黃澄澄，唐成佳， 余天霧

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院:1.老年病科;2.肝膽外；3.普外科 402160)

HIF-2α及VEGF在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系

黃澄澄1，唐成佳2△， 余天霧3

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院:1.老年病科;2.肝膽外；3.普外科 402160)

目的探討HIF-2α及VEGF在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，HIF-2α及VEGF與臨床病理間的關(guān)系。方法免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)67例結(jié)直腸癌及癌旁組織中HIF-2α及VEGF蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果在結(jié)直腸癌組織中HIF-2α、VEGF的表達(dá)明顯高于癌旁組織； HIF-2α及VEGF的表達(dá)率隨著腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移逐漸增加；HIF-2α的表達(dá)率隨著腫瘤體積增大逐漸增加，而VEGF表達(dá)率與腫瘤體積大小無(wú)相關(guān)性；HIF-2α及VEGF表達(dá)率與患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位及腫瘤分化程度等無(wú)關(guān)。HIF-2α與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)； Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)HIF-2α表達(dá)與患者生存有關(guān)，即高表達(dá)患者預(yù)后差。結(jié)論HIF-2α參與了結(jié)直腸癌生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程，這一過(guò)程可能與調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)有關(guān)。

結(jié)直腸腫瘤；缺氧誘導(dǎo)因子2α；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A

結(jié)直腸癌作為消化道常見(jiàn)的實(shí)體腫瘤，其生長(zhǎng)迅速，可致腫瘤內(nèi)部慢性缺氧。缺氧誘導(dǎo)因子2α(hypoxia inducible factor 2α,HIF-2α)在腫瘤細(xì)胞的慢性缺氧適應(yīng)性方面起著重要作用。HIF-2α 的活性可能與血管生成的持續(xù)生成相關(guān)。HIF-2α可能通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)持續(xù)表達(dá)而維持血管生成[1]。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中HIF-2α及VEGF表達(dá)情況，并分析二者與臨床病理的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2009年6月至2010年9月期間重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院普外科行手術(shù)切除的，術(shù)后病理診斷為結(jié)直腸癌的標(biāo)本67例，全部病例術(shù)前均未接受放療和化療,均無(wú)炎癥性腸病病史，所有入組人員均被告知檢查目的，并簽署知情同意書。病理分型及分級(jí)按WHO分類標(biāo)準(zhǔn)，將高和中分化歸為分化較好的低級(jí)別組；將低分化、黏液腺癌和印戒細(xì)胞癌歸為分化較差的高級(jí)別組。其中男41例，女26例，平均年齡63.8歲。黏液腺癌22例，印戒細(xì)胞癌4例，低分化腺癌10例、高和中分化腺癌31例。分期按TNM標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期33例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。所有標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、包埋、切片。

1.2主要試劑 HIF-2α單克隆抗體及免疫組織化學(xué)試劑盒及顯色試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物有限公司，VEGF多克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)HIF-2α及VEGF表達(dá)情況 染色按試劑盒說(shuō)明書操作。以PBS液代替一抗作空白對(duì)照。切片脫蠟,pH 9.0乙二胺四乙酸(EDTA)加熱修復(fù)抗原,3%雙氧水37 ℃孵育15 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗，正常山羊血清封閉30 min，PBS沖洗，加HIF-2α及VEGF一抗(稀釋度均為1∶150)。4 ℃過(guò)夜；次日復(fù)溫，PBS沖洗，加生物素化二抗37 ℃孵育30 min,PBS沖洗，HRP標(biāo)記鏈酶卵白素37 ℃孵育30 min,加DAB顯微鏡下顯色,蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，碳酸鋰返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4結(jié)果判斷 HIF-2α及VEGF表達(dá)以細(xì)胞染色強(qiáng)度得分×細(xì)胞陽(yáng)性百分率得分進(jìn)行判定。無(wú)染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，深黃色3分；細(xì)胞陽(yáng)性率小于5%為0分，5%～<25%為1分，25%～<50%為2分，≥50%為3分。上述二項(xiàng)得分相乘，<3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。統(tǒng)計(jì)計(jì)算時(shí)，0～1分為陰性，其余均為陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)HIF-2α及VEGF表達(dá)情況 結(jié)直腸癌組織中HIF-2α主要為細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核表達(dá)。HIF-2α陽(yáng)性率腫瘤組織(62.7%)高于癌旁組織(13.4%)。VEGF主要為細(xì)胞質(zhì)表達(dá)(圖1)，VEGF陽(yáng)性率腫瘤組織(65.7%)高于癌旁組織(35.8%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 結(jié)直腸癌及癌旁組織中HIF-2α及VEGF 的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×200)

