still exist in low temperature condition,while propofol can reduce this damage and have better protective effect on neurons.

hypothermia；propofol；hippocampal;neurons；apoptosis

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KJ112502)。

何亞(1980-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事麻醉學(xué)研究。△

，E-mail:liuxaoying@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.34.006

R641

A

1671-8348(2017)34-4774-03

2017-08-04

2017-09-12)