李 迎, 崔曉霞, 杜小燕, 馬蘭芝, 尚世臣,黃 斌, 郭子瀟, 趙 權(quán), 李桂軍, 王冬平, 陳振文

(1. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心, 北京 100071; 2. 首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部,北京 100069; 3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

近交系CMU/1和CMU/2長爪沙鼠Willis環(huán)缺失與生理生化參數(shù)比較

李 迎1,3, 崔曉霞1, 杜小燕2, 馬蘭芝1, 尚世臣1,黃 斌1, 郭子瀟1, 趙 權(quán)3, 李桂軍1, 王冬平1, 陳振文2

(1. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心, 北京 100071; 2. 首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部,北京 100069; 3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

目的比較CMU/1和CMU/2近交系長爪沙鼠腦底動脈Willis環(huán)缺失比率，檢測血液生理生化指標(biāo)，分析比較二者差異，為其實驗應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。方法采用Beckman全自動生化分析儀(CX5)和日本光電全自動血細(xì)胞分析儀(MEK-7222K)對17項血液生化指標(biāo): 總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLD)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、尿酸(URIC)、總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LD)、肌酸激酶(CK)、淀粉酶(AMY)、鎂(Mg)以及葡萄糖(GLU)和22項血液生理指標(biāo): 白細(xì)胞(WBC)、淋巴細(xì)胞(LYM)、中性粒細(xì)胞(NEUT)、單核細(xì)胞(MON)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞(BAS)、淋巴細(xì)胞百分比(LYM%)、中性粒細(xì)胞百分比(NEUT%)、單核細(xì)胞百分比(MON%)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(EOS%)、嗜堿性粒細(xì)胞百分比(BAS%)、紅細(xì)胞(RBC)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)、血紅蛋白(HGB)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、血小板(PLT)、血小板壓積(PCT)、血小板平均體積(MPV)、血小板體積分布寬度(PDW)進(jìn)行測定。應(yīng)用SPSS23.0軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗的統(tǒng)計分析。結(jié)果CMU/1和CMU/2近交系長爪沙鼠腦底動脈Willis環(huán)缺失比例均為76%以上; 血液生理生化的12項指標(biāo): GLU、CRE、TG、CHOL、PLT、MPV、BAS、LYM%、PDW、HCT、MCV、MCH雌雄差異顯著; CMU/1和CMU/2雌性ALT、PLT、PDW差異顯著，雄性的HDLD、MCH差異顯著; 品系間3項指標(biāo)ALP、ALT、AST差異顯著。結(jié)論腦缺血模型長爪沙鼠近交系的基因型對血液生化和生理指標(biāo)有一定的影響。

長爪沙鼠; 近交系; 腦缺血模型; 血液生化指標(biāo); 血液生理指標(biāo)

長爪沙鼠腦底動脈Willis環(huán)前后交通支存在不同程度的缺失，因不能構(gòu)成完整的Willis動脈環(huán)而成為天然的腦缺血動物模型，在研究腦缺血和腦梗塞疾病治療方面是理想的動物模型而得到廣泛的應(yīng)用[1]。然而由于Willis環(huán)前后交通支類型較為復(fù)雜,使模型的穩(wěn)定性和均一性較差，因此定向培育長爪沙鼠腦缺血模型高發(fā)生率近交系十分必要。我國長爪沙鼠實驗動物化研究已有一些報道[2]，但近交系動物尚未見報道。前期通過腦缺血模型癥狀和腦底動脈缺失類型定向培育近交系長爪沙鼠, 目前已具有近交20代后的近交系動物2個支系, 分別命名為CMU/1(首都醫(yī)科大學(xué), Capital medical university首字母大寫)和 CMU/2，但有關(guān)2個近交系動物生物學(xué)特性指標(biāo)尚不完全清楚。本實驗針對2個支系的17項血液生化和22項血液生理指標(biāo)進(jìn)行測定, 分析CMU/1與CMU/2近交系動物雌雄之間和2個近交系動物之間的差異，為該近交系動物的生物學(xué)特性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為其特性研究和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3～4月齡CMU/1近交系長爪沙鼠77只(雌26，雄51)，CMU/2近交系長爪沙鼠44只(雌28，雄16)，F(xiàn)21～23代，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物自由采食和飲水, 室溫為20～24 ℃[SYXK(京)-2013-0005]。本實驗通過首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物和動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(No. AEEI-2017-032)