2.2HIF-2α及VEGF蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與患者臨床病理聯(lián)系 HIF-2α及VEGF的表達(dá)隨著結(jié)直腸癌TNM分期的增加逐漸增加，HIF-2α及VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率在Ⅲ～Ⅳ期組(75.8%、81.8%)高于Ⅰ～Ⅱ期組(50.0%、50.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03，P=0.01)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(75.0%、78.1%)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(51.4%、54.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.05，P=0.04)。HIF-2α陽(yáng)性表達(dá)率在腫瘤直徑大于或等于5 cm組(73.8%)高于小于5 cm組(44.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)。HIF-2α及VEGF表達(dá)率與患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位及腫瘤分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)，且VEGF表達(dá)率與腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.3結(jié)直腸癌中HIF-2α及VEGF相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)分析，HIF-2α及VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.352，P<0.05)。

2.4生存分析 對(duì)67例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行6年隨訪調(diào)查，其中失訪13例，進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，HIF-2α陽(yáng)性組及其陰性組的中位生存期分別為64.0、49.0個(gè)月，生存曲線顯示HIF-2α陽(yáng)性組的生存時(shí)間明顯低于HIF-2α陰性組(P=0.04)；VEGF陽(yáng)性組及其陰性組的中位生存期分別為49.0、54.0個(gè)月(圖2A)，而VEGF表達(dá)水平與患者生存時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性(P=0.18),見(jiàn)圖2B。

A：HIF-2α；B：VEGF

圖2 HIF-2α及VEGF的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的生存曲線表1 結(jié)直腸癌中HIF-2α及VEGF蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

結(jié)直腸癌作為常見(jiàn)的實(shí)體腫瘤，新陳代謝旺盛，瘤體生長(zhǎng)速度大于其內(nèi)新生血管的生長(zhǎng)速度，必然會(huì)導(dǎo)致其組織氧供不足，低氧誘導(dǎo)因子(HIF)是近年研究的熱點(diǎn)基因，HIF包括HIF-1、HIF-2、HIF-3，三者均由調(diào)節(jié)亞基α和結(jié)構(gòu)亞基β組成的異源二聚體。HIF-2α是HIF-2的功能性調(diào)節(jié)亞基，在慢性缺氧適應(yīng)性方面起著重要作用。

HIF-2α的調(diào)節(jié)途徑分為氧依賴及非氧依賴調(diào)節(jié)途徑；氧依賴調(diào)節(jié)途徑：常氧條件下，HIF-2α ODD結(jié)構(gòu)域特定的脯氨酰殘基Pro405和Pro531被脯氨酰羥化酶(prolylhydroxylases，PHD)羥化后，與腫瘤抑制蛋白pVHL結(jié)合并發(fā)生泛素化，并被26s蛋白酶體降解；非氧依賴調(diào)節(jié)途徑：在缺氧情況下，PHD活性降低，HIF-2α不能被羥化，影響其泛素化，從而不能被降解，HIF-2α聚集于細(xì)胞質(zhì)，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與HIF-β形成HIF異二聚體復(fù)合物，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[2-4]。促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的能量代謝、增殖、分化及血管生成[5]。而缺氧條件下，HIF-2α的降解主要通過(guò)SUMO化修飾(small ubiquitin-related modifier)進(jìn)行降解，負(fù)性調(diào)控HIF-2α的表達(dá)，SUMO化修飾的HIF-2α可經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解[6]。近年國(guó)內(nèi)外研究表明，HIF-2α與胃癌、乳腺癌、胰腺癌、腎癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-10]。Kourakis等[11]通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)腸癌中HIF-2α與BNP3，發(fā)現(xiàn)二者過(guò)表達(dá)均與局部浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Esteban等[12]發(fā)現(xiàn)，HIF-2α通過(guò)抑制E-cadherin的表達(dá)，使細(xì)胞間黏附減低促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。但也有人發(fā)現(xiàn)，HIF-2α在癌旁組織中表達(dá)明顯高于肝癌組織，且與包膜或門靜脈浸潤(rùn)無(wú)關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-2α在結(jié)直腸癌組織中主要為細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，且在結(jié)直腸癌組織中HIF-2α表達(dá)率明顯高于癌旁組織，HIF-2α陽(yáng)性表達(dá)率在Ⅲ～Ⅳ期組高于Ⅰ～Ⅱ期組，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示HIF-2α可能參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程，且HIF-2α表達(dá)還與腫瘤大小有關(guān)，大于或等于5 cm組HIF-2α表達(dá)率明顯高于小于5 cm組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可能與腫瘤內(nèi)部缺氧有關(guān)，快速生長(zhǎng)的實(shí)體瘤，瘤體內(nèi)部不能得到足夠的血供，導(dǎo)致供需氧失衡[14]，推測(cè)瘤體大小與其內(nèi)部缺氧程度相關(guān)。

VEGF是目前已知的最強(qiáng)的血管生成促進(jìn)因子，它與受體結(jié)合活化磷脂酶B，使細(xì)胞內(nèi)磷酸肌醇水平升高，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，利于血管生成，腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入血管和結(jié)締組織基質(zhì)中導(dǎo)致擴(kuò)散。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中VEGF表達(dá)明顯高于癌旁組織，VEGF陽(yáng)性表達(dá)率在Ⅲ～Ⅳ期組高于Ⅰ～Ⅱ期組，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

VEGF是HIF-2α重要的下游基因，HIF-2α不僅可以增加VEGF轉(zhuǎn)錄，還可增強(qiáng)其穩(wěn)定性，Xiong等[15]通過(guò)shRNA慢病毒載體敲除HeLa細(xì)胞HIF-2α表達(dá)發(fā)現(xiàn)COX-2及VEGF明顯下降，且在缺氧條件下，此作用更明顯。本研究相關(guān)性分析表明HIF-2α與VEGF成正相關(guān)，說(shuō)明HIF-2α可能通過(guò)促進(jìn)結(jié)腸癌組織中VEGF表達(dá)來(lái)增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移能力。經(jīng)長(zhǎng)期隨訪調(diào)查顯示，HIF-2α陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者的生存時(shí)間明顯低于HIF-2α陰性的結(jié)直腸癌患者，HIF-2α陽(yáng)性組的中位生存期明顯低于HIF-2α陰性組，提示HIF-2α的表達(dá)與患者的預(yù)后密切相關(guān)。而本研究中發(fā)現(xiàn)VEGF的表達(dá)與患者生存時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性，可能與樣本量較小有關(guān)。

綜上所述，檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中HIF-2α的表達(dá)情況對(duì)評(píng)估結(jié)直腸癌患者的預(yù)后及危險(xiǎn)程度提供參考。HIF-2α參與了結(jié)直腸癌生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程，這一過(guò)程可能與調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)有關(guān)。

[1]Koh MY,Lemos R,Liu X,et al.The hypoxia-associated factor switches cells from HIF-1α- to HIF-2α-dependent signaling promoting stem cell characteristics,aggressive tumor growth and invasion[J].Cancer Res，2011，71(11):4015-4027.

[2]Aragonés J,Fraisl P,Baes M,et al.Oxygen sensors at the crossroad of metabolism[J].Cell Metab,2009,9(1):11-22.

[3]胡瑛.缺氧誘導(dǎo)因子-1α、2α在惡性腫瘤中不同作用的研究進(jìn)展[J].癌癥進(jìn)展,2014,12(2):122-125.

[4]Bertout JA,Patel SA,Simon MC.The impact of O2availability on human cancer[J].Nat Rev Cancer,2008,8(12):967-975.