1.2 儀器設(shè)備及主要試劑

生化數(shù)據(jù)使用Beckman全自動生化分析儀(CX5 PRO)及配套試劑，Beckman公司(美國)提供生化各項指標(biāo)的配套試劑; 血細(xì)胞計數(shù)使用日本光電全自動血細(xì)胞分析儀(MEK-7222K)及配套試劑, 為上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司生產(chǎn)。血液離心使用日本Hitachi公司低溫離心機(jī)(CF16RX); 解剖顯微鏡購自日本奧林巴斯公司(BX51)。

1.3 方法

1.3.1 血液標(biāo)本采集和處理 實驗前沙鼠空腹12～24 h，自由飲水。眼眶靜脈取血，靜止30 min，5 000 r/min離心10 min制備血清，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的肝素抗凝，抗凝血備用。

1.3.2 CMU/1和CMU/2近交系沙鼠腦缺失觀察 取血處死，腦部解剖，通過解剖顯微鏡觀察沙鼠Willis動脈環(huán)缺失狀態(tài)。

1.3.3 測定指標(biāo) 血液生化指標(biāo)17項: 總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLD)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、尿酸(URIC)、總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LD)、肌酸激酶(CK)、淀粉酶(AMY)、鎂(Mg)以及葡萄糖(GLU)。

血液生理指標(biāo)22項: 白細(xì)胞(WBC)、淋巴細(xì)胞(LYM)、中性粒細(xì)胞(NEUT)、單核細(xì)胞(MON)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞(BAS)、淋巴細(xì)胞百分比(L Y M%)、中性粒細(xì)胞百分比(NEUT%)、單核細(xì)胞百分比(MON%)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(E O S%)、嗜堿性粒細(xì)胞百分比(BAS%)、紅細(xì)胞(RBC)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)、血紅蛋白(HGB)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、血小板(PLT)、血小板壓積(PCT)、血小板平均體積(MPV)、血小板體積分布寬度(PDW)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，使用獨立樣本t檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CMU/1和CMU/2近交系環(huán)缺失情況

通過腦解剖, 顯微鏡下觀察Willis動脈環(huán)前交通支細(xì)小或缺失, 左缺失、右缺失和雙側(cè)缺失及細(xì)小等現(xiàn)象統(tǒng)計為缺失, 否則為完整。結(jié)果表明, CMU/1 Willis環(huán)缺失為76.62%(59/77)，CMU/2為77.27%(34/44)。

2.2 血液生化檢測

CMU/1近交系沙鼠的GLU、CRE指標(biāo)雌雄差異顯著(P＜0.05)，TG差異極顯著(P＜0.01); CMU/2近交系沙鼠的CHOL指標(biāo)雌雄差異顯著(P＜0.05)。CMU/1與CMU/2近交系沙鼠雌性的ALT指標(biāo)差異顯著(P＜0.05), 雄性的HDLD指標(biāo)差異顯著(P＜0.05)。CMU/1和CMU/2近交系沙鼠之間的ALP、ALT、AST指標(biāo)差異顯著(P＜0.05)其余均無顯著性差異(P＞0.05)(表 1)。

2.3 血液生理檢測

CMU/1近交系沙鼠的PLT、MPV、BAS、LYM%指標(biāo)雌雄差異顯著(P＜0.05)， PDW差異極顯著(P＜0.01); CMU/2近交系沙鼠的HCT、MCV、MCH指標(biāo)雌雄差異顯著(P＜0.05)。 CMU/1與CMU/2近交系沙鼠雌性的PLT、PDW指標(biāo)差異顯著(P＜0.05),雄性的MCH指標(biāo)差異顯著(P＜0.05)，其余均無顯著性差異(P＞0.05)(表 2)。

表 1 CMU/1和CMU/2近交系沙鼠的血液生化指標(biāo)Table 1 Blood biochemical parameters in CMU/1 and CMU/2 inbred strains

3 討論

血液各項成分的相對穩(wěn)定是生命活動正常進(jìn)行的基本條件。實驗動物血液生化和生理參數(shù)主要是動物自身的遺傳因素與環(huán)境因素決定。遺傳因素是決定實驗動物血液生理參數(shù)的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ), 而環(huán)境因素則是決定血液生理參數(shù)變化的外在條件[3]。正常的血液生理生化指標(biāo)在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中是重要的指標(biāo), 是病理學(xué)、毒理學(xué)等研究的重要參考依據(jù)[4]。

表 2 CMU/1和CMU/2近交系沙鼠的血液生理指標(biāo)Table 2 Blood physiological parameters in CMU/1 and CMU/2 inbred strains

長爪沙鼠由于腦底動脈Willis環(huán)的前后交通支變異缺失類型復(fù)雜，當(dāng)行單側(cè)或雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎時，其典型腦缺血模型發(fā)生率較低，卻模型癥狀不均一。作者前期研究表明，長爪沙鼠腦底動脈Willis環(huán)的前后交通支缺失是腦缺血模型發(fā)生的基礎(chǔ)，只有當(dāng)后交通支缺失伴隨前交通支細(xì)小或缺失時，模型癥狀才顯著。本實驗結(jié)果表明CMU/1和CMU/2近交系沙鼠Willis動脈環(huán)后交通支缺失100%，前交通支細(xì)小或缺失均為76%以上; 而文獻(xiàn)報道長爪沙鼠腦底動脈Wilis環(huán)的缺失發(fā)生率僅有30%～40%[5]，說明定向培育近交系可增加Willis環(huán)的前后交通支缺失比率，這也為腦缺血模型研究提供了新的近交品系。

動物的血液生理生化指標(biāo)與遺傳基因差異有關(guān)，CMU/1和CMU/2是在近交系的培育過程中分化出的2個支系，經(jīng)遺傳檢測顯示有些遺傳基因位點2個品系有多態(tài)性，說明該2個近交系的生理生化指標(biāo)可能也會存在差異。本實驗結(jié)果也證實了這一點。CMU/1近交系沙鼠的血液生化和生理指標(biāo)結(jié)果雌雄之間GLU、CRE、PLT、MPV、BAS、LYM%差異顯著, TG、PDW差異極顯著，CMU/2近交系沙鼠雌雄之間CHOL、HCT、MCV、MCH差異顯著; 相同性別比較，雌性CMU/1與CMU/2近交系沙鼠的ALT、PLT、PDW指標(biāo)差異顯著，雄性間比較HDLD、MCH指標(biāo)差異顯著。CMU/1和CMU/2近交系沙鼠的血液生化和生理指標(biāo)結(jié)果中ALP、ALT、AST差異顯著, 而其余指標(biāo)均無顯著性差異。王鉅等[2]對長爪沙鼠33項血液生理生化指標(biāo)正常參考值進(jìn)行研究, GLU、CRE、TG、CHOL、ALP、PLT、LYM%雌雄比較差異顯著, 與本文結(jié)果一致; CK、URIC、LD、RBC、HGB、MCHC、NEUT、WBC差異顯著，本文結(jié)果差異不顯著，這可能與沙鼠進(jìn)行近交20代后，遺傳基因穩(wěn)定性有關(guān)。戴麗軍等[4]研究結(jié)果表明雌雄間HCT、MCH差異顯著，與本文結(jié)果一致。研究過程PLT與報道長爪沙鼠比較升高很多，使得PCT、MPV雄性測定結(jié)果超出儀器范圍[2,4]。上述分析結(jié)果表明:CMU/1和CMU/2近交系沙鼠的基因型不同影響酶代謝，動物的年齡、性別、飼養(yǎng)環(huán)境及動物遺傳基因型等因素對血液生化和生理指標(biāo)有一定的影響。

本研究結(jié)果為腦缺血模型長爪沙鼠近交系沙鼠的生物學(xué)特性積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 為腦缺血模型長爪沙鼠近交系在醫(yī)學(xué)生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1] Malek M, Duszczyk M, Zyszkowski M, et al. Hyperbaric oxygen and hyperbaric air treatment result in comparable neuronal death reduction and improved behavioral outcome after transient forebrain ischemia in the gerbil[J]. Exp Brain Res, 2013, 224(1):1-14.