[5]Zhao J,Du F,Shen G,et al.The role of hypoxia-inducible factor-2 in digestive system cancers[J].Cell Death Dis,2015,6(1):e1600.

[6]van Hagen M,Overmeer RM,Abolvardi SS,et al.RNF4 and VHL regulate the proteasomal degradation of SUMO-conjugated Hypoxia-Inducible Factor-2alpha[J].Nucleic Acids Res,2010,38(6):1922-1931.

[7]Li N,Wang HX,Qin C,et al.Relationship between clinicopathological features and HIF-2α in gastric adenocarcinoma[J].Genet Mol Res,2015,14(1):1404-1413.

[8]Gilkes DM,Semenza GL.Role of hypoxia-inducible factors in breast cancer metastasis[J].Future Oncol,2013,9(11):1623-36.

[9]Wang M,Chen MY,Guo XJ,et al.Expression and significance of HIF-1α and HIF-2α in pancreatic cancer.[J] J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2015,35(6):874-879.

[10]Rankin EB,Biju MP,Liu Q,et al.Hypoxia-inducible factor-2 (HIF-2) regulates hepatic erythropoietin in vivo[J].J Clin Invest,2007,117(4):1068-1077.

[11]Kourakis MI,Giatromanolaki A,Polychronidis A,et al.Endogenous markers of hypoxia/anaerobic metabolism and anemia in primary colorectal cancer[J].Cancer Sci,2006,97(7):582-588.

[12]Esteban MA,Tran MG,Harten SK,et al.Regulation of E-cadherin expression by VHL and hypoxia-inducible factor[J].Cancer Res,2006,66(7):3567-3575.

[13]Yang SL,Liu LP,Jiang JX,et al.The correlation of expression levels of HIF-1α and HIF-2α in hepatocellular carcinoma with capsular invasion,portal vein tumor thrombi and patients′ clinical outcome[J].Jpn J Clin Oncol,2014,44(2):159-167.

[14]劉芳.缺氧微環(huán)境與實(shí)體瘤[J].現(xiàn)代診斷與治療,2007,18(1):36-39.

[15]Xiong J,Zhu FF,Nie MF.Hypoxia-inducible factor-2α (HIF-2α) mediates the effects of hypoxia on the promotion of HeLa cell viability,colony formation,and invasion capacity in vitro[J].Genet Mol Res,2015,14(2):3281-3292.

ExpressionofHIF-2αandVEGFincolorectalcanceranditsrelationshipwithprognosis

HuangChengcheng1,TangChengjia2△,YuTianwu2

(1.DepartmentofGeriatrics；2.DepartmentofHepatologicalSurgery;3.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theAffiliatedYongchuanHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China)

ObjectiveTo study the expression of HIF-2α and VEGF in colorectal cancer and to investigate the relationship between them and clinicopathologic parameter.MethodsImmunohistochemistry staining was conducted to detect the expression of HIF-2α and VEGF protein in 67 samples of colorectal tumor tissues and 67 samples of normal adjacent tissue.ResultsThe expression of HIF-2α and VEGF in colorectal cancer tissues was significantly higher than that in adjacent tissues.The expression of HIF-2α and VEGF increased with the clinical stage and lymph node metastasis.The expression of HIF-2α increased with the tumor volume.The expression of HIF-2α and VEGF was not related to the age,sex,tumor location and tumor differentiation of the patients.HIF-2α was positively correlated with VEGF expression.Kaplan-Meier survival analysis showed that HIF-2α expression was associated with survival,that is,the higher expression of HIF-2α the worse of prognosis was obtained.ConclusionHIF-2α is involved in the process of growth,invasion and metastasis of colorectal cancer.This process may be related to the regulation of VEGF expression.

colorectal neoplasms;hypoxia-inducible factor 2α;vascular endothelial growth factor A

黃澄澄(1986-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事消化系統(tǒng)疾病研究。△

，E-mail:285993446@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.34.015

R735

A

1671-8348(2017)34-4802-03

2017-08-01

2017-09-05)