[2] 王鉅, 盧靜, 陳振文, 等. 長爪沙鼠血液生理生化正常參考值的研究[J]. 中國實驗動物學(xué)報, 2004, 12(2):108-111.

[3] 孫靖. 實驗動物學(xué)基礎(chǔ)[M]. 北京: 北京科學(xué)技術(shù)出版社,2005:60.

[4] 戴麗軍, 肖慶忠, 梁成結(jié), 等. 不同性別長爪沙鼠血液生理生化值的比較[J]. 廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2003, 31(2):63-65.

[5] Kuchinka J, Nowak E, Szczurkowski A, et al. Arteries supplying the base of the brain in the Mongolian gerbil(Meriones unguiculatus)[J]. Vet Sci, 2008, 11(4):295-299.

Comparison on Circle of Willis Patterns, Biochemical and Physiological Characteristics of Inbred CMU/1 and CMU/2 Gerbils

LI Ying1,3, CUI Xiao-xia1, DU Xiao-yan2, MA Lan-zhi1, SHANG Shi-chen1, HUANG Bin1,GUO Zi-xiao1, ZHAO Quan3, LI Gui-jun1, WANG Dong-ping1, CHEN Zhen-wen2
(1. Laboratory Animal Center, Military Medical Sciences, Military Academy,Beijing 100071, China; 2. Department of Laboratory Animal Science,Capital Medical University, Beijing 100069, China; 3. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

ObjectiveTo compare the ratio of the incomplete circle of Willis patterns and detect the blood biochemical and physiological indexes of 2 ischemia-prone inbred gerbil lines CMU/1 and CMU/2,and to analyze the differences between 2 strains, provide reference data for gerbils experimental application.MethodsBeckman automatic biochemical analyzer (CX5) and Japan photoelectric automatic blood cell analyzer (MEK-7222K) were used to determine 17 blood biochemical parameters and 22 physiological parameters. SPSS 23.0 software was used for statistical analysis by independent samples T test.ResultsThe ratios of incomplete circle of Willis patterns in both ischemia-prone inbred gerbil lines CMU/1 and CMU/2 were more than 76%. The 12 parameters of blood physiology and biochemistry,glucose, creatinine, triglycerides, cholesterol, platelet, mean platelet volume, basophilic granulocyte,lymphocyte%, platelet distribution width, hematocrit, mean corpuscular volume, mean Corpuscular hemoglobin, were significantly different between male and female. CMU/1 and CMU/2 were significantly different in female alanine transaminase, platelet and platelet distribution width, and high-density lipoprotein cholesterol and mean corpuscular hemoglobin in males were significantly different. There were significant differences in alkaline phosphatase, alanine transaminase and aspartate transaminase between strains.ConclusionThe genotypes of ischemia-prone inbred gerbil have some impact on blood biochemical and physiological parameters.

Gerbil; Inbred strain; Ischemia model; Biochemical index; Physiological index

Q95-33

A

1674-5817(2017)06-0470-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.06.009

2017-08-10

國家科技支撐計劃課題(2015BAI09B01-04)

李 迎(1993-), 女, 碩士, 研究方向: 實驗動物生物學(xué)特性研究。E-mail: 651998038@qq.com

王冬平(1964-), 女, 副研究員, 研究方向: 實驗動物生物學(xué)特性研究。E-mail: Wangdp6493@126.com陳振文(1959-), 男, 教授, 研究方向: 實驗動物遺傳學(xué)。E-mail: czwen@ccmu.edu.cn